Artigo de método

Sangue de carrapato se alimentando através de uma membrana artificial em uma câmara impressa em 3D em pesquisa de carrapatos Ixodid

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DOI:

10.3791/69606

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20 de março de 2026

 , 
1Department of Entomology, University of Arizona, 2Department of Entomology, Kansas State University

Neste artigo

Resumo

Este método descreve o desenvolvimento de um sistema de alimentação sanguínea de carrapatos in vitro , incorporando uma câmara impressa em 3D e uma membrana de silicone fabricada em laboratório. O sistema permite a alimentação artificial de carrapatos, facilitando a amostragem em vários estágios de alimentação e utilizando baixos volumes de sangue, fornecendo uma ferramenta inestimável para estudar carrapatos ixódidas.

Resumo

Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para um sistema de alimentação de carrapatos através de uma membrana artificial de silicone utilizando uma câmara impressa em 3D criada a partir de resina fotopolimérica de alta resolução. O método inclui o projeto da câmara de alimentação, preparação da membrana de silicone, montagem do sistema e condições otimizadas para a alimentação dos carrapatos. Os carrapatos são um dos principais vetores de doenças nos Estados Unidos e no mundo todo. A pesquisa sobre carrapato é essencial para desenvolver estratégias eficazes para prevenir e reduzir a incidência de doenças transmitidas por carrapatos. Como ectoparasitas hematófagos obrigatórios, os carrapatos precisam se alimentar de sangue para sobreviver e, assim, transmitir doenças, tornando a alimentação com sangue um processo fundamental ao investigar as interações vetor-hospedeiro, transmissão de patógenos e a biologia, fisiologia e morfologia anatômica dos carrapatos. Sistemas de alimentação para carrapatos com membrana de silicone têm sido amplamente utilizados e aprimorados nas últimas décadas. No entanto, muitos sistemas existentes são adaptados para uma única espécie de carrapato, estágio de vida ou conjunto específico de condições. O sistema de alimentação de carrapatos descrito neste protocolo tem sido usado com sucesso para obter espécimes parcialmente alimentados e totalmente inchados de várias das espécies vetores de carrapato mais importantes dos Estados Unidos, incluindo Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis e adultos de Rhipicephalus sanguineus . O sistema demonstrou sucesso no início da alimentação de adultos de Dermacentor variabilis e ninfa A. americanum, com as maiores taxas de alimentação (>85%) observadas em adultos de A. americanum. Consequentemente, a câmara de alimentação desenvolvida neste estudo é adaptável para uso com baixo volume de sangue diferente, até 100 μL, o que é crucial na transmissão de patógenos e estudos toxicológicos. A tampa transparente, com altura mínima da câmara, facilitou a observação dos carrapatos ao longo da alimentação dos carrapatos.

Introdução

Os carrapatos são ectoparasitas sanguíneos obrigatórios que podem transportar e transmitir uma ampla variedade de patógenos, incluindo bactérias, vírus e parasitas que causam doenças a animais e humanos em todoo mundo 1,2,3,4. Como o vetor de doenças número um nos Estados Unidos, ficando atrás apenas dos mosquitos no resto domundo 2,3,5, várias espécies de carrapato podem transmitir doenças associadas a patógenos, enquanto outras espécies também são conhecidas por induzir doenças não transmissíveis, como a síndrome alfa-gal (AGS, também conhecida como alergia à carne vermelha), que tem sido cada vez mais relatada mundialmentenos últimos anos 6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Pesquisas voltadas para entender a biologia, fisiologia, genética e competência em carrapato são essenciais para desenvolver estratégias que reduzam a carga econômica e de saúde pública tanto das doenças transmissíveis quanto não transmissíveis transmitidas por carrapatos. Estudar as interações entre carrapatos e hospedeiros frequentemente requer carrapatos parcialmente alimentados ou totalmente inchados para responder a questões específicas de pesquisa. Isso pode ser alcançado por meio da alimentação de animais vivos, permitindo que os carrapatos completem seu ciclo de vidacompleto 17. Embora o uso de animais vivos para alimentação de carrapatos seja altamente eficaz para desenvolver e manter colônias de carrapatos, pode ser desafiador de implementar e pode não ser aplicável a todas as hipóteses de pesquisa devido a limitações de disponibilidade de hospedeiros e regulamentações da instalação. Mais importante ainda, a implementação bem-sucedida de sistemas de alimentação in vitro para carrapato ajuda a reduzir o uso de animais vivos, o que é um objetivo significativo na pesquisa sob o marco "Animal Use Alternative (3Rs)" (substituir, reduzir, refinar)20.

