Method Article

Isolamento e Quantificação de MRNAs Axonais Usando Inserções de Membrana Porosa e RTddPCR

DOI:

10.3791/69601

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February 6th, 2026

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1Department of Biological Sciences, Rutgers University- Newark, 2College of Arts & Sciences, Boston University

In This Article

Summary

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Este estudo apresenta um método robusto para isolar mRNAs axonais usando inserções de membrana porosas, possibilitando a separação total de neurônios vs. neuritos e a purificação de RNA. Combinado com o RTddPCR, a abordagem permite a quantificação absoluta de transcritos de baixa cópia, facilitando estudos de transporte de mRNA e tradução local com alta sensibilidade, reprodutibilidade e ampla aplicabilidade experimental.

Abstract

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A dinâmica espacial da localização e tradução de mRNA dentro dos neurônios é essencial para vários mecanismos da função neuronal, incluindo conectividade neuronal, plasticidade sináptica e resposta a lesões. Devido à polaridade extrema dos neurônios, muitas dessas funções dependem da capacidade dos axônios de traduzir localmente transcritos específicos. No entanto, quantificar essas populações subcelulares de RNA continua sendo tecnicamente desafiador. Aqui, descrevemos uma abordagem reprodutível para obter compartimentos somáticos e enriquecidos axónicamente separados a partir de neurônios de roedores cultivados e para quantificar a expressão de mRNA específica de compartimento. Neurônios embrionários ou adultos primários de roedores foram cultivados em inserções com membrana porosa de tamanho 1-3 μm. Essas membranas são permissivas apenas aos axônios, permitindo a separação física dos compartimentos somático e axônico. O RNA foi então isolado separadamente do neurônio inteiro e das frações enriquecidas em axônios, que foram ainda usados para a PCR digital de gotículas de transcriptase reversa (RTddPCR) com primers específicos para genes. Esse sistema oferece uma comparação quantitativa absoluta entre compartimentos subcelulares, permitindo a detecção de alta sensibilidade de transcritos localizados. Essa abordagem mede a abundância de RNA em regime estacionário e facilita o exame das mudanças do RNA axonal ao longo do tempo em resposta a fatores neurotróficos, modelos de estresse ou lesão. A combinação de compartimentalização física e análise RTddPCR reduz a contaminação cruzada e fornece números exatos de cópias de transcritos raros, oferecendo alta sensibilidade, reprodutibilidade e detecção de mRNAs de baixo número de cópias que controlam o crescimento e regeneração dos axônios. Esse método também funciona com testes posteriores, como medir a síntese de proteínas, estudar a estabilidade do RNA e realizar experimentos de perturbação usando siRNA ou medicamentos que bloqueiam certas proteínas. Importante, essa técnica pode ser adaptada para diferentes subtipos neuronais, estágios de desenvolvimento ou modelos de lesão. De modo geral, essa abordagem é flexível, sensível e reprodutível para estudar a base molecular da localização de mRNA axonal e como ela afeta a função neuronal e os mecanismos da doença.

Introduction

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Os neurônios são uma das células mais complexas e polarizadas da biologia. Eles têm processos longos que às vezes podem alcançar distâncias superiores a um metro. Essa polaridade complica a comunicação celular e a homeostase das proteínas de maneiras distintas. Uma abordagem refinada para atender a esses requisitos é transportar mRNAs para compartimentos remotos, como axônios e dendritos, facilitando sua tradução de maneira regulada em resposta a sinaislocalizados 1,2,3. A tradução local permite que axônios sintetizem proteínas de forma espaço-temporal. Esse processo é crucial para o desenvolvimento axonal, plasticidade sináptica, regeneração após lesão e respostas a estímulos de desenvolvimento eextracelulares 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

A capacidade de analisar as funções de mRNAs localizados em axônios é crucial para entender seus papéis tanto na função neuronal normal quanto no contexto da fisiopatologia. A desregulação da tradução axonal de mRNA tem sido associada a várias doençasneurodegenerativas16, como esclerose lateral amiotrófica (ELA)17,18,19, atrofia muscular espinhal (SMA)20,21 e doença de Alzheimer (DA)22. A regeneração axonal após danos depende fortemente da rápida e precisa tradução das proteínas do citoesqueleto, moléculas sinalizadoras e receptores 3,23,24,25,26,27,28. Apesar desses conceitos inovadores, a disciplina continua enfrentando desafios para quantificar e capturar efetivamente populações de mRNA específicas de axônios.

