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Isolamento de Células Epiteliais Alveolares Tipo II de Pulmões Neonatais, Juvenis e Adultos Múrios Adaptáveis a Ambientes Experimentais Infecciosos

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DOI:

10.3791/69581

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19 de dezembro de 2025

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1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta um método baseado em citometria de fluxo para isolar células epiteliais alveolares tipo II (AECII) viáveis de pulmões neonatais, juvenis ou adultos de muros (infectados ou não infectados). Essa abordagem permite que estudos moleculares e/ou funcionais posteriores do AECII identifiquem seus papéis durante a inflamação e infecção pulmonar.

Resumo

As células epiteliais alveolares tipo II (AECII) contribuem criticamente para a regulação imune no pulmão e, portanto, são elementos-chave que orquestram a homeostase pulmonar. Essas funções tornam o AECII particularmente relevante no contexto de infecção por vírus respiratórios, que atacam o epitélio inferior das vias aéreas e prejudicam a integridade alveolar. Modelos pré-clínicos de camundongos são ferramentas vitais para elucidar os papéis do AECII no contexto da inflamação e/ou infecção pulmonar. Este protocolo apresenta um pipeline detalhado e reprodutível para isolar AECII viáveis e altamente purificados de pulmões murinos nos estágios neonatal, juvenil e adulto. A metodologia combina dissociação mecânica, digestão enzimática e subsequente filtragem celular ativada por fluorescência (FACS) para produzir populações altamente enriquecidas de AECII, comprovadamente adequadas para análises moleculares e funcionais posteriores. Para aplicações envolvendo vírus patogênicos, o protocolo inclui uma etapa opcional de fixação de paraformaldeído (PFA), permitindo manuseio seguro sob condições de biossegurança mais baixas sem comprometer a integridade do RNA. Com recuperação celular otimizada em todos os estágios do desenvolvimento, resultando em até 1,0 × 106 células AECII por pulmão adulto, este protocolo apoia estudos pré-clínicos, por exemplo, de patogênese viral, função epitelial e capacidade regenerativa.

Introdução

Devido aos seus papéis multifacetados no desenvolvimento pulmonar, fisiologia, imunidade e processos de reparo, as células epiteliais alveolares tipo II (AECII) contribuem vitalmente para a manutenção e também para o restabelecimento da homeostase após uma lesão pulmonar. Como os AECII são alvos celulares primários de vírus pandêmicos como o vírus da gripe A (IAV) ou SARS-CoV-2, seu destino e funções têm sido destaque na pesquisa em biologia da infecção. Nesse contexto, estudos anteriores relataram que pistas intrínsecas (por exemplo, statusgenético 1,idade 2,3) e extrínsecas (por exemplo, estímulosmicrobianos 4) têm um impacto significativo nos fenótipos AECII e sua resposta a gatilhos ambientais, como patógenos transmitidos pelo ar. Notavelmente, foi demonstrado que a inflamação pulmonar deixa alterações sustentadas no status transcriptômico, proteômico e epigenético doAECII 5,6. As complexas interações celulares do AECII dentro do pulmão, assim como a contribuição de vários fatores bióticos e abióticos para a biologia do AECII, destacam a importância de modelos in vivo adequados que permitam examinar essas células com mais detalhes.

O FACS representa a técnica padrão ouro atual para o enriquecimento e purificação de células primárias de tecidos humanos e animais, pois permite a implementação simultânea de seleção (ou exclusão) multiparamétrica e representa o único método no qual propriedades intrínsecas à célula, como tamanho, granularidade ou autofluorescência, podem ser integradas de forma confiável no fluxo de trabalho de seleção/exclusão. Até o momento, alguns protocolos publicados fornecem metodologias para isolamento baseado em FACS de AECII murinos primários. Sinha e Lowell relataram um método para isolamento de AECII em camundongos adultos que apresenta processamento de tecidos semelhantes e fluxo de trabalho de citometria de fluxo, incluindo enriquecimento de AECII antes do FACS por depleção magnética baseada em esferas em célulasnão-alvo 7. Outro protocolo descreve o uso de isolamento baseado em esferas magnéticas de células pulmonares EpCAM positivas ou o uso de camundongos transgênicos que permitiram o isolamento baseado em FACS do AECII com base na identificação de células SPC-positivas (GFP+) usando um modelo condicional de camundongorepórter 8. Embora a expressão do SPC identifique de forma confiável AECII em pulmões murinos, essa metodologia só é aplicável em combinação com uma cepa dedicada de repórteres de camundongos e, portanto, impede o isolamento de AECII, por exemplo, camundongos do tipo selvagem. Importante destacar que, embora rendimentos e pureza semelhantes do AECII tenham sido relatados, nenhum desses protocolos forneceu adaptações para o isolamento do AECII de hospedeiros neonatais, juvenis ou infectados.