Existem inúmeras vantagens em usar sistemas de alimentação de carrapatos de membrana artificial em pesquisas, proporcionando amplas oportunidades para abordar uma ampla gama de questões científicas. Estes podem ser resumidos amplamente em três grupos; (1) avaliação do efeito na variação do sangue do hospedeiro e nas interações vetor-hospedeiro, usando diferentes fontes de sangue, como a produção de alfa-gal do carrapato durante a alimentação21, (2) avaliação da toxicidade por acaricida por meio da entrega de compostos com o sangue22 e a recuperação de compostos secretados pelo carrapato durante a alimentação sanguínea23, (3) avaliação da competência do vetor por meio da entrega de patógenos por aquisição natural durante a alimentaçãosanguínea 24, 25, 26, 27, entre outros. Além disso, a natureza do sistema de alimentação por membrana artificial permite testes em larga escala de vários tratamentos e concentrações sem introduzir variações relacionadas ao hospedeiro, em pequena escala e volume, reduzindo a necessidade de animais vivos.

Sistemas de alimentação de carrapatos por meio de membranas artificiais têm sido amplamente utilizados em pesquisas e para apoiar a criação de colônias de carrapatos19, 28, 29, em alguns casos possibilitando a conclusão do longo ciclo de vida docarrapato 30, 31. Muitos protocolos sobre otimização dos sistemas de alimentação de carrapatos e seus materiais foram relatados para diferentes espéciesde carrapatos 32,33,34. No entanto, é bem sabido que a alimentação in vitro de carrapatos pode ser altamente variável dependendo das condições do sistema, dos materiais usados e, mais importante, das espéciese estágios 34 do carrapato. Além disso, muitos sistemas dependem de grandes volumes de sangue, como os sistemas de fluxocontínuo 27, que são altamente eficazes, mas podem ser caros devido aos volumes significativos de sangue necessários. Este protocolo detalha um sistema de alimentação de carrapato de membrana artificial que já demonstrou ser bem-sucedido nos estágios adultos de cinco diferentes espécies de vetor de doença de carrapato nos Estados Unidos. Isso inclui Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis, Rhipicephalus sanguineus e Dermacentor variabilis.

Protocolo

Experimentos de alimentação com carrapatos foram realizados utilizando sangue bovino desfibrinado comercialmente disponível (Hemostat Laboratories, CA, EUA) e sangue humano desfibrinado (Bioivt, CA, EUA), que coleta e processa sangue de acordo com protocolos e diretrizes aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais (IACUC) e pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB). Nenhum animal vertebrado vivo foi usado para alimentação de carrapato neste estudo. Todos os carrapatos usados neste protocolo foram adquiridos na instalação de criação de carrapatos da Oklahoma State University. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Câmaras de alimentação de carrapatos