Um dos desafios da transcriptômica axonal é fazer com que soma e axônios se separem de forma limpa. Como a maioria dos mRNAs é enriquecida no soma, mesmo pequenas quantidades de contaminação pelo corpo celular podem afetar os resultados ao avaliar o conteúdo axonal de um determinado mRNA. Técnicas convencionais, incluindo câmaras microfluídicas 29,30,31,32 ou câmaras Campenot 33, proporcionam crescimento axonal direcional e separação clara entre os dois compartimentos, mas o rendimento axonal pode ser muito baixo para estudos bioquímicos como sequenciamento de RNA a granel (RNA-seq), co-imunoprecipitação de RNA seguida de sequenciamento de RNA ou reação em cadeia quantitativa da polimerase (qPCR). RNA-seq em massa e qPCR, por mais benéficas que sejam, frequentemente carecem da sensibilidade necessária para identificar com precisão transcritos de baixa cópia nos axônios, resultando na estimativa incorreta de espécies fisiologicamente significativas.

Para enfrentar esses desafios, nós e outros usamos inserções de membrana permeáveis para a separação física dos axônios e do somata 34,35,36,37,38,39,40,41. Esses inserts permitem que os neurônios se desenvolvam em uma superfície microporosa, e os axônios podem se estender para o compartimento inferior através deles, mas não para o soma. Essa arquitetura básica, mas eficaz, possibilita cultivar um enorme número de neurônios com uma clara separação física de soma e axônios. O método baseado em membrana é importante porque evita os problemas técnicos que vêm com dispositivos microfluídicos e fornece grandes quantidades de material axonal que pode ser usado em estudos moleculares e bioquímicos. O sistema de inserção também é fácil de usar para coisas como lesões mecânicas, o que o torna útil em muitos ambientes experimentais relacionados ao reparo neural. O método descrito aqui otimiza ainda mais o rendimento e a pureza neuronal ao refinar condições de cultura, ajustar características dos poros da membrana e incorporar validação baseada em PCR digital de gotículas de transcriptase reversa (RTddPCR) para amostras de RNA axonal de baixo rendimento.

Também é importante garantir que as frações axonais sejam puras. Só extraímos axônios da câmara inferior após remover cuidadosamente qualquer material somático remanescente da superfície superior. A validação do primer mostra forte enriquecimento de marcadores axonais e nenhum ou desprezível marcador somático. A confirmação molecular reforça essa distinção: frações axonais são enriquecidas com mRNAs axonais reconhecidos, como Gap43, e menor expressão de Actγ42. Isso mostra que o sistema de inserção produz amostras axonais com conteúdo insignificante de soma, que são boas para exames adicionais.

Após isolar frações axonais enriquecidas, o próximo obstáculo é medir mRNAs que existem em números de cópias extremamente baixos. O pouco material inicial proveniente das frações axonais e a presença de mRNAs de baixo número de cópias nos axônios ultrapassam os limites de sensibilidade da PCR quantitativa da transcriptase reversa convencional (RT-qPCR), que utiliza curvas padrão para quantificação. Além disso, a RT-qPCR também não fornece os números absolutos de cópias de um histórico escolar específico. Já o RTddPCR separa amostras de cDNA em milhares de gotículas, o que ajuda a obter uma contagem exata de transcritos usando estatísticas de Poisson. Isso torna possível encontrar transcritos de forma confiável, mesmo que apenas algumas cópias deles possam estar presentes em um único nanograma do RNAtotal 5,6,7,43.

Neste manuscrito, apresentamos uma abordagem simplificada, que inclui métodos para cultivar diferentes neurônios adultos ou embrionários de roedores em insertos, isolamento de RNA de compartimentos inteiros e enriquecidos com neurônios em comparação com ônicos, verificação da pureza axonal e quantificação absoluta baseada em RTddPCR de cópias de mRNA. Esses métodos podem ser utilizados para determinar os níveis de mRNAs específicos, que se localizam nos axônios sob condições basais, e como eles mudam durante a axotomia ou em resposta à estimulação do fator de crescimento ou sinais neurotóxicos. Ao combinar esse método com co-imunoprecipitações proteicas, também é possível avaliar a dinâmica dos complexos ribonucleares de proteínas (RNP) nos axônios. Por exemplo, usamos extensivamente esse método para estudar os mRNAs, que estão presentes nos grânulos axonais da proteína ativadora da GTPase Ras (G3BP1). G3BP1 é um componente central dos grânulosde estresse 44, e nossos estudos anteriores mostraram que ele inibe a síntese de proteínas axonais e, por sua vez, bloqueia tanto a regeneração dos axônios do SNP quantoda SNC 5. Além disso, esse método pode ser utilizado para investigar o papel da desregulação da translação axonal em várias condições fisiopatológicas, incluindo ELA, AMS e DA.

