Efeitos dos polissacarídeos de Cordyceps na Senescência Renal induzida pela D-Galactose,

Resumo

Um modelo de senescência foi estabelecido em camundongos e células HK-2 usando D-galactose. Os efeitos dos polissacarídeos de Cordyceps (CCP) no envelhecimento renal foram avaliados usando western blotting e imunofluorescência, com alterações mitocondriais avaliadas por detecção de espécies reativas de oxigênio e coloração com JC-1.

Resumo

A doença renal crônica (DRC) representa uma preocupação significativa de saúde global. O envelhecimento das células epiteliais tubulares renais (RTECs) prejudica a regeneração e reparação renal e promove a progressão da DRC por meio da liberação do fenótipo secretor associado à senescência (SASP). Cordyceps sinensis, cujos principais constituintes bioativos incluem Cordyceps polissacarídeos (CCP), está incorporado em múltiplas preparações clínicas para DRC e demonstrou benefícios terapêuticos. Para examinar o papel da CCP no envelhecimento renal, foi estabelecido um modelo de senescência renal induzida por D-galactose em camundongos, com a CCP administrada como intervenção. Os desfechos do tratamento foram avaliados usando coloração relacionada à senescência e avaliações da função renal. Um modelo de envelhecimento induzido por D-galactose em células HK-2 foi ainda estabelecido para investigar mecanismos celulares subjacentes. A coloração com JC-1 e a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) foram usadas para avaliar alterações mitocondriais após o tratamento com CCP em condições senescentes. Imunofluorescência, western blotting e PCR quantitativa (RT-PCR) foram realizados para avaliar os efeitos do CCP na fosforilação do MAPK, na translocação nuclear do NF-κB e na ativação do inflamassoma do NLRP3. Os resultados mostram que a CCP atenua a senescência das células tubulointersticiais, lesão renal e fibrose, ao mesmo tempo em que melhora a função mitocondrial tanto em modelos celulares quanto animais de senescência induzida por D-galactose. Esses efeitos estão associados à modulação da via de sinalização ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3.

Introdução

A doença renal crônica (DRC) é um dos distúrbios renais mais comuns e afeta uma grande população no mundo todo. Sua ocorrência está intimamente associada ao^{envelhecimento 1}. Os túbulos renais são as unidades funcionais primárias do rim, e a senescência celular dentro das células epiteliais tubulares renais (RTECs) é um dos principais contribuintes para o declínio funcional^{renal 2}. A exposição a medicamentos e outros fatores de estresse podem induzir senescência associada ao estresse tubular, levando à perda progressiva da função renal e, eventualmente, à progressão para doença renal terminal (DSC). Portanto, direcionar a senescência nos RTECs pode ser uma estratégia eficaz para atrasar o envelhecimento renal e prevenir ou tratar a DRC.

A inflamação crônica é uma marca do envelhecimento^{de 3} anos e um importante fator de muitas doenças relacionadas à idade. Citocinas pró-inflamatórias liberadas pelas células senescentes são coletivamente conhecidas como fenótipo secretor associado à senescência (SASP⁾⁴. O SASP promove inflamação sustentada, induz senescência nas células vizinhas e contribui para o declínio funcional^{progressivo 5}. O modelo de senescência induzida por D-galactose (D-gal) é um dos modelos experimentais de envelhecimento mais amplamente utilizados. Estudos anteriores mostraram que o tratamento com D-gal leva ao acúmulo intracelular de espécies reativas de oxigênio (ROS), disfunção mitocondrial, perturbação da homeostase redox e indução de senescência celular^{relacionada ao estresse 6}. Comparado aos modelos naturais de envelhecimento, que são demorados e apresentam alta variabilidade interindividual, o modelo induzido pela D-galactose oferece vantagens como simplicidade, indução rápida e variabilidade intra-grupo relativamente baixa. Esse modelo é aplicável tanto a estudos in vivo quanto in vitro. Embora não recapitule totalmente o envelhecimento natural lento e sem patologias, é bem adequado para modelar a senescência renal, dada a alta atividade metabólica do rim e a suscetibilidade ao estresse oxidativo. De uma perspectiva mecanicista, a D-galactose promove a senescência celular principalmente por meio do estresse oxidativo, consistente com investigações focadas na geração de ROS e disfunção mitocondrial durante o envelhecimento.

