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Artigo de método

Imagem Intravital de Dois Fótons da Morfologia do Axônio Sensorial de Toque em Pele de Camundongos

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DOI:

10.3791/69589

⸱

30 de dezembro de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo apresenta uma abordagem in vivo de imagem de dois fótons para visualizar as estruturas dos terminais axônicos de mecanorreceptores de baixo limiar (LTMR) na pele da pata dianteira de camundongos. Utilizando imagens repetidas e de alta resolução de axônios individuais, esse método oferece uma nova plataforma para estudar a estrutura e a função do circuito sensorial cutâneo durante o desenvolvimento e em adultos.

Resumo

Mecanorreceptores de limiar baixo (LTMRs) são neurônios somatossensoriais que detectam estímulos toques leves inocentes, como vibração, deflexão de cabelo e pressão. Eles formam terminais axonais específicos de subtipo na periferia e projetam axônios centralmente para a medula espinhal para transmitir informações táteis. O entendimento atual do desenvolvimento e organização dos LTMR vem de tecidos fixos que não podem revelar os processos dinâmicos e temporais de fiação e remodelação axonal. Aqui, é apresentado um método de imagem com dois fótons para visualizar a morfologia axônica LTMR na pata dianteira do camundongo durante o desenvolvimento e em adultos. A microscopia de dois fótons pode alcançar imagens de alta resolução dentro da pele intacta, possibilitando imagens repetidas dos mesmos terminais axônicos em pontos de tempo pós-parto. A imagem de dois fótons pode ser combinada com novas ferramentas genéticas de camundongos para revelar o desenvolvimento de axônios com especificidade de subtipo. A imagem crônica de LTMRs permite estudos de montagem e reparo de circuitos após lesão. Essas abordagens fornecem um sistema in vivo que fornecerá novos insights sobre os mecanismos celulares que regulam o desenvolvimento e a regeneração dos axônios somatossensoriais.

Introdução

O tato é o sentido mais antigo a se desenvolver e desempenha um papel central em como os organismos experimentam e respondem ao mundo físico. O tato é detectado por mecanorreceptores de baixo limiar (LTMRs), que são subtipos de neurônios ganglionares da raiz dorsal (DRG) que detectam estímulos mecânicos inocentes, incluindo indentação, vibração e deflexão de pelos 1,2. Os LTMRs são pseudounipolares e estendem axônios periféricos para os tecidos periféricos formando terminais específicos de subtipo. Seus axônios centrais transmitem informações táteis ao sistema nervoso central formando conexões sinápticas com os neurônios da medulaespinhal 3. No entanto, como circuitos de toque são estabelecidos e mantidos é pouco compreendido.

Estudos fundamentais anteriores em gatos durante as décadas de 1960 e 1970 identificaram esses mecanorreceptores funcionalmente distintos e suas propriedades de resposta em pelepeluda 4,5. Subtipos LTMR são classificados por sua morfologia única, velocidade de condução e propriedadesde resposta 2. Os principais subtipos de LTMR são Aβ de adaptação rápida (RA) e adaptação lenta (SA), Aδ-LTMRs e C-LTMRs 2,6,7. Aβ RA-LTMRs, Aδ-LTMRs e C-LTMRs formam complexos lanceolatos longitudinais ao redor dos folículoscapilares 2. Os Aδ-LTMRs formam terminações lanceoladas polarizadas ao redor dos folículos capilares do lado caudal, uma característica essencial para suas respostas seletivas na direção à deflexãodo cabelo 7. As terminações axonais nos complexos lanceolatos estão estreitamente alinhadas com os eixos capilares e são envolvidas por processos semelhantes a dedos provenientes de células terminais de Schwann, que fornecem suporte trófico e influenciam a morfogêneseaxonal 8,9,10. Na pele glabra, os axônios Aβ RA-LTMR terminam nos corpúsculos de Meissner, que são estruturas em forma de ovo localizadas dentro das papilas dérmicas, sintonizadas para se mover pelapele 2,11.

A organização dos terminais axonais LTMR é regulada tanto por programas intrínsecos quanto por pistas dependentes da pele durante odesenvolvimento 12,13. Quando danificada, a disfunção da LTMR está associada a condições patológicas como a alodínia mecânica12,14. No entanto, os mecanismos para o desenvolvimento e manutenção da LTMR na pele intacta permanecem incertos. Grande parte do que se sabe sobre seu desenvolvimento provém de tecidos fixos, que não conseguem capturar os processos dinâmicos que podem ocorrer in vivo 6,15,16,17,18. Por exemplo, Aβ RA-LTMRs e Aδ-LTMRs exibem inervações ativas ao redor dos folículos capilares e poda axonal durante o desenvolvimento pós-natalinicial 19. Como a inervação e a manutenção dos folículos capilares são alcançadas in vivo ainda é desconhecido.

