Uma plataforma de ponto de atendimento para detecção simultânea de PCR triplex de infecções por chikungunya, dengue e vírus Zika

Resumo

Este artigo recomenda um sistema integrado totalmente automatizado que emprega tecnologia tripla de PCR para diagnosticar simultaneamente as co-infecções do vírus Chikungunya, Dengue e Zika usando uma única amostra, otimizando assim a eficiência dos testes em laboratórios clínicos e de atenção primária.

Resumo

A febre Chikungunya (CHIKF), uma doença viral aguda transmitida por mosquitos e descoberta pela primeira vez na Tanzânia em 1952, tem apresentado disseminação intermitente na China, com aumento dos surtos locais. Em julho de 2025, a província de Guangdong, atualmente o centro do surto, havia registrado 4.824 casos locais, incluindo quase 3.000 novas infecções em apenas uma semana. Esse aumento rápido cria uma necessidade urgente por tecnologias avançadas de diagnóstico. Essas ferramentas são fundamentais para apoiar os esforços de contenção na linha de frente. Propomos uma solução para a rápida detecção simultânea de infecções por dengue (DENV), chikungunya (CHIKV) e vírus Zika (ZIKV), a fim de aprimorar as capacidades precoces de prevenção e controle da epidemia. Essa abordagem envolve o desenvolvimento de protocolos de teste personalizados para postos de controle de fronteira e instalações de saúde primária.

Métodos diagnósticos tradicionais para CHIKV e DENV frequentemente carecem de sensibilidade/especificidade em casos de coinfecção. Como CHIKV, DENV e ZIKV compartilham padrões e sintomas de transmissão semelhantes, o monitoramento simultâneo é crucial. Este protocolo apresenta um método triplex qPCR usando sondas TaqMan para detectar esses arbovírus em um único tubo em até 90 minutos. Comparado à cultura viral e testes sorológicos, esse método melhora a eficiência ao identificar infecções ativas e coinfecções com alta especificidade, ao mesmo tempo em que simplifica o fluxo de trabalho e elimina requisitos especializados de equipamentos.

A validação com amostras clínicas e de Avaliação de Qualidade Externa (EQA) confirmou 100% de concordância com ensaios singleplex de padrão ouro. Esse método serve como uma ferramenta eficaz para monitorar doenças febris em regiões endêmicas, especialmente em ambientes com recursos limitados, onde a contenção rápida de surtos é crítica.

Introdução

A febre Chikungunya (CHIKF) é uma doença arboviral cada vez mais prevalente, transmitida principalmente pelos mosquitos vetores Aedes aegypti e Aedes albopictus. Caracterizada por surtos recorrentes em regiões tropicais, essa doença se manifesta clinicamente como uma doença febril aguda, frequentemente acompanhada de dores articulares intensas e artrite^{persistente 1}. Em 26 de julho, o total acumulado de casos de chikungunya confirmados em laboratório na cidade de Foshan havia alcançado 4.824, com impressionantes 87,2% desses casos ocorrendo no distrito de Shunde. Essa concentração geográfica pronunciada impõe um ônus substancial à infraestrutura regional de saúde pública e resulta em custos significativos de saúde, além de desafios macroeconômicos mais^{amplos 2}.

No contexto da circulação cada vez mais sobreposta dos vírus CHIKV, DEV e ZIKV, as metodologias diagnósticas atuais enfrentam três limitações principais. Primeiro, ensaios sorológicos não conseguem distinguir infecções agudas devido à persistência prolongada dos anticorpos após a eliminação^{viral 1}. Segundo, as técnicas de cultura viral apresentam taxas de sensibilidade baixas e exigem vários dias, dificultando assim a tomada de decisão clínica em tempo hábil. Terceiro, embora ensaios quantitativos de PCR demonstrem alta especificidade (acima de 95%), eles não conseguem detectar coinfecções em uma única reação, o que é uma desvantagem significativa considerando a taxa relatada de 12,8% de co-infecção por CHIKV-DENV na^{Índia 3}. O monitoramento filogenético indica uma mudança de paradigma. A linhagem ECSA, que foi dominante durante a epidemia de 2019-2022 na Índia, adquiriu mutações convergentes em suas proteínas do envelope: E1-A226V (aumentando a infectividade dos mosquitos) e E2-K252Q (associada à evasão imune). Essas mutações resultaram em um genótipo com virulência maior documentada, conforme relatado em estudos recentes de vigilância de Kerala e^{Maharashtra 3}. Simultaneamente, a China enfrenta desafios devido à importação do genótipo ECSA, como documentado no surto de Yunnan, e a outros genótipos, com transmissão autóctone relatada em várias províncias, incluindo^{Yunnan 4}.