Para isso, o presente protocolo inclui um conjunto de fluxos de trabalho adaptados para o isolamento de AECII altamente puros e viáveis de camundongos usando digestão enzimática em combinação com FACS. Essa metodologia de ponta baseia-se em um protocolo de isolamentoAECII 9 previamente desenvolvido em FACS e contém refinamentos importantes que melhoram a pureza do AECII por meio da adição de mais marcadores de identificação e exclusão. Importante destacar que este protocolo atualizado apresenta a recuperação AECII por meio de estratégias de ordenação "tocadas" e "não tocadas". Além disso, como o desenvolvimento pós-natal dos pulmões está associado a grandes mudanças na composição celular e reorganização estrutural, esse protocolo inclui adaptações para otimizar a recuperação do AECII em pulmões neonatais, juvenis e adultos. Isso permite examinar a biologia do AECII durante a ontogenia, por exemplo, no contexto de maturação pulmonar ou estudos de biologia de infecção. Essa abordagem pode ser usada para obter AECII viável para cultivo ex vivo subsequente e infecção por IAV. Além disso, esse protocolo inclui um procedimento de fixação usando o fixador químico paraformaldeído (PFA). Essa etapa justifica a inativação de vários patógenos respiratórios (por exemplo, SARS-CoV-2, IAV) em suspensões de células pulmonares, o que, por sua vez, permite o manuseio subsequente de amostras (incluindo isolamento AECII baseado em FACS) em instalações com menores precauções de biocontenção. Embora a fixação baseada em PFA impeça o cultivo subsequente ex vivo do AECII para estudos funcionais, ela permite a recuperação de quantidades significativas de RNA intacto para o perfil transcriptômico do AECII, a fim de elucidar seus papéis biológicos no contexto de infecções respiratórias.

Protocolo

Todos os animais foram criados e alojados na instalação animal do Centro Helmholtz de Pesquisa de Infecções sob condições específicas livres de patógenos (FPS) e de acordo com diretrizes nacionais e institucionais. A eutanásia de camundongos ingênuos para posterior isolamento do AECII foi realizada de acordo com as diretrizes nacionais da Sociedade de Ciências de Animais de Laboratório (GV-SOLAS, Gesellschaft für Versuchstierkunde). Foram usados camundongos machos com antecedentes genéticos C57BL/6 em idade de 2 dias (neonatal), 3 semanas (juvenil) ou 8-12 semanas (adultos). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do pulmão do camundongo

  1. Sacrifice the mouse (seguindo protocolos institucionalmente aprovados):
    1. Para camundongos adultos e juvenis : administrar uma overdose de anestesia (por exemplo, cetamina/xilazina) via injeção intraperitoneal.
    2. Para camundongos neonatais : decapitar.
      NOTA: Evite luxações cervicais em camundongos adultos e juvenis, pois esse procedimento pode danificar a traqueia.
  2. Esterilize o pelo do camundongo com etanol 70% (v/v).
    ATENÇÃO: Líquido inflamável. Irritante nos olhos. Fique longe do calor. Mantenha o recipiente bem fechado e faça uma incisão ventral na linha média para expor os órgãos internos.
  3. Remova cuidadosamente a pele e o peritônio.
  4. Exsanguina o camundongo cortando ambas as veias jugulares e a veia cava, permitindo que o sangue escoe do corpo.
  5. Remova cuidadosamente o diafragma para expor o coração e os pulmões.
    NOTA: Tenha cuidado para não machucar os pulmões. A perfuração do tecido pulmonar prejudicaria significativamente a eficiência da digestão subsequente mediada por enzimas do tecido pulmonar.
  6. Abra a caixa torácica com tesoura.
  7. Insira uma cânula no ventrículo direito do coração e perfunda com soro salino frio tamponado com fosfato (PBS) até que o sangue residual seja removido do pulmão e o tecido pulmonar fique pálido:
    1. Para camundongos adultos : use uma cânula de 26 g e perfunde o pulmão com 10 mL de PBS.
    2. Para camundongos neonatais : use uma cânula de 30 g e perfunda o pulmão com 1 mL de PBS.
      NOTA: Não perfunda os pulmões de camundongos juvenis para evitar a ruptura da estrutura alveolar por pressão excessiva nos vasos sanguíneos pulmonares. A perfusão pode ser menos eficaz em pulmões inflamados, e a mudança de cor no tecido pulmonar pode ser menos pronunciada. Se necessário, uma lavagem broncoalveolar pode ser realizada antes da etapa seguinte em camundongos adultos e juvenis.