  1. Projete as câmaras usando um software gratuito de design 3D para encaixar em uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm. Os tamanhos das peças impressas (Figura 1A) são os seguintes: corpo da câmara (parte i) 25 mm (diâmetro interno) x 20 mm (altura), com 3 mm de espessura na base e 6 mm na tampa superior (parte ii), 30 mm (diâmetro interno) x 5 mm (alto) e 3,5 mm de espessura da parede (parte iii), 31 mm (diâmetro interno) x 5 mm (alto) e 3 mm de espessura da parede.
    NOTA: O anel da tampa inclui quatro aberturas circulares de 3 mm (diâmetro) x 2 mm (altura) no topo para colocar ímãs. O topo da câmara também possui aberturas do mesmo tamanho para fixação dos ímãs (Figura 1B). O design do modelo 3D deve ser salvo como um arquivo .stl , o formato de arquivo de impressão 3D mais comum. Arquivos contendo o design 3D usado neste protocolo serão fornecidos mediante solicitação.
  2. Câmaras de impressão usando uma impressora 3D LCD 10" 14K com resinas fotopoliméricas cinza ou branca (Figura 1A) ou outra impressora/serviço 3D de alta resolução que imprime modelos 3D a partir de um arquivo .stl.
    NOTA: Este protocolo utilizava os serviços de impressão e resinas da Universidade do Arizona. O uso de resinas de alta resolução garante a criação de câmaras detalhadas e duráveis.
  3. Usando luvas, certifique-se de que não haja resíduos de resina nas peças antes da montagem, lavando e, se necessário, lixando suavemente com lixa fina (grão 180 a 200). Certifique-se de que a base plana da parte i (Figura 1A) esteja lisa. Isso garante a adesão adequada da membrana de silicone, reduzindo o risco de vazamento.
  4. Expõe todas as peças secas à luz UV por 10 minutos para garantir uma polimerização completa da resina.
    NOTA: A maioria dos serviços de impressão 3D que utilizam resinas tóxicas para impressão utiliza luz UV para curar a resina (endurecendo os modelos e removendo a toxicidade da resina); no entanto, ocasionalmente permanece "não totalmente curado". Um modelo não totalmente curado permanecerá levemente pegajoso ao toque e pode carregar resina não polarizada, que pode ser tóxica ou causar irritação durante o manuseio. Exposição extra à luz UV garantirá o endurecimento completo da resina.
  5. Cole os ímãs redondos de 3 mm x 2 mm nas fendas no topo das câmaras e nos anéis da tampa usando cola epóxi transparente. Deixe secar durante a noite em temperatura ambiente (20–25 °C/mínimo de 16 h). Certifique-se de que os polos dos ímãs estejam voltados para uma direção para corresponder à atração dos polos nos ímãs na parte superior do anel da tampa (Figura 1A, parte ii).
  6. Monte todas as peças do modelo para garantir o encaixe correto de todos os componentes, conforme mostrado na Figura 1A–C.