O objetivo deste estudo é criar e testar um método sensível, reproduzível e escalável para medir mRNAs axonais. Ao combinar culturas compartimentadas baseadas em inserção com quantificação baseada em RTddPCR, fornecemos ao campo uma solução para os problemas duradouros da transcriptômica axonal. Essa metodologia não só permitirá descobertas essenciais sobre a tradução local, mas também estabelecerá uma base para investigações translacionalistas focadas em intervenções terapêuticas em reparação neural e neurodegeneração.

Protocol

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1. Preparar os inserts para semeadura de células

  1. Coloque os inserts com o tamanho de poro apropriado em uma placa de 6 poços.
    NOTA: Use um tamanho de poro de 1 μm para separar axônios do soma e um tamanho de poro de 3 μm para separar todos os neuritos (axônios e dendritos) do soma.
  2. Adicione 100 μg/mL de poli-L-lisina (PLL) à placa de 6 poços de modo que ela toque a parte inferior dos inserts e o topo dos inserts (2 mL/poço e 1 mL/insert).
  3. Incube durante a noite a 37 °C.
  4. Lave os poços (o fundo dos inserts) e o topo dos inserts com água ultrapura estéril - 4 lavagens × 5 minutos.
  5. Para neurônios do gânglio dorsal (DRG), adicione 5 μg/mL de laminina (2 mL/poço e 1 mL/inserto) e incube por pelo menos 1 hora a 37 °C. Certifique-se de que tanto a parte superior quanto a inferior do encarte estejam revestidas de forma uniforme.
  6. Lave com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4) contendo 100 U/mL de Penicilina/Estreptomicina - 2 lavagens × 5 min.
  7. Prossiga com a dissecação e semente em torno de 1 × 106 células/insert para os neurônios embrionários corticais5, hipocampais45 e os neurônios colinérgicos basais do cérebroanterior 31,32. Para DRGs de rato adulto, placar 6-8 DRGs/insert 5,7 (Figura 1).

2. Coleta de frações subcelulares neuronais a partir de inserções de 6-poços

  1. Aliquota de 250 μL de TRIzol cada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por inserto e um poço/inserto de uma placa de 6 poços. Deixe isso de lado.
  2. Em outra placa de 6 poços, adicione 2 mL/poço de PBS estéril. O número de poços/placas deve ser proporcional ao número de inserts.
  3. Aspire o meio de cultura da parte superior e inferior do inserto e transfira-o para uma placa de 6 poços contendo PBS.
  4. Usando pinças, coloque delicadamente o insert e adicione 2 mL de PBS por cima. Aspire a mídia da parte superior e inferior do insert e repita. No total, lave duas vezes com PBS e deixe em PBS fresco (1 mL e 2 mL na parte superior e inferior do inserto, respectivamente).
  5. Isolamento de toda a fração neurônica
    1. Usando um raspador de células estériles, raspe toda a fração de neurônio (parte superior do insert). Aplique pressão suficiente para que as células comecem a se soltar, mas a membrana não se quebre (Figura 1).
    2. Colete o neurônio inteiro do insert e transfira-o para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Centrifuge o tubo a 10.000-15.000 g por 2 minutos.
    4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o lisado em 250 μL de TRIzol.
    5. Rotule esse tubo como a fração inteira do neurônio.
    6. Continue com a coleta da fração de neurita.
  6. Isolamento da fração neurita
    1. Pegue um cotonete estéril e, usando uma das extremidades, mova-se em um padrão em ziguezague de cima para baixo muito lentamente em todo o lado do neurônio. Gire o inserto 90 graus e repita o processo com a outra ponta do swab (se usar um swab duplo, ou use um swab novo para um de um lado só). Descarte esse swab (Figura 1).
    2. Use um novo swab e mova-se em círculos concêntricos, começando pelo meio do inserto e indo para fora. Certifique-se de limpar também as paredes (circunferência).
    3. Inverta o inserto de membrana (lado da neurita virado para cima) e corte a membrana usando uma nova lâmina estéril enquanto a segura com pinças. Certifique-se de deixar ~2-3 mm na periferia.
    4. Coloque a membrana cortada na placa de 6 poços contendo TRIzol com o lado da neurita voltado para baixo. Certifique-se de que está submerso.
    5. Colete o TRIzol contendo o lisato de neurita da placa de 6 poços e transfira para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
  7. Para lisados de neurônios inteiros e neuritos, proceda ao isolamento de RNA ou guarde os lisados a -80 °C para processá-los depois.