A microscopia de varredura a laser de dois fótons, uma técnica avançada de imagem que permite visualizar estruturas marcadas fluorescentemente dentro de tecidos vivos, possibilitou imagens in vivo de alta resolução de processos fisiológicosdinâmicos 20,21. Durante a imagem de dois fótons, pulsos breves de luz no infravermelho próximo excitam fluoróforos apenas no plano focal, confinando assim o sinal a um volume pequeno e minimizando a fluorescência fora de foco21,22. Esse confinamento reduz significativamente a fototoxicidade e permite imagens tridimensionais e espacialmente resolvidas de estruturas 20,23,24. Além disso, os comprimentos de onda de excitação mais longos usados na microscopia de dois fótons espalham menos dentro do tecido, permitindo penetração mais profunda e menor ruído em ambientescomplexos 20,25,26. Por exemplo, a imagem de dois fótons revelou plasticidade sináptica estrutural e atividades neuronais nos neurônios do chifre dorsal da medulaespinhal 27,28,29. Além disso, imagens crônicas in vivo de dois fótons dos folículos capilares revelaram insights sobre sua homeostase na pele da orelhado camundongo 23. Portanto, a microscopia de dois fótons é muito adequada para estudar estruturas LTMR na pele in vivo, especialmente quando são necessárias imagens repetidas e de longo prazo para acompanhar mudanças de desenvolvimento e crônicas.

Quando combinada com linhas de camundongos geneticamente modificadas que expressam repórteres fluorescentes, a microscopia de dois fótons pode revelar morfologia neuronal napele 3. No sistema somatossensorial, a proteína fluorescente amarela (YFP), expressa sob o controle do promotor thy1 (Thy1-YFP)30, marca seletivamente complexos lanceolados Aβ-LTMR na pele peluda e corpúsculos de Meissner na pele glabra30,31. Em camundongos Thy1-YFP, axônios marcados são positivos para proteína básica de mielina e neurofilamento, que são marcadores para os axônios mielinizadosAβ 30,31. Além disso, o CreER TrkB, no qual a Cre recombinase induzida por tamoxifeno (CreER) é impulsionada pela expressão do gene TrkB (receptor da tropomiosina quinase B), marca seletivamente os Aδ-LTMRs durante o desenvolvimento7. Na pele, a microscopia de dois fótons é mais eficaz para imagens de LTMRs em camundongos anestesiados, pois o movimento do camundongo impactaria a aquisição de imagem de alta resolução. Leva tempo para visualizar proteínas fluorescentes nos terminais axonais após a expressão induzida por CreER, e o período mínimo de espera precisa ser determinado para cada linha transgênica. De modo geral, essa metodologia pode ser aplicada para visualizar LTMRs em camundongos de todos os estágios do desenvolvimento e em adultos.

Este protocolo explica os procedimentos para o uso da microscopia de dois fótons para investigar a morfologia axônica LTMR na pele peluda e glabra de camundongos em desenvolvimento e adultos em alta resolução. O protocolo inclui várias dicas para imagens crônicas e de alta resolução ótimas. Essa abordagem integrativa permite a investigação dos mecanismos celulares que impulsionam a montagem e plasticidade dos axônios sensoriais de toque in vivo.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com as regulamentações institucionais de cuidado animal e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais (IACUC) da Universidade Vanderbilt. Para a segurança dos experimentadores, todos os procedimentos foram realizados com jalecos, luvas estéreis e máscaras. Todas as ferramentas foram esterilizadas minuciosamente antes do uso, e todas as superfícies experimentais foram limpas com etanol a 70% antes e depois de cada experimento. Os camundongos usados neste estudo eram adolescentes e adultos de ambos os sexos e derivaram de linhagens de Thy1-YFP, TrkBCreER e Ai140. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de instrumentos

  1. Ligue o laser. Deixe tempo suficiente para o laser aquecer. Neste trabalho, foi utilizado o laser Chameleon Discovery NX, que tem uma duração de pulso de 100 femtossegundos (fs) e uma taxa de repetição de 80 ± 0,5 megahertz (MHz).
  2. Ligue o microscópio de dois fótons e abra o software de controle e aquisição no computador.
  3. Ligue a bolsa térmica e ajuste para 37 °C para evitar hipotermia durante a anestesia.