2. Preparação da membrana

  1. Coloque um filme plástico de 30 cm x 30 cm sobre uma superfície limpa e certifique-se de que não tenha amassos, esticando sobre uma superfície plana e prendendo as bordas com fita adesiva (Figura 2Ai).
  2. Coloque 4–5 folhas individuais de papel de limpeza de lentes sobre uma folha plástica/plástico estendida, espaçada 5 cm de distância (Figura 2Aii).
  3. Prepare a membrana de silicone usando os componentes e quantidades fornecidos abaixo.
    NOTA: As quantidades são suficientes para preparar 4–5 membranas (7 cm × 12 cm), cada uma acomodando até 5–6 câmaras de alimentação, totalizando 20–30 câmaras.
  4. Prepare a mistura de silicone combinando 15 g de silicone transparente (20–25 de dureza Shore A) e adicionando 4,5 g de óleo de silicone (30% do silicone total) e 2,9 g de hexano (19,3% do silicone total). Coloque os ingredientes em um barco plástico para pesar e misture suavemente usando uma espátula (Figura 2Aiii).
    NOTA: Garanta a formação mínima de bolhas misturando os ingredientes delicadamente.
  5. Coloque 2–3 g de mistura de silicone ao longo da borda menor do papel para lentes para fixá-lo ao filme plástico. Deixe de 5 a 10 segundos para o silicone penetrar através do papel da lente (Figura 2Aiv).
  6. Espalhe uniformemente a mistura de silicone ao longo da folha de papel da lente usando um instrumento de borda reta, como uma tampa, régua ou espátula. Certifique-se de que o objeto utilizado cubra toda a área do papel da lente (Figura 2Av). Isso garante cobertura de silicone em um único golpe, evitando ondulações e ondulações da membrana na borda do objeto.
  7. Certifique-se de que toda a mistura de silicone seja usada na membrana, retornando a ferramenta de espalhamento à posição inicial para a expansão. Como parte da mistura de silicone será retida na ferramenta de espalhamento, retornar a ferramenta para coletá-la garantirá que todo o silicone seja usado para evitar espaços (Figura 2Avi).
    NOTA: A membrana deve parecer uniformemente translúcida, sem ondulações (Figura 2B).
  8. Prepare membranas de diferentes espessuras inicialmente adicionando mais ou menos mistura de silicone, pois a espessura não pode ser medida até que as membranas estejam secas.
  9. Deixe as membranas secar ao ar durante a noite em temperatura ambiente (20–25 °C/mínimo de 16 h).
  10. Meça a espessura da membrana usando uma ferramenta digital externa de micrômetro de medição. Diferentes espessuras de membrana são usadas para diferentes espécies adultas de carrapatos, variando desde partes bucais curtas (70 μm de espessura da membrana) até peças bucais mais longas (200 μm de espessura da membrana).
  11. Remova todas as peças das câmaras previamente montadas e aplique cola de silicone na borda inferior das câmaras. Para uma colocação precisa da cola, use uma seringa de 1 ml e preencha com cola de silicone (Figura 2Ci).
  12. Coloque uma ponta de pipeta de 200 μL na ponta da seringa (em vez da agulha) para aplicação da cola (Figura 2Cii) e a rosqueie na ponta da seringa, como na ponta da agulha (Figura 2Ciii). Isso permitirá a aplicação de cola fina na borda inferior de cada câmara (Figura 2Civ).
  13. Coloque a câmara sobre a membrana (Figura 1, parte i) com um objeto pesado para garantir o assentamento. Deixe repousar durante a noite em temperatura ambiente (20–25 °C/mínimo de 16 h) (Figura 2D,E).
    NOTA: Use qualquer objeto com peso plano. Esse protocolo usava uma peça de acrílico de 2,5 kg (Figura 2E).
  14. Corte o excesso de membrana das câmaras usando tesouras curvas (Figura 3A).
  15. Antes de usar a câmara para alimentação de carrapatos, remova qualquer filme plástico restante (onde a membrana está preparada (passo 2.1) (Figura 3B).
  16. Remonte as partes da câmara, inclua uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm na parte inferior e use as tampas das antenas como tampas das câmaras, invertendo-as e colocando-as entre os ímãs (Figura 3C,D).
    NOTA: Use as tampas invertidas, pois o anel do suporte da tampa é um ajuste exato para a tampa se invertido (veja as descrições das peças na Figura 3C,D).
  17. Deixe a membrana da câmara de molho em água destilada usando a parte inferior de placas de Petri de 35 mm x 10 mm. Deixe a membrana repousar na água durante a noite em temperatura ambiente (20–25 °C/mínimo de 16 h). Como a membrana é inicialmente hidrofóbica, deixá-la de molho em água antes de adicionar sangue ajuda a reduzir a formação de bolhas aprisionadas.
    NOTA: A ausência de bolhas confirma que a hidrofobicidade foi removida.

3. Alimentação de carrapatos e preparação de sangue

  1. Faça 2–3 pequenos orifícios respiratórios nas tampas de cada câmara (a partir das placas de Petri de 35 mm x 10 mm) (parte iv na Figura 1A) mencionadas no passo 2.16 (Figura 3E). Use um bisturi de metal aquecido ou uma espátula fina de metal para furar os buracos da tampa.
    NOTA: Os orifícios de respiração permitem que a umidade seja internalizada dentro da carcaça da câmara.
  2. Suplemente o sangue com sulfato de gentamicina em uma concentração final de 50 μg/mL. Adicione antibióticos apenas ao sangue destinado ao uso dentro de 1 semana e armazene a 4 °C. Mantenha o sangue bovino (ou qualquer outro sangue animal) a 4 °C antes e depois de adicionar antibióticos.
  3. Coloque 2–3 mL de sangue em uma placa de Petri limpa de 35 mm x 10 mm, depois coloque a câmara sobre ela. Ajuste a altura da câmara para aumentar ou reduzir a quantidade de sangue usada por câmara girando o anel de ajuste (parte iii da Figura 1A). Ajuste a altura da câmara, deixando um espaço de 1–2 mm do fundo da placa de Petri até a membrana. Veja as setas magenta na Figura 4A para referência.
    NOTA: O design do anel de ajuste das câmaras permite o controle do volume de sangue utilizado. ou seja, um espaço maior entre a base da placa de Petri e a membrana exigirá um volume maior para preencher o espaço.
  4. Coloque carrapatos não alimentados dentro das câmaras em número igual de machos e fêmeas. Certifique-se de que ambos os sexos estejam sempre incluídos na câmara, pois isso pode afetar as taxas de alimentação (a Figura 4B mostra 4 machos e 4 fêmeas do adulto A. americanum dentro da câmara). No máximo 10–15 ticks por câmara (para o estágio adulto) é usado para facilitar o manuseio.
    NOTA: Ao trabalhar com estágios imaturos, o número de carrapatos é maior (20–50 ninfas por câmara, não apresentado neste protocolo).
  5. Coloque as câmaras em banhos secos cobertos a 37 °C ± 1 °C com uma fonte de umidade (ou seja, copos de água) que mantenha uma umidade relativa de 63% ± 2% (Figura 4C) sob um fotoperíodo claro-escuro de 12:12 h.
    NOTA: Esses requisitos podem variar dependendo da espécie de carrapato e das condições laboratoriais; Tente outras configurações de umidade, se necessário, e avalie a melhor configuração para o laboratório.