3. Isolamento e quantificação de RNA

  1. Isolamento de RNA
    NOTA: Para esta parte, sempre trabalhe em um ambiente livre de RNase, com plásticos dedicados e estériles e luvas.
    1. Adicione 0,2 mL de clorofórmio por 1 mL de TRIzol, agite vigorosamente por 15 segundos e incube por 2-3 minutos em temperatura ambiente. Centrifuge a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C para separar em camadas: orgânica, interfásica e aquosa (contendo RNA).
    2. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo, evitando a interfase. Para precipitar o RNA, adicione 1 volume de isopropanol e misture suavemente. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente (ou por mais tempo a -20 °C para maior rendimento) para precipitar RNA. Centrifuge a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C para aplicar RNA em pellet.
    3. Descarte o sobrenadante e lave a pastilha com 1 mL de etanol a 75%. Brevemente vórtice e centrífuga a 7.500 × g por 5 minutos a 4 °C.
    4. Dissolvendo RNA: Remova cuidadosamente o lavado com etanol e seque o pellet ao ar por 5-10 minutos, evitando o ressecamento total. Resuspenda o pellet em um pequeno volume de água livre de RNase ou 1x tampão Tris-EDTA (TE), incubando a 55-60 °C para dissolução completa. Armazene RNA purificado a -80 °C.
  2. Quantificação de RNA usando o ensaio RiboGreen
    NOTA: O ensaio RiboGreen (abaixo) utiliza um corante fluorescente específico para ácidos nucleicos, oferecendo maior sensibilidade, especificidade e capacidade de detectar RNA intacto do que os métodos de absorção UV. Considere o tratamento com DNase se a contaminação por DNA for um problema.
    1. Prepare 1x TE buffer, dilua o buffer TE 20x fornecido 20 vezes com água sem RNase. Prepare soluções de trabalho RiboGreen e proteja o corante sensível à luz com papel alumínio. Dilua o corante concentrado 1:200 em 1x TE para o ensaio de alta gama (10 ng/mL-1 μg/mL), ou 1:2000 em 1x TE para o ensaio de baixo alcance (2,5 ng/mL-50 ng/mL). Prepare padrões de RNA por diluição serial do padrão de RNA do kit em 1x TE para cobrir a faixa amostral esperada. Execute padrões em triplicado.
    2. Prepare as amostras diluindo amostras de RNA em 1x TE para ajustar à faixa dinâmica do ensaio. Faça exames em triplicado.
    3. Adicionem volumes iguais de solução de trabalho RiboGreen e padrão ou amostra de RNA (por exemplo, 100 μL cada). Incube por 2 a 5 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. Meça a fluorescência usando as configurações apropriadas (excitação ~500 nm, emissão ~525 nm). Meça e subtraia uma leitura em branco do reagente (1x TE + corante RiboGreen).
    4. Analisar e quantificar: Plote uma curva padrão usando os valores de fluorescência dos padrões em relação às suas concentrações. Use essa curva para determinar a concentração de RNA nas amostras (Figura 2).