Cordyceps sinensis é um fungo medicinal tradicional chinês amplamente utilizado no tratamento de doenças relacionadas aos^{rins 7}. Ele contém múltiplos componentes bioativos, incluindo polissacarídeos, adenosina, aminoácidos, cordicepina e ergosterol. Extratos e preparações fermentadas de Cordyceps sinensis apresentam propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e anti-envelhecimento 8,9,10,11. Por exemplo, foi demonstrado que polissacarídeos de Cordyceps reduzem a infiltração inflamatória em um modelo de camundongo para asma ao inibir a via de sinalização TGF-β1/Smad¹². Além disso, polissacarídeos de Cordyceps podem suprimir a fosforilação das vias MAPK e reduzir a expressão de citocinas inflamatórias como IL-6 e IL-1β nas células^{RAW264.7 13}. Estudos anteriores demonstraram que Cordyceps polissacarídeos (CCP), o principal componente bioativo do Cordyceps sinensis, podem atenuar a senescência nas células epiteliais tubulares renais ao regular a autofagia e suprimir a produção de SASP. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais o CCP neutraliza danos mediados por ROS permanecem incompletamente caracterizados.

O presente estudo investiga os efeitos protetores do CCP contra o envelhecimento renal em camundongos e examina seus efeitos sobre inflamação, estresse oxidativo e senescência, utilizando um modelo induzido por D-galactose do envelhecimento celular tubular renal do epitelio. Exploramos ainda se a CCP modula a produção de ROS, a função mitocondrial e as vias de sinalização a jusante, incluindo a fosforilação do MAPK, a translocação nuclear de NF-κB e a ativação do inflamassoma NLRP3. Juntos, este trabalho visa fornecer evidências experimentais que apoiem o uso do CCP em estudos sobre senescência renal e lesão renal relacionada à idade. O fluxo de trabalho experimental geral e o mecanismo proposto estão resumidos na Figura 1.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing (Aprovação Ética nº 202108A006). Todo o lixo gerado durante os procedimentos de cultivo celular e coloração foi coletado em recipientes lacrados e sacos de risco biológico e descartado por um serviço licenciado de gestão de resíduos médicos.

Modelos animais e intervenções terapêuticas

Para minimizar a variação interindividual, 40 camundongos foram aleatoriamente distribuídos em cinco grupos (n = 8 por grupo) e submetidos às seguintes intervenções: (1) Grupo controle: Receberam administração intragástrica de 0,2 mL de soro salino por camundongo; (2) Grupo modelo: Recebeu injeções subcutâneas diárias de D-galactose (250 mg/kg), administradas como 0,2 mL de uma solução de 25 mg/mL por camundongo; (3) Grupo CCP de baixa dose: Recebeu injeções de D-galactose combinadas com administração intragástrica de CCP a 50 mg/kg (0,2 mL de uma solução de 5 mg/mL por camundongo); (4) Grupo CCP de alta dose: Recebeu injeções de D-galactose combinadas com administração intragástrica de CCP a 100 mg/kg (0,2 mL de uma solução de 10 mg/mL por camundongo); (5) Grupo vitamina E: Recebeu injeções de D-galactose combinadas com administração intragástrica de vitamina E a 100 mg/kg (0,2 mL de uma solução de 10 mg/mL por camundongo). Após 8 semanas de tratamento, os camundongos foram eutanasiados, e amostras de soro, urina e tecido renal foram coletadas para análises subsequentes.