4. Substituição de sangue e câmaras

  1. Prepare dois frascos de esguichado com as soluções para serem usadas para enxaguar a membrana entre as trocas de sangue. Em uma garrafa, adicione uma solução de nistatina a 0,005% em água destilada; Na segunda garrafa, adicione água destilada.
  2. Após 12–16 horas, prepare novas placas de Petri com sangue fresco e coloque-as no banho seco a 37 °C antes de colocar a câmara.
  3. Enquanto o sangue fresco está aquecendo, retire a câmara do sangue usado e enxágue a parte inferior da membrana com água destilada por 3–5 segundos, depois com solução de nistatina 0,005% por 3–5 segundos para evitar a contaminação fúngica. Enxágue novamente a membrana com água destilada para remover qualquer resíduo de nistatina.
    NOTA: Esse processo leva menos de 5 minutos e não afeta a alimentação dos carrapatos presos à membrana na superfície superior.
  4. Descarte todo o sangue usado e enxágue a água em um recipiente contendo solução de hipoclorito de sódio 0,5% (10% de água sanitária). O desperdício de sangue é descartado de acordo com o protocolo de segurança institucional.
  5. Após enxaguar, coloque a câmara na nova placa de Petri com sangue.
    NOTA: Use as câmaras por até 2–3 meses antes da lavagem, desde que não haja contaminação nem vazamentos. Câmaras e membranas ficam sujas e correm risco de contaminação após 3 meses de uso sem lavagem. Isso resulta em taxas reduzidas de alimentação de carrapatos. Reutilize as câmaras por até 1,5 ano (~10 ciclos de lavagem).
  6. Reutilize as câmaras colocando-as em solução de hipoclorito de sódio 0,5% (10% de água sanitária) por até 30 minutos, depois lave com detergente. Não exponha as câmaras à água sanitária por períodos prolongados (>30 min), pois o cheiro reduz a taxa de fixação e pode enfraquecer a integridade da resina com o tempo.
    NOTA: A exposição prolongada à água sanitária torna a câmara flexível quando molhada e quebradiça quando seca, levando à quebra. Isso faz com que a câmara não dure mais do que 4–5 ciclos de lavagem, com base em observações repetidas. O uso contínuo da mesma câmara sem lavagem (até 3 meses) resulta em fixação mais rápida do carrapato (1–3 dias após a colocação na câmara) em comparação com uma câmara recentemente lavada (geralmente >7 dias para fixar). Isso provavelmente se deve ao cheiro de frass e outros feromônios de agregação dos carrapatos se alimentando na câmara, o que pode estimular a alimentação doscarrapatos 35,36.

Resultados

Espessura da membrana para cada espécie de carrapato.
As maiores taxas de alimentação de carrapatos foram observadas nas seguintes especificações de espessura de membrana para cada espécie adulta: Amblyomma americanum 100–200 μm; A. maculatum 100–250 μm; Rhipicephalus sanguineus 70–100 μm; Ixodes scapularis <150 μm, Dermacentor variabilis <150 μm. Todas as espécies de carrapatos foram mantidas sob as mesmas condições de umidade e temperatura durante a alimentação (63% de humidade relativa e 37 °C) (Tabela 1).