2. Digestão enzimática do tecido pulmonar

  1. Camundongos adultos e juvenis:
    1. Exponha a traqueia removendo as glândulas salivares e o músculo ao redor.
    2. Insira uma cânula permanente de 22 G na traqueia, remova a agulha e mova o cateter plástico em direção aos pulmões.
    3. Amarre firmemente um pedaço de fio ao redor da traqueia e do cateter para mantê-lo no lugar.
    4. Prepare o tecido pulmonar instaurando dispase.
      ATENÇÃO: Pode causar alergia, sintomas de asma ou dificuldades respiratórias se inalado. Evite respirar poeira. Use proteção respiratória. Descarte o conteúdo/recipiente em uma estação de descarte de resíduos aprovada.) através do cateter inserido na traqueia:
      1. Para camundongos adultos : insira 2 mL de dispase.
      2. Para camundongos juvenis : insira 500 μL de dispase.
        NOTA: Use uma seringa com conexão de lur-slip para facilitar a troca de seringas entre os passos 2.1.4 e 2.1.5. Para garantir uma digestão enzimática eficiente do tecido pulmonar, é vital assegurar o preenchimento completo de enzimas nos espaços broncoalveolares.
    5. Troque a seringa e repita com agarose de baixa fusão (1% (p/v), 45 °C) para manter a estrutura durante o processamento.
      1. Para camundongos adultos : Use 500 μL de agarose de baixa derretimento.
      2. Para camundongos juvenis : Use 200 μL de agarose de baixa fusão.
        NOTA: Para evitar o refluxo dos fluidos, deixe a seringa presa.
        NOTA: Antes do uso: dissolva a agarose em baixa fusão usando calor (95 °C), deixe a solução de agarose esfriar até 45 °C, por exemplo, em um termobloco.
    6. Cubra o pulmão com papel de seda de laboratório e adicione gelo para permitir que a agarose solidifique por 2 minutos.
    7. Remova gelo, papel de seda, seringa e cateter.
    8. Amarre o fio para fechar a traqueia e manter a enzima nas vias aéreas inferiores.
    9. Remova o coração e o timo.
    10. Corte a traqueia acima do fio e remova o pulmão intacto do peito.
    11. Transfira o pulmão para um tubo de 15 mL contendo dispase pré-aquecido (37 °C) e incube o tecido pulmonar em dispase por 45 minutos em temperatura ambiente (20-25 °C).
      1. Para camundongos adultos : incubar o pulmão em dispase de 2 mL.
      2. Para camundongos juvenis : incubar o pulmão em dispase de 1,5 mL.
  2. Camundongos neonatais
    1. Colete e triture lóbulos de um pulmão usando tesoura fina na tampa de um tubo de 2 mL.
    2. Adicione 500 μL de dispase, feche a tampa e inverta o tubo para garantir que todo o tecido esteja coberto pela dispase.
    3. Incube o tecido pulmonar em dispase em temperatura ambiente por 45 minutos.

3. Preparação do tecido pulmonar

  1. Para camundongos adultos e juvenis:
    1. Remova o pulmão da dispase e dissece os lobos pulmonares do caule brônquico.
    2. Coloque os lobos pulmonares em uma placa de Petri (diâmetro: 8,5 cm) contendo 7 mL de DMEM + HEPES, 1 μg/mL (concentração final) anticorpo bloqueador anti-CD16/32 e 100 μL de DNAse (concentração final ~600 unidades de Kunitz).
      ATENÇÃO: Pode causar alergia, sintomas de asma ou dificuldades respiratórias se inalado. Evite respirar poeira. Use proteção respiratória. Descarte o conteúdo/recipiente em uma estação de descarte de resíduos aprovada.
    3. Desintegre o tecido pulmonar usando pinças.
      NOTA: Para garantir uma digestão enzimática eficiente do tecido pulmonar, é vital garantir uma completa desintegração mecânica do tecido.
    4. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente, balançando suavemente a 200 rpm.
      NOTA: A suspensão das células pode ser armazenada a 4 °C até a próxima etapa, se necessário.
  2. Para camundongos neonatais:
    1. Transfira a dispase, incluindo o tecido digerido, para uma placa de Petri (diâmetro: 5,4 cm) contendo 3 mL de DMEM + HEPES, 1 μg/mL (concentração final) anticorpo bloqueador anti-CD16/32 e 100 μL de DNAse (concentração final ~ 600 unidades de Kunitz).
    2. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente, balançando suavemente a 200 rpm.
      NOTA: A suspensão das células pode ser armazenada a 4 °C até a próxima etapa, se necessário.
  3. Continue para todas as faixas etárias:
    1. Filtre a suspensão celular através de uma série de peneiras de nylon com tamanho de poros decrescente (100 μm - 70 μm - 40 μm) para remover detritos e agregados grandes.
    2. Enxágue cuidadosamente os filtros e tubos celulares para minimizar a perda de células. Caso as amostras sejam agrupadas, suspensões celulares de camundongos do mesmo grupo podem ser passadas pelos mesmos peneiros celulares.
      NOTA: Em caso de entupido, troque os filtradores de células.
    3. Dependendo do volume, transfira a suspensão filtrada da célula para um ou mais tubos de 15 mL e centrifuge a suspensão da célula por 12 minutos a 140 x g a 4 °C.
    4. Descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet celular no tampão de lise de eritrócitos (tampão ACK).
      1. Para camundongos adultos e juvenis : Use 2 mL de tampão de lise de eritrócitos e incube por 2 minutos.
      2. Para camundongos neonatais : Use 3 mL de tampão de lise de eritrócitos e incube por 3 minutos.
    5. Pare a lise dos eritrócitos enchendo o tubo de 15 mL com DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS e centrifuge novamente por 12 minutos a 140 x g a 4 °C.