Análise da função renal

A função renal foi avaliada usando kits comerciais de ensaio para medir creatinina, ácido úrico e proteínas urinárias conforme as instruções do fabricante. Os valores de absorção foram medidos em 505 nm para creatinina, 510 nm para ácido úrico e 585 nm para proteína urinária usando um leitor de microplacas multifuncionais.

Coloração em seção de tecido

Os tecidos renais embutidos em parafina foram seccionados com espessura de 4 μm. As seções foram desparafinizadas, incubadas com hematoxilina por 5 minutos, enxaguadas com água corrente, diferenciadas usando álcool ácido a 1% por 5 segundos e enxaguadas novamente. Após uma lavagem de 1 minuto com soro tampão fosfatado (PBS), as seções foram contra-tingidas com eosina por 3 minutos, desidratadas e montadas. Para a coloração tricromática de Masson, as seções foram desparafinizadas e coradas com hematoxilina conforme descrito acima, seguidas por Ponceau S por 5 minutos e azul de anilina por 5 minutos. Seções foram então desidratadas e montadas.

Ensaio de viabilidade celular

As células HK-2 foram semeadas em placas de 12 poços a 1 × 10⁵ células por poço. Após 24 horas de exposição a D-galactose e polissacarídeos de Cordyceps, solução de 10% de CCK-8 foi adicionada a cada^{poço 14}. Após a incubação a 37 °C por 30 minutos, a absorção foi registrada em 450 nm usando um leitor de microplaca. Documentação de controle de qualidade para polissacarídeos de Cordyceps e autenticação STR de células HK-2 são fornecidas no Arquivo Suplementar 1.

Reação em cadeia quantitativa da polimerase por transcrição reversa

Após 24 horas de cultura celular, o meio de cultivo era removido e o RNA total era extraído usando o reagente de extração. A concentração de RNA foi determinada usando um espectrofotômetro de microplaca, e a integridade do RNA foi verificada por eletroforese em gel de agarose de 2%. O DNA genômico foi removido e o cDNA foi sintetizado por transcrição reversa. As sequências de espoletas estão listadas na Tabela de Materiais.

Medição dos níveis intracelulares de ROS

As células HK-2 foram semeadas em placas de 12 poços a 1 × 10⁵ células por poço. Ao atingir 60-70% de confluência, as células passaram por pré-tratamento com D-galactose por 12 horas. Após 24 horas de exposição ao medicamento, o meio foi descartado e as células foram enxaguadas uma vez com PBS. ROS intracelular foi detectada por incubação com uma sonda fluorescente sensível a ROS a 37 °C por 20 minutos, e imagens de fluorescência foram capturadas em comprimentos de onda de excitação/emissão de 488/525^{nm 15}.

Western blot

Proteínas celulares foram lisadas usando tampão RIPA e clarificadas por centrifugação a 13.000 × g por 15 minutos a 4 °C. As proteínas foram desnaturadas por fervura por 10 minutos, e quantidades iguais de proteína (20 μg por amostra) foram submetidas à separação eletroforética e transferidas para as membranas do PVDF. Após bloqueio por 1 hora, as membranas foram incubadas durante a noite com anticorpos primários. Lavagens subsequentes de PBST foram seguidas por incubação com anticorpos secundários conjugados com HRP, e a detecção foi realizada usando um substrato de quimioluminescência (ECL)^{aprimorada (ECL) 16}. Detalhes de anticorpos e identificadores de reagentes estão listados na Tabela de Materiais.

Coloração por senescência SA-β-gal

As células HK-2 foram placadas em placas de 12 poços com uma densidade de 1 × 10⁵ células por poço. Quando as células atingiram 60-70% de confluência, foram pré-tratadas com D-galactose por 12 horas. A coloração de SA-β-gal foi realizada conforme o protocolo do fabricante, e as células coradas foram observadas usando um microscópio^{óptico 17}.