2. Preparação da anestesia e da pata dianteira para imagem

  1. Para induzir anestesia, coloque o camundongo na câmara de indução e ajuste o sistema para 3,5% de isoflurano até que o camundongo perca o reflexo de endireitamento e apresente respirações suaves e regulares (seguindo protocolos institucionalmente aprovados). O ar ambiente é usado como suporte e deve ser ajustado para 1,0 litro por minuto (L/min).
  2. Coloque o mouse na almofada térmica da plataforma de imagem e reduza o isoflurano para 1,5% e o oxigênio para 0,5 L/min. O isoflurano deve ser administrado pelo cone do nariz. Para camundongos com menos de 20 dias pós-parto, o isoflurano é ajustado para 2-4% para manter a anestesia. Monitore a profundidade da anestesia a cada 10 minutos, avaliando a perda dos reflexos pedais e palpebrais, frequência e profundidade respiratória, e o tônus muscular geral.
  3. Para minimizar artefatos de movimento durante a imagem, incluindo o movimento relacionado à respiração, o camundongo deve ser colocado em um palco separado da pata. Para esse protocolo, o corpo do rato repousa sobre uma plataforma diretamente adjacente, mas sem tocar, a plataforma de imagem onde a pata está montada.
  4. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar ressecamento durante a imagem de imagem.
  5. Aplique suavemente creme depilatório na pata usando um cotonete para remover os pelos. Depois de deixar repousar na pele por um minuto, remova o creme e limpe a pata do rato com etanol 70% e água.
  6. Estique suavemente a pele para estabilizar a superfície. Usando uma agulha estéril de 30 G e tinta preta, perfure suavemente a pele e a tatuagem com dois pontos adjacentes de cada lado da região da imagem pretendida. Certifique-se de que os pontos estejam espaçados cerca de 2 milímetros (mm) de distância. Após a tatuagem, descarte corretamente a agulha em um recipiente para objetos cortantes.
  7. Em uma lâmina de microscópio de vidro, coloque quatro pontos de graxa a vácuo nos cantos e coloque um pequeno pedaço de argila (por exemplo, argila de modelagem de endurecimento ao ar DAS) com aproximadamente 1 mm de espessura no centro da lâmina. Coloque o ferrolho sob a lente do objetivo e centre a pata do rato diretamente no pedaço de argila (Figura 1A,B). Role suavemente a pata do rato no ferrolho para achatá-lo e pressione-o contra o barro. Coloque cuidadosamente uma cobertura de 22 mm x 60 mm em cima da pata para fixar o ferrolho. Ajuste o ângulo da pele do camundongo aplicando uma leve pressão em cada um dos cantos da capa até que a superfície da capa e a pele fiquem paralelas ao plano de imagem. Usar força suave durante a imagem ajuda a prevenir possíveis lesões na pele.
  8. Para imaginar a pele glabra, coloque o ferrolho sob a lente objetiva e centre a pata do rato no ferrolho, conforme detalhado no passo 2.7. Use uma pinça para girar a pata para que a pele glabra fique voltada para cima. Use a ponta plana da pinça para pressionar suavemente a pata contra a argila. Quando a pata estiver plana, coloque a capa de cobertura por cima e pressione para baixo conforme descrito no passo 2.7.

3. Imagem de microscópio de dois fótons da morfologia do LTMR

NOTA: Os seguintes parâmetros podem ser ajustados com base no experimento específico. Para este experimento, foi usada uma lente objetiva de imersão em água 20x com abertura numérica de 1 e distância de trabalho de 2,00 mm. Os passos 3.1-3.6 descrevem os parâmetros específicos usados para a pata dianteira direita dos camundongos Thy1-YFP , podendo servir como guia de referência.