4. Coloração por anticorpos para separação celular ativada por fluorescência

  1. Resuspenda as células em uma solução coloridora de anticorpos contendo anticorpos acoplados a fluorocromo anti-F4/80, anti-CD93, anti-CD11c, anti-CD19, anti-CD31, anti-CD11b, anti-CD16/32, anti-CD45, anti-CD24 e anti-CD326 preparados em DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
    NOTA: Para resultados ótimos de coloração, use apenas anticorpos pré-titulados. Se os AECII precisarem permanecer intactos para a separação celular, não inclua anti-CD326 na solução de coloração de anticorpos.
    1. Para camundongos adultos : Use 600 μL de solução de anticorpos por pulmão.
    2. Para camundongos juvenis : Use 400 μL de solução de anticorpos por pulmão.
    3. Para camundongos neonatais : Use solução de anticorpos de 200 μL por pulmão.
  2. Incube a suspensão celular com os anticorpos por 10 minutos a 4 °C no escuro.
  3. Após a incubação, lave as células enchendo o tubo com DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
  4. Centrifuge por 12 minutos a 140 x g a 4 °C.
  5. Resuspenda as células DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS:
    1. Para camundongos adultos : Ressuspenda 300 μL por pulmão.
    2. Para camundongos juvenis : Ressuspenda em 200 μL por pulmão.
    3. Para camundongos neonatais : Ressuspenda 100 μL por pulmão.

5. Organização do AECII

NOTA: Preparação do instrumento: instale um bico de 100 μm para separar AECII usando um dispositivo FACS.

  1. Logo antes da seleção, filtre as células por um filtro de células de 50 μm. Enxágue o penador celular com DMEM suplementado com HEPES e FBS 10% (v/v) para evitar perda excessiva de células:
    1. Camundongos adultos : Enxágue o penador celular com 300 μL por pulmão.
    2. Camundongos juvenis : Enxágue o penador celular com 200 μL por pulmão.
    3. Camundongos neonatais : Enxágue o penador celular com 100 μL por pulmão.
  2. Ressuspenda as células por meio de vórtice diretamente antes da separação.
  3. Gate para AECII identificando eventos que I) apresentam alta dispersão lateral (SSC alto), II) são negativos para os fluorocromos da linhagem, e III) são positivos para o fluorocromo CD326 acoplado ao anticorpo anti-CD326.
    NOTA: Use fluorocromos com índices de brilho de altíssimo a muito alto (como APC, PE e BV785) para facilitar a discriminação entre não-AECII e AECII. Para uma abordagem de separação intacta (exclusão do anti-CD326 na solução de coloração), os AECII são identificados como células negativas para linhagem,SSC alto e célulaspositivas/ altas de autofluorescência. A autofluorescência AECII pode ser identificada em detectores de luz verde, por exemplo, detectores FITC ou GFP.
  4. Exclua doublets ou agregados usando altura de dispersão direta vs. área ( FSC-H vs. FSC-A) e altura de dispersão lateral vs. área ( SSC-H vs. SSC-A).
  5. Colete as células separadas em um tubo contendo DMEM suplementado com HEPES e FBS 10% (v/v) e centrífuga para análise ou cultura posterior.

6. Isolamento de RNA de AECII fixo por PFA (Opcional)

NOTA: Caso o AECII seja isolado de camundongos que tenham sido infectados, por exemplo, com patógenos virais respiratórios, o isolamento do AECII deve ser realizado sob condições BSL2 ou BSL3, dependendo do patógeno. Se o experimentador não tiver acesso à separação celular sob as condições de segurança apropriadas, AECII isolado usando o protocolo descrito acima pode ser corrigido com PFA após a coloração por anticorpos. Essa etapa desativa ospatógenos 10,11 e, assim, a subsequente classificação citométrica de fluxo AECII pode ocorrer sob condições BSL1. Embora as células não possam mais ser empregadas para ensaios funcionais devido ao processo de fixação, elas são adequadas para análises moleculares.