Essas realidades criam necessidades urgentes e com recursos limitados para (i) diagnóstico diferencial apesar das manifestações clínicas^{sobrepostas 5}, (ii) ensaios diagnósticos que eliminam a complexidade da instrumentação tipicamente exigida pela PCR quantitativa em tempo real convencional (qPCR^)6, e (iii) validação abrangente de novas tecnologias de ponto de atendimento, incluindo métodos baseados em RT-LAMP^{e CRISPR 5}. Para enfrentar esses desafios diagnósticos, propomos um ensaio rápido de tripla PCR que utiliza um sistema integrado totalmente automatizado, permitindo a detecção simultânea de CHIKV, DENV e ZIKV em uma única reação. Validamos o desempenho do nosso ensaio qPCR triplex por meio de comparação direta com os ensaios^{singleplex estabelecidos 5}, que serviram como padrão de referência. As seções seguintes detalham os procedimentos tanto para o ensaio triplex quanto para os ensaios singleplex de referência. A análise comparativa dos resultados de ambos os métodos é apresentada na seção de Resultados Representativos.

Protocolo

Este estudo segue as diretrizes éticas estabelecidas pelo Comitê de Ética do Hospital Popular Provincial de Guangdong, Universidade Médica do Sul, Guangzhou, China (aprovação nº: KY2025-510-01). Informações detalhadas sobre os materiais utilizados nesta pesquisa (reagentes, produtos químicos, equipamentos e software) podem ser encontradas na Tabela de Materiais.

1. Seleção de participantes

1. Escolha participantes na faixa etária de 18 a 60 anos.
2. Escolha participantes que apresentam doença febril aguda (testosterona axilar ≥ 38 °C) dentro de 12 dias após o início dos sintomas, além de erupção cutânea, artralgia ou linfadenopatia cervical, e viagens recentes para áreas endêmicas de chikungunya; ou indivíduos assintomáticos com histórico de viagem idêntico.
3. Exclusão: uso de antimicrobianos/antivirais em até 7 dias ou doença febril atribuível ao HIV confirmado ou malignidade.

2. Coleta e processamento de amostras

1. Verifique se a embalagem externa da caixa de amostragem não está danificada e não expirou, e então remova os materiais internos.
2. Posicione o sujeito com o braço estendido. Identifique a veia cubital mediana, aplique um torniquete e desinfete o local da vena punção com um cotonete de álcool a 70%.
3. Colete 1~3 mL de sangue da veia antecubital do sujeito usando um tubo de coleta de sangue sem anticoagulantes.
4. Inverta suavemente o tubo 5-8 vezes e deixe ele coagular em temperatura ambiente por 30 minutos.
5. Centrifuge a amostra de sangue a 4 °C, 1000 x g em uma centrífuga, por 10 minutos. A amostra de soro obtida após a centrifugação pode ser testada imediatamente.
6. Cuidadosamente aliquota o soro sobrenadante em tubos microcentrífugas estéreis. Use o soro imediatamente para testes, ou armazene as aliquotas a -80 °C até análise adicional dos ácidos nucleicos do patógeno via qPCR.