4. Síntese de cDNA

  1. Descongele todos os componentes no gelo. Misture cada tubo suavemente com um movimento rápido e gire para baixo brevemente antes de usar. Em um tubo de PCR sobre gelo, combine os seguintes componentes para cada reação:
    Mistura master RT (5x): 4 μL
    Amostra de RNA: variável (até 1 μg de RNA total)
    Água livre de nuclease: até 20 μL de volume total
    NOTA: Para um controle sem molde (NTC), substitua a amostra de RNA por água livre de nuclease.
  2. Misture e gire suavemente os tubos para coletar o conteúdo no fundo e execute o programa termociclador.
    Recozimento do primer: 25 °C por 2 min
    Síntese de cDNA: 55 °C por 10 min
    Inativação térmica: 95 °C por 1 min

5. Design e validação de primers

NOTA: O design dos primers RTddPCR geralmente segue os mesmos princípios do qPCR quantitativo, mas requer atenção adicional para garantir a separação clara das gotículas positivas e negativas. Use ferramentas de design de primers da NEB, IDT ou ThermoFisher para facilitar esse processo. Um ensaio RTddPCR bem-sucedido é definido por alta especificidade e amplificação robusta, que gera uma separação distinta entre gotículas amplificadas (positivas) e não amplificadas (negativas). Os seguintes IDs de acesso NCBI RefSeq foram usados para projetar primers de PCR:

Atuação: NM_001127449.1
Atacante 1: CAGTCTAACAGGGGGGGGGAAAG
Reverso 1: CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC
Duração do Amplicon: 98
Avançado 2: GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT
Reverso 2: GACTTTCCCCCCCTGTTAGAC
Comprimento do Amplicon: 118

Gap43: NM_017195,3
Atacante 1: GGAAATTCTTGCACTGTACCC
Reverso 1: GACTCCTCAGAACGGAACAT
Comprimento do Amplicon: 122
Atacante 2: CAGTCATCTTGGGAAATTCTTGC
Reverso 2: CATTGCACACACACACTTGG
Comprimento do Amplicon: 116

  1. Projete um primer com o comprimento recomendado de 18-30 pares de bases e um teor de GC de 40-60%. Certifique-se de que a temperatura de fusão (Tm) esteja entre 55-65 °C, e que os espoletadores direto e reverso estejam entre 2 e 5 °C um do outro. Incorpore uma grampa GC, uma ou duas bases G ou C nas últimas cinco bases na extremidade de 3′, para aumentar a especificidade da ligação, mas evite longas tiradas de Gs ou Cs.
  2. Valide a especificidade dos primers usando ferramentas de alinhamento como a Ferramenta Básica de Busca de Alinhamento Local (BLAST) do National Center for Biotechnology Information (NCBI) para garantir que os primers se liguem apenas à sequência alvo pretendida. O design amplifica entre 50 e 200 pares de bases, com ~100 pares de bases como ótimos, já que produtos mais curtos amplificam de forma mais eficiente e permanecem distinguíveis dos primer-dímeros.
    NOTA: Neste estudo, os produtos de PCR curta são tipicamente amplificados com maior eficiência do que os mais longos no RT-ddPCR.
  3. Minimize os dímeros de primer projetando primers com teor de GC de 50-60%, evitando estruturas secundárias e complementaridade de 3'. Durante a validação do primer, utilize eletroforese em gel de agarose e sempre utilize um controle sem molde para avaliar os dímeros do primer.
  4. Evite projetar primers em regiões do molde com alta probabilidade de formação de estruturas secundárias, pois isso pode interferir na eficiência da amplificação.

6. RTddPCR

NOTA: Use o Sistema QX200 ddPCR (Bio-Rad) para realizar a RTddPCR conforme as instruções do fabricante e conforme descrito anteriormente por Das et al. (2022)43, com alguns ajustes menores para melhorar a reprodutibilidade do ensaio.

  1. Prepare reações RTddPCR com mistura universal pronta para uso e primers específicos para alvo dddPCR, usando cDNA apropriado.
  2. Gerar as gotículas usando o gerador de gotas.
  3. Leia a fluorescência do endpoint com o leitor de gotículas e analise os dados com o software embutido.
  4. Empregue as seguintes medidas de controle de qualidade para garantir quantificação precisa e formação de gotículas reproduzíveis:
    1. Execute conjuntos de primers consistentes na mesma fileira ou coluna para minimizar os efeitos das placas.
    2. Prepare misturas master para reduzir a pipetagem em volumes pequenos.
    3. Pipete a baixa vazão para evitar bolhas e utilize pipetas multicanal para dispensar amostras de forma uniforme.
    4. Manuseie as placas com cuidado após a geração de gotículas e fele imediatamente para evitar a evaporação.
    5. Prepare todas as reações no gelo e evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento para reagentes.
    6. Inclua controles sem molde para cada conjunto de primer para monitorar a contaminação.
    7. Exclua poços contendo menos de 10.000 gotículas aceitas da análise.
    8. Realize réplicas técnicas para todas as amostras para garantir a reprodutibilidade.
  5. Inspecione manualmente os gráficos de amplitude de fluorescência de gotículas para verificar a precisão do limiar automático.