Medição do potencial da membrana mitocondrial

O potencial da membrana mitocondrial foi avaliado usando a sonda fluorescente JC-1, de acordo com as instruções do fornecedor. Monômeros de JC-1 foram detectados em comprimentos de onda de excitação/emissão de 490/530 nm, enquanto agregados de JC-1 foram detectados em 525/590 nm. Imagens foram adquiridas quando sinais claros de fluorescência vermelha ou verde foram observados.

Análise estatística

Os dados eram apresentados como gráficos de barras ou pontos e analisados usando o software referenciado. As intensidades das bandas western blot foram quantificadas usando o ImageJ. Os dados foram analisados por análise de variância (ANOVA) com testes t subsequentes para comparações entre grupos. A significância estatística foi definida como um valor P < 0,05. Símbolos indicam comparações com o grupo controle (*) ou com o grupo D-gal (#) (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).

Resultados

A D-galactose foi usada para estabelecer um modelo de senescência de camundongos, com a vitamina E servindo como um controle positivo anti-senescência comumente utilizado. Camundongos senescentes foram tratados com diferentes doses de polissacarídeos de Cordyceps (CCP). Camundongos idosos apresentaram insuficiência renal significativa, evidenciada pelo aumento das proteínas urinárias, ácido úrico sérico e níveis de creatinina (Figura 2B-D). ...

Discussão

Este estudo demonstra os efeitos protetores dos polissacarídeos de Cordyceps sobre as células epiteliais tubulares renais e fornece evidências de que eles atenuam a senescência inflamatória nas células HK-2 ao modular a via de sinalização ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3. Esses achados esclarecem ainda mais os potenciais mecanismos subjacentes aos efeitos dos compostos derivados do Cordyceps sinensis no tratamento de doenças renais agudas e crônicas e oferec...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Casepase1/PAb do Coelho Cortado	WL03450	Wanlei, Shengyang, China
CCK-8 Kit	C0037	Biyotime, Xangai, China
PCC	B21296	Yuanye Bio, Shengyang, China
Kit de Teste de Creatinina	C011-2-1	Jiancheng, Nanjing, China
D-gal	HY-N0210	MCE, EUA
ERK Rabbit pAb	4695	CST, EUA	AB_390779
gapdh Rabbit pAb	AC033	Abclonal, Wuhan, China
H & Kit de coloração E	G1120	Solarbio, Pequim, China
JC-1 Kit	C2003S	Biyotime, Xangai, China
Kit de tingimento da Masson	G1340	Solarbio, Pequim, China
NLRP3 Rabbit pAb	WLH3383	Wanlei, Shengyang, China
P21 Coelho pAb	64016s	CST, EUA	AB_2892063
p38 PAb coelho	9212	CST, EUA	AB_330713
p50 Rabbit pAb	3035	CST, EUA	AB_330564
p65 PAb coelho	8242	CST, EUA	AB_10859369
p-ERK Coelho pAb	4370	CST, EUA	AB_2315112
Fosfo-SAPK/JNK mAnticorpo	4668	CST, EUA	AB_823588
p-p38 Coelho pAb	4511	CST, EUA	AB_2139682
Kit de Tingimento ROS	S0033S	Biyotime, Xangai, China
Anticorpo SAPK/JNK	9256	CST, EUA	AB_2250373
SA-β-gal Kit	C0602	Biyotime, Xangai, China
Kit de Teste de Ácido Úrico	C012-2-1	Jiancheng, Nanjing, China
Kit de Detecção de Proteínas Urinárias	C035-2-1	Jiancheng, Nanjing, China
Vitamina E	S27812	Yuanye Bio, Shengyang, China
Primer para PCR
Nome do gene	Introdução para Frente	Primer Reverso
Caspase-1	5'-TACAGACAAGGGTGCTGAACAA-3'	5'-CGGAATAACGGAGTCAATCAAA-3'
GAPDH	5'-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3'	5'-AAAGGTGGAGGAGTGTGTGTCG-3'
NLRP3	5'-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3'	5'-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3'