  1. Para a inativação de vírus, fixe suspensões de células únicas marcadas por anticorpos em 500 μL de PFA de 4% (p/v).
    ATENÇÃO: Sólido inflamável. Prejudicial se engolido ou inalado. Causa irritação na pele, danos graves nos olhos. Pode causar reação alérgica na pele, irritação respiratória e câncer. Suspeita de causar defeitos genéticos. Fique longe do calor. SE FOR ENGOLIDA: Ligue para um CENTRO DE INTOXICAÇÃO/MÉDICO se não estiver se sentindo bem. SE INALADO: Leve a pessoa para o ar fresco e mantenha-a confortável para respirar. Ligue para um CENTRO DE INTOXICAÇÕES ou médico se você se sentir mal. SE FOR NOS OLHOS: Enxágue cuidadosamente com água por vários minutos. Remova as lentes de contato, se estiverem presentes e fáceis de fazer. Continue enxaguando. SE FOR EXPOSTO OU PREOCUPADO: Procure orientação/atendimento médico.
    NOTA: Em conformidade com as diretrizes do 3R, foram usados AECII de camundongos não infectados neste estudo. Os AECII ficaram fixos por 10 minutos em temperatura ambiente. A duração da fixação deve ser testada individualmente para cada patógeno que represente um risco potencial para humanos e para o meio ambiente. A separação subsequente sob condições S1 requer verificação prévia em laboratório BSL2 ou BSL3 de que não há vírus replicável presente após a fixação de PFA.
  2. Após a fixação, lave as células com DMEM e centrifuge por 15 minutos a 140 x g.
  3. Resuspenda as células em 300 μL DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS e passe a suspensão celular por um filtro de célula de 100 μm.
  4. Enxágue o filtro celular com um meio adicional de 300 μL de DMEM + HEPES + 10% (v/v) de FBS para evitar perda excessiva de células.
  5. Ordene as células conforme descrito no passo 5. "Seleção do AECII".
    NOTA: Após a verificação experimental obrigatória de que qualquer vírus foi inativado pelo tratamento com 4% (v/v) de PFA, o AECII pode ser classificado sob as condições BSL1.
  6. Para isolamento de RNA de células fixadas em PFA, use o Kit FFPE RNeasy.
    ATENÇÃO: Este kit contém produtos químicos perigosos. Siga as instruções do fabricante. Preste atenção à ficha de dados de segurança incluída, com os seguintes ajustes:
    1. Após a separação, centrifuge as células por 15 minutos a 140 x g a 4 °C.
    2. Resuspenda as células em um PKD de tampão de 150 μL e transfira para um tubo de 1,5 mL.
    3. Adicione 10 μL de Proteinase K e incube a 56 °C por 15 minutos, seguido de incubação a 80 °C por até 15 minutos, dependendo da contagem celular ( veja a Tabela 1).
  7. Continue com o processo de isolamento de RNA conforme o protocolo, incluindo tratamento com DNase, etapas de lavagem e elução final em água livre de RNase de 30 μL.

Resultados

O protocolo aqui descrito representa um método otimizado e detalhado para isolar e analisar AECII de tecido pulmonar de camundongos em vários estágios do desenvolvimento, variando de neonatais a juvenis e camundongos adultos. A metodologia envolve dissociação pulmonar mecânica e enzimática, combinada com um fluxo de trabalho otimizado de separação celular citométrica de fluxo, utilizando protocolos personalizados adequados para processamento de amostras de animais infectados para posterior Separação de Fluxo sob condições BSL1.

Os dados experimentais revelaram alta eficácia desse procedimento de isolamento (resumido na Figura 1) na produção de populações AECII viáveis e altamente puras (>95%). A separação de fluxo gerou populações puras de AECII, com análise pós-ordenação validando quase 100% de especificidade para marcadores celulares estabelecidos (Figura 2). A quantificação de amostras celulares pós-triagem indicou altos rendimentos entre 0,15 × 106 AECII viáveis de pulmões neonatais e 1,0 × 106 células de amostras adultas por preparação para pulmão inteiro (Figura 3A). Os AECII isolados mantiveram a morfologia típica (Figura 3B) e integridade celular durante todo o processo de isolamento (Figura 3C). Além disso, a aplicabilidade do protocolo para estudos funcionais foi confirmada por meio de infecção ex vivo bem-sucedida usando um IAV adaptado a camundongos (H1N1, cepa A/Porto Rico/8/34) expressando a proteína repórter mCherry (IAV-mCherry12), com uma demonstração da capacidade das células de suportar a replicação viral (Figura 4).

Para suportar fluxos de trabalho experimentais que exigem fixação de amostras, o protocolo inclui uma abordagem especializada de extração de RNA usando fixação de PFA. Um exame minucioso da qualidade do RNA de AECII fixado por PFA em diferentes pontos de tempo de processamento indicou que RNA de alta qualidade, passível de análises moleculares a jusante, pode ser extraído de forma confiável de amostras fixas (Tabela 1). A qualidade do RNA extraído mostrou uma relação direta com a duração do tratamento térmico a 80 °C durante o procedimento de extração, oferecendo diretrizes claras de otimização baseadas em necessidades experimentais específicas (Tabela 1, Figura 5). A validação por análise quantitativa de transcrição reversa PCR (qRT-PCR) mostrou amplificação bem-sucedida tanto dos genes de manutenção (proteína ribossomal S9, Rps9) quanto dos marcadores específicos do AECII (proteína surfactante C, Sftpc) com amostras fixadas em PFA e preparações de controle frescas (Figura 6).