Results

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Neurônios corticais do roedor embrionário primário, neurônios do hipocampo e BFCNs placados em insertos de 1 μm revestidos com PLL aderem robustamente e estendem as neuritas através da membrana por 5 a 7 dias in vitro (DIV). Em 11 DIV, as culturas apresentam redes densas. Para DRGs de rato adulto, adicionar uma camada de laminina a insertos de 3 μm revestidos com PLL ajuda a alcançar extensão axonal comparável de 5 DIV. Essas observações confirmam a capacidade dos insertos de suportar o crescimento neuronal a longo prazo e fornecer material axonal suficiente para extração de RNA a jusante. Em caso de necessidade de escalar, combinamos vários inserts para fornecer material suficiente.

A extração de TRIzol a partir de inserções individuais gera RNA suficiente para transcrição reversa e subsequente ddPCR. A quantificação RiboGreen confirma rendimentos consistentes de RNA a partir de frações inteiras de neurônios (212,85 ng/insert) e rendimentos menores a partir de frações de neurita (42,75 ng/insert) (Figura 2). Geralmente obtemos um RNA ~5-7 vezes da fração inteira do neurônio em comparação com a fração enriquecida com neuritas.

Todos os primers são validados antes dos experimentos RTddPCR. Para cada transcrito alvo, pelo menos dois conjuntos de primers são ordenados e testados usando PCR convencional em cDNA gerado a partir das mesmas amostras neuronais. O par de primers que produz a faixa mais forte e específica é selecionado para RTddPCR (Figura 3A). Por exemplo, escolhemos o conjunto de primers 1 para Gap43. Em casos de resultados ambíguos, como os obtidos para Actγ, realizamos uma PCR em gradiente para otimizar as temperaturas de recozimento (Figura 3B). Isso garante que apenas primers bem validados sejam usados para quantificação absoluta, reduzindo a probabilidade de artefatos na separação de gotículas.

O procedimento de raspagem e swab separa de forma confiável os compartimentos somático e neurítico. RNA isolado de frações inteiras de neurônios mostra enriquecimento de transcritos, como Actγ 46,47,48,49 (Figura 4). Em contraste, frações de axônio/neurita produzem RNA total marcadamente menor, consistente com seu volume restrito, mas apresentam enriquecimento de transcritos conhecidos por se localizarem em processos distas, como Gap43 (Figura 4). A detecção cruzada mínima de transcritos restritos ao soma indica alta pureza compartimental quando os inserts são manuseados cuidadosamente e revestidos com densidade ideal.

Os resultados positivos são caracterizados por: (1) morfologia neuronal intacta com clara extensão axonal, (2) separação limpa dos compartimentos sem ruptura da membrana, (3) primers validados que produzem separação distinta entre gotículas positivas e negativas, e (4) sinais fortes de RTddPCR para transcritos axonais. Experimentos subótimos resultam em baixo rendimento de RNA, contaminação cruzada evidenciada por marcadores soma em frações de neurita ou artefatos RTddPCR, como aumento da "chuva" de gotículas devido à dimerização do primer. Esses problemas geralmente estão ligados a danos na membrana do inserto, pressão excessiva de raspagem ou otimização inadequada da temperatura de recozimento do primer.