  1. Coloque uma gota de água destilada na manta de cobertura, diretamente sobre a pata do rato.
  2. Abaixe a lente objetiva até que uma coluna d'água se forme.
  3. Uma vez que a lente do objetivo esteja centralizada sobre a pata do rato, feche a caixa do microscópio e use a tela de LED para focar na amostra através dos controladores X, Y e Z. A tela de LED exibe uma imagem ao vivo iluminada pelo LED embutido do microscópio.
    NOTA: O modo LED é usado para confirmar que a lente objetiva está centralizada no campo de interesse antes de mudar para o modo de dois fótons. A imagem LED mostra características superficiais como vasos sanguíneos e folículos capilares, servindo como guia visual para alinhamento e direcionamento. As tatuagens na pata do rato aparecem como pontos pretos na tela de LED. Usando esses pontos de referência, encontre e foque na área entre as manchas pretas. Isso garante que a mesma área da pata do rato seja registrada repetidamente.
  4. Quando a amostra for encontrada, desligue a tela de LED. Para realizar imagens com dois fótons a partir do tecido, troque o microscópio da configuração espelho para a dicroica girando uma alavanca no lado superior direito do microscópio.
  5. Feche as cortinas blackout e ligue o detector para visualizar o YFP.
  6. Usando o Prairie View, abra o obturador e mude o software para o modo de imagem. Para obter imagens de Thy1-YFP, ligue o laser sintonizável ajustado a 960 nanômetros (nm) para um ganho de 700-800. Ao fazer a imagem da GFP, ajuste o laser sintonizável para 920 nm.
    1. Para camundongos pós-parto no dia 10 ou mais novos, ajuste a potência inicial do laser para 50, aumentando até atingir a intensidade desejada do sinal. Essa potência inicial menor do laser minimiza a penetração da luz e o risco de danos por foto. Depois que o comprimento de onda, ganho e potência do laser forem definidos, comece a varredura.
      NOTA: Para capturar uma imagem de campo de visão de alta resolução 1,00x ou uma imagem de corpúsculos de Meissner em pontas glabras, recomenda-se usar um tamanho de imagem de 1024 x 1024 com campo de visão de imagem de 601,9 μm x 601,9 μm e tamanho de pixel de 0,588 μm x 0,588 μm. Para imagem das terminações lanceoladas ao redor dos folículos capilares, recomenda-se ter um tamanho de imagem de 1024 x 1024 com zoom de 8,00x, um campo de visão de imagem de 75,2 μm x 75,2 μm e um tamanho de pixel de 0,147 μm x 0,147 μm. É importante notar que o campo de visão da imagem e o tamanho do pixel mudam conforme a configuração de zoom.
  7. Use os controladores X, Y e Z para encontrar o campo de imagem, ajuste o zoom conforme necessário e inicie a aquisição da imagem. Uma imagem ótima é tipicamente obtida em uma posição inicial cerca de 10-20 μm abaixo da superfície da pele.
    NOTA: Uma imagem de alta resolução da pele peluda normalmente tem um passo de 1 μm ou 2 μm com aproximadamente 40-120 fatias. Enquanto isso, uma imagem de alta resolução da pele glabra normalmente tem um passo de 2 μm a 4 μm com aproximadamente 80-100 fatias. Isso resulta em uma faixa típica de z de 100-250 μm, e a profundidade máxima total de imagem é de aproximadamente 300 μm.
  8. A sessão de imagem será limitada a 25 minutos para minimizar a duração da exposição ao isoflurano e reduzir o risco de efeitos adversos relacionados à anestesia para o animal. O isoflurano extra é absorvido por um filtro de carvão anestésico, que pode ser descartado em lixo comum.

4. Cuidados pós-operatórios

  1. Retire a pata do vidro e coloque o rato de volta em uma gaiola de recuperação.
  2. Mantenha a gaiola do camundongo aquecida em uma almofada térmica até que ele se recupere totalmente da anestesia.
  3. Coloque o rato de volta em sua gaiola, observando-o por mais 30 minutos para garantir que ele se integre com seus companheiros de gaiola.

5. Imagem crônica in vivo da morfologia da LTMR

  1. Coloque o mouse sob o microscópio de dois fótons seguindo os passos 2.4-3.3.
  2. Usando a tela de LED, localize os pontos de tinta da sessão de imagem anterior. Oriente a tela entre os pontos para garantir que a área desejada seja capturada. Durante o modo de varredura no microscópio, verifique por pontos de referência, como nervos grandes ou padrões de folículos capilares, para garantir que a localização seja a mesma área.
  3. Uma vez encontrada a área de imagem, siga os passos 3.4-3.6 para continuar a imagem.
  4. Verifique a qualidade e intensidade das imagens, bem como a morfologia dos axônios principais, obtidos por excitação de dois fótons na área da pele. Certifique-se de que os campos de imagem sejam comparáveis aos tirados durante a sessão de imagem anterior.