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Figura 1: Fluxo de trabalho esquemático para isolamento de AECII em pulmões de camundongos neonatais, juvenis e adultos usando digestão enzimática de tecidos e separação celular citométrica de fluxo. O diagrama ilustra o processamento sistemático dos pulmões de camundongos de diferentes faixas etárias. A eutanásia de camundongos e extração pulmonar é seguida por digestão enzimática em múltiplas etapas com dispase para desintegração tecidual. Após a perturbação mecânica, as células são purificadas por meio de uma série de etapas de filtragem com tamanhos de poros decrescentes. Subsequentemente, os eritrócitos são lisados. O enriquecimento específico do AECII é alcançado por seleção negativa usando marcação de anticorpos contra marcadores hematopoiéticos (CD45, CD11b, CD11c, F4/80, CD19, CD16/32), marcador endotelial CD31, marcador plaquetário CD93 e marcador de células epiteliais brônquicas CD24, seleção positiva de células epiteliais usando marcação de anticorpos contra CD326 e subsequente classificação citométrica de fluxo baseada nocaracterístico alto do SSC perfil de AECII granular. Esse protocolo permite o isolamento de AECII primários altamente puros (≥ 95%), viáveis, para análises funcionais e moleculares posteriores. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Estratégia representativa de portamento usada para o isolamento do AECII de camundongos adultos. (A) Suspensões de células únicas pulmonares foram coradas com anticorpos contra os seguintes antígenos: F4/80, CD93, CD11c (acoplado a APC), e CD19, CD31, CD11b, CD16/32, CD45, CD24 (acoplado a PE) e CD326 (acoplado a BV785). (B) Reanálise (A) para análise de pureza. Os AECII classificados foram reanalisados para confirmar a pureza de 97,2% dos AECII. (C) Imagens representativas de microscopia de fluorescência do AECII após a separação. Os núcleos foram corados com DAPI (azul). A coloração intracelular foi realizada usando um anticorpo anti-SPC primário (espécie: coelho), e a coloração secundária foi realizada usando IgG anti-coelho de cabra acoplado a Alexa 594 (vermelho). AECII corado apenas com DAPI e anticorpos secundários, e esplenócitos corados com anticorpos primários e secundários serviram como controles relevantes, indicando ligação específica do anti-SPC e do anti-rabbitAlexa 594. Barras de escala: 20 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Rendimento, morfologia e vitalidade do AECII após a separação celular ativada por fluorescência. (A) Número total de AECII viáveis por pulmão obtido de camundongos neonatais, juvenis e adultos. (B) Imagem de microscopia óptica do post triagem AECII ordenado. Barra de escala: 75 μm. (C) Viabilidade AECII observada por coloração azul tripano após a triagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Infecção ex vivo de AECII classificado com IAV-mCherry. Células AECII isoladas de camundongos adultos foram cultivadas ex vivo em placas de cultura de tecido revestidas com Matrigel durante a noite para permitir a fixação. Posteriormente, as células foram infectadas com IAV-mCherry (multiplicidade da infecção 2) por 8 horas. Foi observado um aumento dependente do tempo na intensidade do sinal de mCherry. Barra de escala: 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Integridade do RNA a partir de 4% de PFA fixou AECII. Perfis representativos de RNA do PFA fixados e classificados em AECII após isolamento de RNA usando o Kit Qiagen FFPE RNeasy com modificações. Picos específicos para 18S e 28S rRNA, juntamente com o número de qualidade do RNA (RQN), representam a integridade e qualidade do RNA isolado intacto de AECII fixado por PFA. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 6: Curvas de amplificação do gene de manutenção Rps9 e do gene específico de AECII Sftpc , a partir do controle (não tratado) e do AECII fixo com 4% de PFA. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

ExemploTempo de incubação a 80 °C28S/18SRQNRNA conc. [ng/μ]
Controle 0,5x106-2105.8
Controle 1x106-1.91012.3
PFA fixo 0,5x106526.45.5
PFA fixo 0,5x106101.98.13.7
PFA fixo 0,5x106151.88.22.76
PFA fixo 1 x106528.26.26
PFA fixo 1 x106101.18.45.12
PFA fixo 1 x106150.98.55

Tabela 1: Qualidade do RNA isolado de 4% de AECII fixo pelo PFA - impacto dos diferentes tempos de fixação. O RNA do AECII foi isolado de acordo com o protocolo do fabricante (FFPE RNeasy Kit) com modificações descritas na etapa 6. As células fixas foram incubadas a 80 °C por 5 min, 10 minutos ou 15 minutos para eluir o RNA da amostra. A integridade do RNA foi determinada usando o Fragment Analyzer da Agilent

Discussão

O protocolo otimizado aqui descrito oferece uma abordagem confiável e reprodutível para o isolamento e análise do AECII a partir de tecido pulmonar de camundongos em idades neonatais, juvenis e adultas. Além disso, ele oferece uma etapa opcional de fixação de PFA antes da seleção, que permite que AECII seja separado de camundongos sob condições BSL1, mesmo que eles tenham sido previamente infectados por patógenos respiratórios. Por meio da combinação de exposição pulmonar cuidadosamente realizada e perfusão, seguida pela instilação intratraqueal de enzimas e agarose de baixa fusão no pulmão, a estrutura tecidual é mantida, permitindo a recuperação de suspensões unicelulares de alta qualidade para análise posterior. A adição da classificação citométrica de fluxo nas propriedades de espalhamento lateral, gating linhagem-negativo e seleção positiva para células CD326-positivas resultou em populações notavelmente puras de AECII. Essa pureza é de particular importância para garantir que os ensaios moleculares e funcionais posteriores sejam representativos da biologia intrínseca do AECII e não sejam confundidos por tipos celulares contaminantes, aprimorando a interpretabilidade dos estudos de expressão gênica e interação vírus-hospedeiro.