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Figura 1: Visão geral do isolamento de RNA específico por compartimento usando inserções de membrana. Neurônios de roedores foram cultivados em inserções semipermeáveis com tamanho de poro de 1 a 3 μm, o que permite a extensão de neuritas enquanto restringe o soma. Para a preparação de neurônios inteiros, as células do compartimento superior foram raspadas usando um raspador celular estéril, peloteadas e então lisadas em TRIzol para isolamento de RNA, síntese de cDNA e RTddPCR. Resíduos celulares foram removidos da membrana inserida com um cotonete estéril. Para a preparação de neuritas, a membrana de inserção, agora contendo apenas neuritas, foi invertida e cortada com uma lâmina de bisturi, e imersa diretamente em TRIzol, seguida de isolamento de RNA, síntese de cDNA e RTddPCR. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Curva padrão de concentração de RNA usando o ensaio RiboGreen. (A) A intensidade de fluorescência foi medida usando o ensaio de quantificação de RNA RiboGreen em uma série de padrões de RNA diluídos. Uma análise de regressão linear revelou uma forte correlação entre a concentração de RNA e o sinal de fluorescência (R² = 0,9956). O valor R² próximo a um demonstra excelente linearidade e confiabilidade do ensaio RiboGreen para quantificação precisa de RNA. (B) Usando a equação (y=19,738x + 14,905) para a inclinação obtida em A, o RNA total foi calculado para cada fração. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Validação do primer por PCR e eletroforese em gel de agarose. (A) Produtos de amplificação por PCR usando cDNA para Actγ e Gap43 foram resolvidos em um gel de agarose a 2% para avaliar a especificidade do primer. Para cada gene, dois conjuntos independentes de primers (conjunto 1 e conjunto 2) foram testados. Marcadores de tamanho de DNA (escadas) são mostrados em faixas adjacentes com pesos moleculares indicados (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Bandas simples distintas do tamanho esperado confirmam amplificação bem-sucedida e especificidade dos conjuntos de primários selecionados. (B) A amplificação por PCR foi realizada usando o primer Actγ ajustado 2 ao longo de um gradiente de temperatura (55-65 °C) para determinar a temperatura ideal de recozimento. Os produtos amplificados foram resolvidos em um gel de agarose a 2% ao lado de uma escada de DNA (faixa 2, tamanhos indicados). Bandas simples consistentes do tamanho esperado foram observadas em toda a faixa testada, com a amplificação mais forte detectada a 55 °C, sugerindo que essa é a temperatura ideal para esse conjunto de primers. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Análise RTddPCR de transcritos selecionados e quantificação de cópias de mRNA. (A,B) Gráficos de amplitude representativos unidimensionais mostrando separação de gotículas para (A) Actγ e (B) Gap43. Cada ponto representa uma única gota, com gotas azuis indicando amplificação positiva e gotas cinza indicando amplificação negativa. O eixo Y representa a amplitude, e o eixo X indica a posição do poço na placa ddPCR. A clara separação entre gotículas positivas (azuis) e negativas (cinzas) confirma a detecção robusta dos transcritos alvo com os conjuntos de primers indicados. (C) Tabela resumindo o número de cópias/μL e cópias por ng de RNA total para transcritos Actγ e Gap43 em frações inteiras de neurônios e neuritas. As estimativas do número de cópias foram obtidas a partir da quantificação absoluta usando contagens de gotículas ddPCR (mostradas nos painéis A, B). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussion

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Vários passos são cruciais para a reprodutibilidade. O revestimento do insert deve ser uniforme para promover a adesão neuronal; revestimento incompleto leva a um crescimento pobre de neuritos/axonais. A densidade de placas celulares é igualmente importante, pois densidade excessiva aumenta o cruzamento dendrítico, enquanto o revestimento esparso gera RNA axonal insuficiente. A sequência de raspagem e swab deve ser realizada com precisão: pressão insuficiente causa contaminação somática, enquanto pressão excessiva corre o risco de danificar o insert.