3. Detecção Automatizada de QPCR Triplex de CHIKV, DAV e ZIKV

1. Preparação de reagentes e tubos
   1. Retire todos os reagentes necessários do armazenamento e descongele-os em temperatura ambiente.
   2. Inspecione visualmente cada tubo de detecção de TD selado para danos ou falhas de vedação. Descarte quaisquer tubos comprometidos.
   3. Faça um vórtice breve no tampão de extração de ácido nucleico TD por 5 s para garantir homogeneidade.
   4. Dispense assépticamente 500 μL do tampão homogeneizado em um tubo de reagente de extração TD (contendo esferas magnéticas liofilizadas roxas).
   5. Faça vórtice vigorosamente na mistura por 30 s até que todos os componentes estejam totalmente dissolvidos e as esferas estejam completamente ressuspensas.
   6. Transfira toda a solução reconstituída para um tubo de detecção TD pré-rotulado.
2. Carregamento de amostras
   1. Pipete 200 μL de soro claro, não hemolizado e não lipêmico no tubo preparado de detecção de TD.
   2. Sele o tubo bem e inverta-o dez vezes para misturar de forma homogênea.
      NOTA: Durante a inversão, permita que a camada de parafina flutue brevemente dentro do tubo. Isso é uma parte normal do processo.
3. Operação de instrumentos e aquisição de dados
   1. Insira os tubos de detecção selados nos slots designados do analisador.
   2. Na interface da tela sensível ao toque, insira as informações de identificação da amostra.
   3. PressioneS Tart Detection para iniciar o fluxo de trabalho totalmente automatizado e de tubo fechado.
      NOTA: O sistema realizará automaticamente varredura de códigos de barras, extração de ácidos nucleicos via captura magnética de esferas e amplificação por PCR por fluorescência sem intervenção adicional do usuário. O programa padrão inclui uma etapa de desnaturação a 95 °C por 3 minutos, seguida por 40 ciclos de amplificação.
4. Interpretação do resultado
   1. Ao concluir a execução, observe os resultados da amplificação para os três alvos (CHIKV, DENV, ZIKV) e o controle interno na mesma tela.
   2. Registre a leitura gerada automaticamente, "Positivo", "Negativo" ou "Inválido", para cada patógeno-alvo em seu respectivo canal de fluorescência.
      NOTA: O software interno do sistema utiliza um limiar de ciclo (Ct) de 37,0 para interpretação automática. Não é necessária análise manual de dados.