O protocolo mencionado acima inclui exclusão de anticorpos não AECII usando uma ampla variedade de anticorpos marcados fluorescentemente direcionados contra antígenos leucocíticos e não leucocíticos e subsequente seleção positiva de AECII por meio de propriedades de espalhamento lateral e expressão da molécula específica de células epiteliais CD326. Embora tenha sido demonstrado que essa metodologia resultou em populações de AECII altamente puras (usando SPC, um marcador característico do AECII), a pureza das populações obtidas só pôde ser confirmada por coloração intracelular pós-triagem, até o momento. Esse protocolo pode ser aplicado para isolar AECII de pulmões infectados pelo vírus SARS-CoV-2 e influenza, nos quais os AECII são principalmente alvo do vírus e apresentam adaptações celularesdistintas 1. No entanto, esse método pode não ser apropriado para isolar AECII murino no contexto de estudos de biologia do câncer de pulmão, já que o EpCAM (CD326) também é expresso por células do câncer pulmonar em camundongos ehumanos 13. Para esses estudos, o uso de cepas transgênicas de camundongos que expressam proteínas fluorescentes sob o controle transcricional do promotor Spc pode fornecer uma abordagem mais adequada para o isolamento confiável dos AECII primários.

Um rendimento de 0,15 × 10 6 AECIIviáveis por pulmão neonatal e até 1,0 × 106 células por pulmão adulto ilustra a eficiência e escalabilidade do protocolo. Um grande obstáculo para o isolamento bem-sucedido de grandes quantidades de AECII é a digestão enzimática ineficiente e a desintegração mecânica do tecido pulmonar. Assim, é crucial garantir o preenchimento completo dos espaços broncoalveolares com a enzima no passo 2.1.4 e realizar cuidadosamente a desintegração mecânica do tecido no passo 3.1.3. A digestão enzimática eficaz resulta em uma suspensão de células turvas com contribuição mínima de agregados visíveis que geralmente podem ser desintegrados usando um êmbolo nos passos seguintes do filtro. Agregados maiores que não podem ser passados pelo filtro celular geralmente surgem como consequência da digestão enzimática insuficiente. Observe que não é recomendado prolongar os tempos de digestão enzimática, pois isso pode afetar negativamente a imunocoloraçãosubsequente 14 e, assim, a precisão do isolamento AECII baseado em FACS.

Além da eficiência da desintegração enzimática e mecânica do tecido, o fundo genético pode impactar o rendimento do AECII. Para esse protocolo, foram usados camundongos com fundo C57BL/6. De acordo com as diferenças específicas de15 do desenvolvimento relatadas, 16 imunológicas e 17,18,19 fisiológicas específicas de cepas, é concebível que o uso de outras cepas de camundongos de laboratório (por exemplo, BALB/c, DBA) possa resultar em diferentes rendimentos de AECII. Além disso, o rendimento de AECII proveniente de pulmões inflamados (infecciosos ou não infecciosos) pode ser significativamente reduzido. Isso pode ser resultado da morte celular indireta (inflamatória) ou direta (mediada por patógenos) do AECII, que representam alvos principais para, por exemplo,IAV 20,21 e SARS-CoV-2 22,23,24.

A preservação da integridade celular durante dissociação mecânica, digestão enzimática e separação de fluxo é ainda mais fundamental para análises moleculares e/ou funcionais posteriores. Portanto, a viabilidade do AECII e a função celular foram avaliadas após a seleção. Os AECII foram capazes de aderir ao Matrigel e manter uma morfologia característica rica em corpo lamelar por pelo menos 24 horas, o que indica competência funcional após isolamento e adequação para cultura ex vivo (incluindo modelos de infecção).

A infecção eficiente de AECII classificado com o vírus repórter IAV-mCherry12 e a observação de forte replicação viral validam esse sistema como uma plataforma robusta para elucidar respostas antivirais epiteliais intrínsecas. Como o AECII regula processos-chave envolvidos na biossíntese de surfactantes, regeneração alveolar e imunidade inata25,26, a capacidade de examinar a cinética de replicação do IAV e as respostas transcricionais do hospedeiro em populações purificadas de AECII fornecerá insights não obtidos em preparações de células mistas.

Uma inovação chave deste protocolo é a inclusão de um procedimento de fixação, permitindo análise lado a lado de amostras frescas e inativadas. A fixação de PFA e os processos de extração de RNA adaptados pelo FFPE mantêm a integridade do RNA em grau compatível com análises transcriptômicas posteriores, como evidenciado pelo sucesso da PCR quantitativa por transcrição reversa (qPCR).