Carrapatos e fontes de sangue usadas neste protocolo
Todos os carrapatos foram obtidos na instalação de criação de carrapatos da Oklahoma State University e mantidos a >90% de umidade relativa a 20 °C, sob um fotoperíodo claro-escuro de 12:12 h. Todos os carrapatos foram alimentados com sangue bovino ou humano desfibrinado como parte de um projeto de pesquisa que investigou os níveis de alfa-gal (αGal) em várias espécies de carrapatos. Este estudo comparou os efeitos da alimentação em diferentes fontes de sangue dentro de um projeto mais amplo da síndrome alfa-gal (SGA) conduzido pelo grupo de pesquisa. A maioria dos espécimes de carrapato descritos aqui foi dissecada antes do engorto total para realizar análises de quantificação αGal em carrapatos parcialmente alimentados (2–5 dias de alimentação). Apenas um subconjunto dos carrapatos Amblyomma americanum (aqueles que não são necessários para quantificação de αGal) foi autorizado a se alimentar até a repleção. Embora comparações detalhadas entre as taxas de alimentação de carrapato alimentadas por bovinos e com humanos não sejam apresentadas aqui, é notável que o engorte total (ou seja, sucesso na alimentação) foi mais alcançado em carrapatos alimentados com sangue bovino. Entre os carrapatos que foram permitidos permanecer nos comedouros por longos períodos (n = 35), 15 atingiram o engorto total, representando uma taxa de sucesso alimentar de 42,8%. Dessas, 9 foram alimentadas com sangue bovino e 6 com sangue humano (60% alimentadas com bovinos contra 40% com humanos).

Taxas de sucesso na alimentação de carrapatos vs. taxas de sucesso na alimentação de carrapatos
As taxas de alimentação dos carrapatos neste estudo foram determinadas com base na aquisição de carrapapatos parcialmente alimentados (2–5 dias de alimentação), enquanto o sucesso da alimentação foi definido como o engormento total, tipicamente indicado por uma mudança na coloração do aloscutum da fêmea (dados disponíveis apenas para Amblyomma americanum). As taxas de alimentação dos machos foram definidas como alimentação contínua por mais de 2 dias (2–5 dias). As taxas gerais de alimentação foram calculadas combinando dados de carrapatos alimentados com sangue bovino e humano e calculando porcentagens de carrapatos que alcançaram 2–5 dias de alimentação ou congurgência total de carrapatos colocados nas câmaras. Carrapatos que não se fixaram ou morreram após <2 dias de ligação foram considerados para os cálculos das taxas de alimentação. Embora dados quantitativos sobre a influência da fonte de sangue nas taxas de alimentação dos carrapato não sejam apresentados, essas evidências observacionais sugerem que, para a maioria das espécies de carrapatos, a ligação e as taxas de alimentação não diferem substancialmente entre sangue bovino e humano durante o período de alimentação de 2 a 5 dias. Uma exceção foi observada para Rhipicephalus sanguineus, que apresentou taxas de alimentação menores com sangue humano entre os dias 3 e 5 em comparação com sangue bovino. As taxas de alimentação de todas as espécies de carrapatos que alcançaram alimentação parcial e ingurgitamento total usando esse sistema in vitro de alimentação de carrapatos são resumidas na Tabela 1.

Amblyomma americanum feminino classificação do peso e estágio de alimentação
Fêmeas parcialmente alimentadas de A. americanum foram classificadas com base nos dias de alimentação como: (1) não alimentadas, (2) 2–3 dias parcialmente alimentadas, (3) 4–5 dias parcialmente alimentadas e (4) inchadas (Figura 5). A fase de alimentação inchada incluiu carrapatos no início da fase de engorto rápido (com pesos variando de 48,9 mg a 109 mg) e carrapatos totalmente inchados (com pesos variando de 272,7 mg a 348,7 mg).