4. Referência aos ensaios Singleplex qPCR para comparação de métodos

1. Preparação de reagentes de extração de ácidos nucleicos
   1. Tire a placa pré-embalada de 96 poços do kit. Toque suavemente a placa de 96 poços para que os reagentes e esferas magnéticas se concentrem no fundo da placa de 96 poços. Retire cuidadosamente o filme de vedação com papel alumínio, evitando vibrações na placa de 96 poços para evitar que líquido escape para fora.
   2. Nas colunas 1 e 7 de uma placa de 96 poços, 20 μL de proteinase K são adicionados primeiro, seguidos por 200~300 μL da amostra a ser extraída.
   3. Extração Automatizada de Ácidos Nucleicos (Método Baseado em Esferas Magnéticas)
      1. Placas pré-embaladas de 96 poços (com amostras) são colocadas nos slots correspondentes do sistema automatizado de extração de ácidos nucleicos.
      2. O processo de extração de ácidos nucleicos é o seguinte: Adsorve as esferas magnéticas ligadas ao ácido nucleico usando uma haste magnética dentro da câmara de laboratório. Transfira o complexo de esferas para o próximo furo designado para o reagente. Ative o dispositivo de mexer para misturar o líquido cuidadosamente com as esferas magnéticas por meio de uma agitação rápida e repetida. Permita que o extrator automático de ácidos nucleicos realize automaticamente as etapas seguintes: i) Lisagem celular: 10 min a 25 °C. ii) Adsorção de Ácidos Nucleicos: 15 min a 70 °C, com adsorção magnética realizada 3 vezes. iii) Lavagem: Misture por 2 minutos (repetido 3 vezes), seguido de adsorção magnética duas vezes (15 s cada). iv) Elução: Realizar duas vezes (5 minutos cada), com adsorção magnética realizada 3 vezes. Eventualmente, obtém ácidos nucleicos de alta pureza.
   4. Para detecção imediata, aspire diretamente o eluato contendo ácido nucleico das colunas 6 e 12. Para armazenamento a longo prazo, transfira as amostras restantes de ácido nucleico para -20°C.
2. Preparação de reagentes de amplificação
   NOTA: Para uma reação de PCR Singleplex, prepare três tubos de PCR separados usando três enzimas diferentes e três misturas de reação correspondentes. Complete a preparação do reagente em três etapas separadas. Como as etapas de preparação são semelhantes, demonstraremos apenas as etapas de preparação para o reagente de detecção CHIKV abaixo.
   1. Remova a solução de amplificação de ácidos nucleicos e a solução de reação CHIKV (espolves/espolvas específicas para CHIKV) do kit. Após o descongelamento, coloque-os em um ambiente a 22~25 °C, misture bem com uma agitação vigorosa e depois realize uma breve centrifugação (1000 x g, 15 s, 22~25 °C).
   2. Calcule o número total de reações como N + 2 (onde N = número de amostras de teste, +2 = uma negativa e uma positiva no controle de qualidade). Prepare a mistura mestre em um tubo microcentrífuga de tamanho adequado combinando o seguinte para cada reação: Solução de Amplificação de Ácido Nucleico de 17 μL (contendo tampão, dNTPs, DNA polimerase, enzima UDG), Solução de Reação CHIKV de 3 μL (contendo primers, sondas para genes-alvo do CHIKV e IC). Vortexe o Master Mix cuidadosamente para garantir a mixagem completa. Centrifuge brevemente o tubo a 10.000 x g por 15 s em temperatura ambiente (22~25 °C) para coletar a solução no fundo. Dispense 20 μL da Master Mix em cada tubo de reação PCR.
   3. Adicionar amostras de ácido nucleico e controle de qualidade: Nos tubos de reação PCR preparados acima (20 μL), adicione respectivamente 5 μL de ácido nucleico de amostras testadas, controle positivo e controle negativo, alcançando um volume final de 25 μL por tubo; Aperte firmemente os tubos e realize a centrifugação instantânea (1000 x g, 15 s, 22 ~25 °C) e então coloque os tubos no instrumento de PCR.
3. Amplificação por PCR
   1. Defina o programa de ciclagem da seguinte forma: Pré-desnaturação: 50 °C por 15 minutos, depois a 95 °C por 15 minutos (ambos os passos juntos constituem 1 ciclo); os seguintes 2 passos para 40 ciclos: desnaturação a 94 °C por 15 s e recozimento a 55 °C por 45 s.
   2. Defina os parâmetros de detecção do sinal de fluorescência da seguinte forma: Marcagem fluorescente FAM dos genes CHIKV; Marcagem fluorescente VIC do gene IC usada como controle interno do kit. Colete dados a 55 °C. Após a conclusão da reação, certifique-se de que os dados sejam salvos para análises futuras.
   3. Analisar dados usando software específico para qPCR
      1. Informações da amostra: No diagrama de layout da placa do poço do software, rotule os tipos de amostra (por exemplo, controle positivo, controle negativo, amostra desconhecida, gene de referência interno, etc.) correspondentes às posições de carga da amostra.
      2. Posicionamento dos tubos de reação: Abra a tampa do módulo de aquecimento do instrumento, coloque a placa/tubos de PCR selados firmemente dentro, certifique-se de que se encaixem bem com o módulo de aquecimento e feche a tampa do módulo firmemente (para evitar irregularidades de temperatura)
      3. Iniciar a reação: Após confirmar que as configurações do programa no software estão corretas, clique em Iniciar Execução e registre o ID do experimento para referência futura.
      4. Parar a corrida e remover tubos: Após o programa concluir, espere até que a temperatura do módulo de aquecimento caia abaixo de 50 °C. Depois, abra a tampa e remova cuidadosamente a placa ou tubos de PCR. Prossiga com a análise a jusante ou armazenamento de amostras conforme necessário.
      5. Análise de Dados Antes de prosseguir com a análise, confirme que: i) As curvas de amplificação para todas as amostras e o controle interno são caracteristicamente em formato de S; ii) O limiar de fluorescência é definido dentro da fase exponencial, resultando em valores de Ct ≤ 38 ciclos (CV < 5%); iii) Os resultados do controle são válidos, indicando que não há contaminação. Se alguma condição não for atendida ou se uma amostra apresentar amplificação anormal (por exemplo, uma curva atípica ou uma CT de faixa crítica), verifique novamente todo o lote ou a amostra específica conforme corresponda.
      6. Processar os dados brutos com o software para determinar os valores de Ct, usando o limiar auto-selecionado; uma amostra é considerada positiva se Ct < 38 e sua curva de amplificação apresentar uma forma sigmoidal.