Os tempos de fixação do PFA podem afetar a qualidade da coloração e, assim, a recuperação do AECII pelo FACS. Além disso, o rendimento e a qualidade do RNA geralmente são afetados pelos processos de fixação. Dependendo do modelo de infecção in vivo utilizado, esses aspectos precisam ser considerados para o desenho experimental. Recomenda-se evitar um tempo extenso de fixação e, em vez disso, otimizar a duração do tratamento com PFA para que o tempo mínimo necessário seja utilizado, o que foi comprovado experimentalmente para garantir a completa inativação do respectivo vírus.

A avaliação da abundância de RNA ribossomal (rRNA) usando um instrumento de microfluídico serve como substituto para estimar a qualidade do mRNA em amostras biológicas. O protocolo de fixação/isolamento de RNA descrito pelo AECII permite o isolamento de RNA intacto com qualidade suficiente para análises transcriptômicas posteriores, como evidenciado pelas razões de rRNA 28S/18S >1 e pelos valores do número de qualidade do RNA (RQN) >8. É importante notar que a etapa de incubação de 80 °C reduz criticamente o rendimento e a qualidade do RNA. A adaptação dos tempos de tratamento térmico pode ser aplicada opcionalmente para aumentar o rendimento e a qualidade do RNA para aplicações posteriores.

Coletivamente, essas melhorias metodológicas fornecem um conjunto extenso de ferramentas para o estudo da biologia do AECII no contexto da saúde, doenças infecciosas e desenvolvimento (do recém-nascido ao adulto). O alto rendimento e pureza dos AECII isolados por essa abordagem permitem o perfilamento multiômico, abrangendo ensaios transcriptômicos, proteômicos e de acessibilidade à cromatina, bem como ensaios funcionais (por exemplo, infecção ex vivo ) para dissecar ainda mais os mecanismos relevantes do AECII in vivo.

Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Tatjana Hirsch e Friederike Kruse pela assistência técnica especializada, a Lisa Hönicke e Justine Smout pelas discussões úteis, e a Yoshihiro Kawaoka por fornecer o vírus repórter IAV-mCherry. Este estudo foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa) - TRR 359 - Projeto número 491676693 (para D.B. e J.H.), a iniciativa COVIPA (KA1-Co-02, Associação Helmholtz; para D.B.) e uma bolsa da Fundação Alemã de Pesquisa (BO 7036/1-1; para J.D.B.). Reconhecemos o apoio do Fundo de Publicação de Acesso Aberto da Faculdade de Medicina da Universidade Otto-von-Guericke de Magdeburgo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Buffer ACK--8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 200 g e micro; L de 0. 5 M EDTA, adicione 1000 mL de Milli-Q, ajuste o pH para 7,2 a 7,4
anti-mouse CD11beBiociência12-0112-83clone M1/70; PE acoplado
CD11c anti-mouseBiolenda117310clone N418; APC acoplado
anti-mouse CD16/32BD em Biociências553141clone 93; purificado
anti-mouse CD16/32BD em Biociências561727clone 2.4G2; PE acoplado
anti-mouse CD19Biolenda115508clone 6D5; PE acoplado
CD24 anti-mouseBiolenda101808clone M1/69; PE acoplado
anti-mouse CD31Biolenda102408clone 390; PE acoplado
anti-mouse CD326Biolenda118245clone G8.8; BV785 acoplado
anti-mouse CD45BD em Biociências553081clone 30-F11; PE acoplado
anti-mouse CD93eBiociência17-5892-82clone AA4-1; APC acoplado
anti-mouse F4/80Biolenda123116clone BM8; APC acoplado
anti-mouse SPC Abcamab211326Espécie hospedeira: Coelho; Clone: EPR19839; purificado
Aria-FusãoBD em BiociênciasClassificador de células
Aria-II SORPBD em BiociênciasClassificador de células
Placa Biozym AgaroseBiozym8401011% (v/v) em H2O
Filtro celular (100 & micro; M, 70 & Micro; M, 40 & Micro; m)BD Falcon352360, 352350, 352340
CellTrics (50 & micro; m)Sysmex04-004-2327
Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino, 2000 unidades de Kunitz/frascoSigma-AldrichD4263Conteúdo recém-dissolvido de 1 frasco em 330 & micro; L DMEM
Dispase, 100 mL (5000 unidades caseinolíticas)Corning354235realizar filtração estéril (tamanho dos poros 0,22 & micro; m), prepare 4 mL alíquotas em tubos de 15 mL, armazene em -20 & deg; C
DMEMGibco31885-049glicose baixa, com piruvanato, adicione HEPES (concentração final de 25 mM)
FACS DivaBD em BiociênciasSoftware de Classificação
FlowJoSoftware de Avaliação para dados FACS
O Anti-Coelho da CabraAlexa 594 acoplada
Cânula Interna Introcan 22GBraun4252098B
RNeasy FFPE KitQiagen73504
Sinfonia S6 SEBD em BiociênciasClassificador de células

Referências

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