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Figura 1: Câmara de alimentação por carrapatos - modelo 3D e montagem impressa com membrana. Modelo 3D explodido e câmara final montada exibindo componentes individuais: (i) corpo da câmara (carcaça de carraçado), (ii) anel de suporte da tampa, (iii) anel de ajuste de altura, (iv) tampa de placa de Petri de 40 mm x 10 mm e (v) fundo de placa de Petri de 40 mm x 10 mm com sangue (A). A montagem do modelo impresso em 3D e os tamanhos individuais das peças são mostrados em mm (B). Câmara montada impressa em resina cinza de resolução 8K (C). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Preparação da membrana de silicone e do conjunto da câmara. (i) Um filme plástico de 30 cm × 30 cm preso com fita, garantindo que não haja rugas visíveis, (ii) folhas individuais de papel de limpeza de lentes colocadas sobre o enrolamento, espaçadas aproximadamente 5 cm, (iii) mistura suave dos componentes de silicone com uma espátula usando movimentos circulares, (iv) cada folha de papel de lente fixada aplicando 1–2 g da mistura de silicone ao longo de suas bordas, (v) a mistura de silicone distribuída uniformemente pelo papel da lente usando um instrumento de borda reta maior que o papel (a imagem mostra a borda de uma tampa de vidro), (vi) observe a quantidade reduzida de mistura de silicone durante a expansão, o silicone retido na ferramenta é devolvido e redistribuído para garantir uma cobertura uniforme (A). Membranas devidamente espalhadas não apresentavam bolhas de ar ou espaços (B). Preparação da seringa para aplicação de cola: (i) uma seringa de 1 mL preenchida com cola de silicone, (ii) uma ponta de pipeta de 200 μL encaixada na ponta da seringa, (iii) a ponta da pipeta parafusada para garantir uma vedação à prova de vazamentos, e (iv) a colocação da cola na borda inferior da parte i (C). A câmara é colocada sobre a membrana seca (D), e um objeto pesado (um bloco acrílico grosso pesando 2,5 kg; flecha magenta) é colocado no topo para garantir uma adesão firme (E). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Etapas finais na preparação da câmara e da membrana antes do uso. Corte das bordas da membrana que circunda a câmara usando tesouras pequenas curvas (A), remoção do filme plástico antes do uso da câmara (B), montagem final do modelo (C), colocação da câmara em uma placa de Petri de 40 mm x 10 cm contendo água, e uso da tampa da placa de Petri como tampa da câmara (D) (números i-v indicam as peças conforme especificado na Figura 1A), e tampas de câmara exibindo orifícios de respiração (indicados por pontas de flecha magenta) (E). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Configuração de alimentação com sangue e posicionamento do carrapato. Câmara colocada em um prato cheio de sangue, com o anel de ajuste de altura destacado (setas magenta) (A). Vista interna da cabine da câmara contendo um número igual de carrapatos machos e fêmeas (B). Câmaras de carrapatos posicionadas em banhos secos com uma fonte de umidade, mantendo 63% ± 2% de umidade relativa (UR) e temperatura de 37 °C ± 1 °C (C). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 5: Variação de tamanho e peso do Amblyomma americanum durante a alimentação. O tamanho não alimentado e o peso médio dos carrapato parcialmente alimentados são mostrados. As imagens representam exemplos típicos correspondentes ao peso médio registrado em cada intervalo de alimentação. A tabela acompanhante apresenta pesos médios, desvios padrão, número de carrapatos analisados, mediana e quartis 1 e 3 para cada momento de alimentação. Carrapatos alimentados por 2–3 dias mostraram uma faixa de peso de 7,4 mg (mínimo) a 19,2 mg (máximo). Os carrapatos alimentados por 4–5 dias variaram de 20,6 mg a 44,8 mg. Carrapatos no início da fase de congestão rápida e carrapatos totalmente inchados pesavam entre 48,9 mg e 348,7 mg. Imagem anexada das fêmeas de A. americanum com 4-5 dias de alimentação (ponta de seta amarela) e fêmea totalmente inchada (ponta de seta magenta). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Espécies de carrapato e sexoNúmero de carrapatos alimentados/ Total de carrapatos colocados em câmaras (Número de carrapatos mortos)Taxa de alimentação (carrapatos presos de 2 a 5 dias)Peso médio (mg) (DS)Espessura da membrana usada (μm)
Fêmeas de A. americanum85/97 (12)87.60%37.3 (54.40)*100 - 200
A. americanum machos19/22 (2)86.30%Não registrado100 - 200
Fêmeas de A. maculatum45/66 (21)68.20%122.4 (141.65)100 - 250
A. maculatum machos36/47 (11)76.60%Não registradoNão registrado
Fêmeas de R. sanguineus34/60 (26)56.60%Não registrado70 - 100
Fêmeas de I. scapularis15/23 (8)65.20%Não registrado<150
*A taxa de sucesso na alimentação avaliada em um subconjunto de carrapatos adultos Aa alimentados com bovinos é (n=35) foi de 42,8%