5. Biossegurança e descarte de resíduos

1. Transfira todos os materiais para um recipiente designado, resistente a perfurações, e descontamine por autoclave antes da descarte final pelo sistema institucional de resíduos médicos. Transfira imediatamente esses materiais para um recipiente biohazard à prova de vazamentos e perfuração, rotulado para resíduos de alto risco. Seguindo as diretrizes institucionais, descontamine todos os resíduos contendo produtos amplificados por autoclavagem (por exemplo, 121 °C por 30 minutos) para inativar patógenos e degradar ácidos nucleicos. Por fim, descarte os resíduos esterilizados por meio do sistema designado de gestão de resíduos médicos.
   NOTA: Realize todas as etapas de acordo com as práticas de Biossegurança Nível 2 (BSL-2), utilizando equipamentos de proteção individual adequados para minimizar os riscos de exposição.

Resultados

Para validar a estabilidade e precisão do sistema de detecção tripla de PCR, selecionamos cinco amostras clinicamente representativas do nosso laboratório interno e dez amostras externas cegas de EQA para verificação. Essas cinco amostras clínicas representativas incluem casos negativos e positivos (S1-S5), incluindo amostras positivas para CHIKV e DENV, selecionadas para demonstrar a aplicabilidade clínica do ensaio e apoiar a validação interna do desempenho dos testes (Tabela 1). O painel de amostras c...

Discussão

CHIKV é um vírus de RNA de fita simples e de sentido positivo, classificado dentro do gênero alfavírus da família^{Togaviridae 7}. O aquecimento global acelerado, o comércio internacional intensificado e a expansão das redes turísticas aumentaram coletivamente o risco de exposição humana a ameaças^{arbovirais 8}. Na última década, a rápida evolução do diagnóstico molecular transformou fundamentalmente o cenário do manejo de doenças infecciosas. E...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Extrator automatizado de ácidos nucleicos	DAAN	Smart 32	Para extração de DNA
BECKMAN X-12	BECKMAN	ALA04H01	For  centrifugação sérica
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Gabinete de biossegurança
Centrífuga elétrica	WEALTEC		Centrifuge o líquido residual da parede do tubo
Analisador médico de PCR totalmente automático	Bioustar‌	UP0102	Amplificação quantitativa por PCR fluorescente
Kit de detecção de ácidos nucleicos para o vírus chikungunya (método de sonda fluorescente por PCR)	DAAN	20250804	Detecção de  Genes do vírus chikungunya
Kit de detecção de ácidos nucleicos para o vírus da dengue (método de sonda PCR-fluorescente)	DAAN	202504003	Detecção de  Genes do vírus da dengue
Kit de detecção de ácidos nucleicos para vírus da Dengue, vírus Zika e vírus chikungunya (método de sonda fluorescente por PCR)	Bioustar‌	20250724	Detecção de  Vírus da dengue, vírus Zika e vírus chikungunya genes
Kit de detecção de ácidos nucleicos para o vírus Zika (método de sonda fluorescente por PCR)	DAAN	202508041	Detecção do vírus Zika   Genes
Kit de extração de ácidos nucleicos	DAAN		Extrair ácido nucleico
SLAN Sistema de análise médica PCR totalmente automático	HONGSHI		Análise de Dados
Máquina de PCR em tempo real SLAN-96S	HONGSHI	SLAN-96S	Amplificação quantitativa por PCR fluorescente
Freezers de ultrabaixa temperatura (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 & deg; C para armazenar reagentes
Vortex-5	Kylin-bell		Para reagente de mistura