A validação do primer representa outro passo crítico. Executar dois conjuntos independentes de primers para cada transcrito permite a seleção do par mais confiável, enquanto a PCR por gradiente pode refinar ainda mais as temperaturas de recozimento. Essa prática reduz a formação de primer-dímero, aumenta a clareza das gotículas e garante a quantificação reprodutível entre réplicas biológicas. Embora essa abordagem alcance alta pureza compartimental, a contaminação traço de material somático não pode ser totalmente excluída. Os rendimentos de RNA axonal são inerentemente baixos, limitando o escopo de análises que exigem alta entrada, como o sequenciamento completo do transcriptoma. Uma limitação crítica desse método é sua incapacidade de abordar a localização de transcritos entre axônios distais versus proximais. Embora extensões gliais ou endoteliais através dos poros da membrana tenham sido relatadas sob certas condições, nosso sistema de cultura minimiza essa possibilidade. Em culturas adultas de DRG, a adição de citosina β-D-arabinofuranosídeo (Ara-C)5,7 e o uso de meios sem soro para outras culturas neuronais (cortical, hipocampal e BFCNs)5,45 restringem efetivamente a proliferação de células gliais e endoteliais. Além disso, as membranas rígidas de policarbonato ou tereftalato de polietileno (PC/PET) usadas aqui são não elásticas e não permissivas à migração celular ativa. Além disso, usamos inserções de tamanho de poro de 3 μm para culturas DRG para permitir a passagem de axônios de grande diâmetro. Em contraste, para culturas corticais ou BFCN, usamos inserts de poro de 1 μm, o que restringe ainda mais a migração da glia. Essas propriedades distinguem nosso sistema dos microdispositivos baseados em PDMS que suportam migração endotelial por poros flexíveis. De acordo com relatóriosanteriores 34,35,36,40, a validação molecular neste estudo confirma forte enriquecimento de transcritos axonais (por exemplo, Gap43) e detecção negligenciável de marcadores somáticos (por exemplo, Actγ), apoiando a especificidade neuronal do material que atravessa a membrana. Como a restrição física não aboliu completamente a migração glial, os pesquisadores também devem usar o Gfap como marcador negativo.

Comparado aos dispositivos microfluídicos, o sistema de inserção é mais simples, mais escalável e compatível com fluxos de trabalho rotineiros de cultura. Evita equipamentos especializados, ao mesmo tempo em que permite a separação axônion-soma reprodutível. Ao acoplar inserções com RTddPCR, esse método oferece acessibilidade e alta sensibilidade, permitindo a quantificação absoluta de transcritos que frequentemente estão abaixo dos limiares de detecção de qPCR. Esse protocolo é bem adequado para sondar alterações na localização de transcritos axonais, avaliar a tradução local em resposta a estímulos de desenvolvimento, neurotóxicos ou de lesão, e também para estudar defeitos de transporte de RNA implicados em doenças neurodegenerativas ou distúrbios do neurodesenvolvimento. Refinamentos futuros podem incluir RTddPCR multiplexado para quantificação simultânea de múltiplos mRNAs, ou integração com abordagens de sequenciamento de RNA de baixa entrada para expandir a cobertura do transcriptoma. Além disso, adaptar esse sistema para neurônios humanos derivados de iPSC pode estender suas aplicações para modelagem de doenças e estudos regenerativos.

Disclosures

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PKS detém patentes dos EUA sobre o uso do peptídeo permeável à célula G3BP1 para regeneração de axônios e neurodegeneração. Os outros autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

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Esse trabalho foi apoiado por bolsas do Merkin Peripheral Neuropathy and Nerve Regeneration Center (para P.K.S.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Inserções de cultura celular para placas de 6 poços, 1.0  μ m Tamanho dos poros, estérilCorning353102Consumíveis
Inserções de cultura celular para placa de 6 poços, 3,0 & nbsp; μ m Tamanho dos poros, estérilCELLTREAT230603Consumíveis
Levantador de Células com Lâmina EstreitaVWR76036-006Consumíveis
Placas de cultura de tecidos CELLSTAR de 6 poçosVWR82050-842Consumíveis
ddPCR 96 Poços Placas  Bio-rad12001925Consumíveis
ddPCR Óleo Leitor de Gotas Bio-rad1863004Reagentes
Cartuchos DG8 para Gerador de Gotículas QX200/QX100Bio-rad1864008Consumíveis
LamininaGibco/Fisher Scientific23017-015Reagentes
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010LReagentes
Microplacas para preto à base de fluorescência, 96 poçosThermo FisherM33089Consumíveis
Vedação térmica da placa PCR, folha de alumínio, perfurávelBio-rad1814040Consumíveis
PolilisinaSigmaP1274Reagentes
PTC Tempo 96 Thermal CyclerBio-rad12015382Equipamento
Software QuantaSoftBio-RadSoftware de análise de dados por PCR
Kit de Ensaio de Reagente e RNA Quant-it RiboGreenThermo FisherR11490Reagentes
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-rad1864034Reagentes
Óleo de geração de gotículas QX200 para EvaGreenBio-rad1864005Reagentes
Gerador de Gotículas QX200Bio-rad17005227Equipamento
Leitor de Gotas QX200Bio-rad17005228Equipamento
Reagente TrizolInvitrogen15-596-026Reagentes

References

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