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Resultados

Neste trabalho, a microscopia de dois fótons foi usada para visualizar as estruturas axonais Aβ, RA-LTMR e Aδ-LTMR na pele durante o desenvolvimento e em adultos. Terminações lanceoladas maduras, ocorrendo em camundongos por volta do dia 20 pós-natal, estão totalmentedesenvolvidas 19,32. A organização geral dos terminais axônicos na pele peluda de camundongos adultos foi registrada, como mostrado na projeção de intensidade máxima (Figura 2A

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Discussão

Este estudo demonstra o uso da microscopia de dois fótons para examinar a morfologia da LTMR na pele intacta de camundongos neonatais e adultos. Essa abordagem de imagem longitudinal supera as limitações da fixação do tecido e permite a observação em tempo real das estruturas axonais em tecidos intactos. As morfologias axonais Aβ RA-LTMR e Aδ-LTMR visualizadas por meio de imagem de dois fótons são consistentes com observações de tecidos fixos previamente porPFA

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Divulgações

Os autores não relatam divulgações relevantes.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer à Dra. Hannah Elam, Dra. Snighda Mukerjee, Rachelle Larivee e Dra. Tegy J. Vadakkan por todo o apoio e assistência ao longo desta pesquisa. Agradecemos a Ryan Michael Nuera pela ajuda na instalação do sistema de isoflurano. Este trabalho é apoiado pela Bolsa Hanna Gray do Instituto Médico Howard Hughes (Bolsa# GT17518).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Lente Objetiva 20x & ndash; Super NA 1.0Olympus1-U2B965Configuração do Microscópio de Dois Fótons
Cobertura 22x60VWR16004-330Configuração do Microscópio de Dois Fótons
Argila de modelar com endurecimento ao arDASConfiguração do Microscópio de Dois Fótons
Bomba de Ar para Anestesia (HF), 110VRWD Life Science Inc.R510-30Sistema Isoflurano
Máscara Concêntrica de AnestesiaRWD Life Science Inc.R510-MSistema Isoflurano
Câmara de Indução de Anestesia – Rato e RatoRWD Life Science Inc.V105Sistema Isoflurano
Bruker Ultima Investigator Plus Microscópio de Varredura a LaserBruker Nano, Inc. Configuração do Microscópio de Dois Fótons
Agulhas BorboletaFisher Scientific1484041Configuração do Microscópio de Dois Fótons
Chameleon Discovery NX com TPC: DualCoerente1385777Configuração do Microscópio de Dois Fótons
Máscara Cone com Tubo para Camundongos NeonataisRWD Life Science Inc.68680Sistema Isoflurano
Filtros de emissão duplos (et525/70m e et595/50m) e t565lpxr  Divisor de feixe dicróicoNikonINVP-01Configuração do Microscópio de Dois Fótons
Conjunto de Filtros de Epi-Fluorescência ET-GFP ET470/40x e ET252/50m; Dicroico T495LPXR Nikon518065Configuração do Microscópio de Dois Fótons
EtanolDecon Laboratories Inc.Configuração do Microscópio de Dois Fótons
Base de aquecimento infravermelha distante com controlador (AC)Kent ScientificRT-0515Configuração do Microscópio de Dois Fótons
Detectores GaAsp (2) Fotônica Hamamatsu HED-UP-2 Configuração do Microscópio de Dois Fótons
Cilindros de filtro de gásRWD Life Science Inc.R510-31-6Sistema Isoflurano
Graxa de alto vácuoSigma AldrichZ273554Sistema de Imagem
Isoflurano, USP (250 mL)Piramal Cuidados Críticos6679-017-25Sistema Isoflurano
Caixa de Cobertura a Laser  Teco TechnologySistema de Imagem
Ratos: B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/JJAX27214
Ratos: B6. Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP, CAG-tTA2)Hze/JJAX30220
Ratos: B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/JRio Charles3709
Creme Depilatório NairAmazon28001Configuração do Microscópio de Dois Fótons
Arquivos de Dados BrutosZenodo10.5281/zenodo.17370834
Suporte rígido com grande suporte retangular para inserçãoThorlabsMP15MConfiguração do Microscópio de Dois Fótons
Plataforma de Operação de Anestesia de Pequenos AnimaisRWD Life Science Inc.R510-PGLSistema Isoflurano
Pomada Lubricante Relaxante para OlhosBausch + LombConfiguração do Microscópio de Dois Fótons
Lâminas de Microscópio Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15Configuração do Microscópio de Dois Fótons

Referências

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