Tabela 1: Taxas de alimentação dos carrapatos e peso médio.

Figura suplementar 1: Alimentação em baixo volume (100 μL) dos carrapatos individuais já presos a um local da câmara 3D. Um pequeno tubo de PCR preso na base da membrana artificial com cola de silicone é preenchido com 100 μL de sangue. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Sistemas de alimentação por membrana artificial para carrapatos são ferramentas altamente eficazes para pesquisa com carrapatos e são amplamente utilizados em muitos laboratórios de pesquisa como alternativas viáveis à alimentação com animaisvivos 28,29. O principal valor desses sistemas reside em sua capacidade de entregar ou recuperar diversos agentes através da farinha de sangue, incluindo patógenos, acaricidas, compostos derivados de carrapatos e outras moléculasmoduladoras 22,23,25,27. A otimização dos sistemas de alimentação por membrana artificial poderia facilitar o desenvolvimento de criação sustentável em colônias de carrapatos, reduzindo assim a dependência de animais vivos.

O sistema de alimentação in vitro com carrapatos, descrito neste protocolo, tem sido particularmente bem-sucedido com Amblyomma americanum e Ixodes scapularis adultos. As taxas de sucesso na alimentação dos carrapatos são definidas como a proporção (ou porcentagem) de carrapatos que completam a alimentação com sucesso até o congurgimento completo. No entanto, carrapapatos parcialmente alimentados (tipicamente 3–4 dias após a iniciação da alimentação) são frequentemente suficientes para abordar hipóteses experimentais específicas para a maioria dos laboratórios de pesquisa com carrapatos que estudam a biologia ou fisiologia do carrapato. Neste protocolo do sistema de alimentação por membrana artificial, e para atender a objetivos específicos de pesquisa no projeto alfa-Gal (αGal), os termos "taxa de alimentação de carrapatos" foram usados para se referir à aquisição de carrapapatos parcialmente alimentados (2–5 dias de alimentação) e "sucesso da alimentação de carrapatos" para se referir à ingurgitação total em A. americanum. As maiores taxas de alimentação foram nas fêmeas de A. americanum (87,6%), seguidas pelos machos de A. americanum (86,3%), fêmeas de A. maculatum (68,2%), machos de A. maculatum (76,6%), fêmeas de I. scapularis (65,2%) e fêmeas de R. sanguineus (56,6%), enquanto a taxa de sucesso alimentar de A. americanum foi de 42,8% (Tabela 1). Fêmeas parcialmente alimentadas de A. americanum foram classificadas com base nos dias de alimentação em 4 categorias (fases de alimentação), modificadas em relação às publicações anterioresda seguinte forma: (1) não alimentada, (2) 2–3 dias parcialmente alimentada, (3) 4–5 dias parcialmente alimentada e (4) incheada (Figura 5). A fase de alimentação inchada incluiu carrapatos no início da fase de congurgência rápida (com pesos variando de 48,9 mg a 109 mg) e carrapatos totalmente inchados (com pesos variando de 272,7 mg a 348,7 mg) (Figura 5). Esse sistema artificial de alimentação por membrana de carrapatos possibilitou múltiplos estudos dentro do mesmo grupo de pesquisa e colaboradores, permitindo a geração de carrapatos parcialmente alimentados em sangue bovino, que posteriormente foram usados para infestar camundongos e testar a hipótese de transmissão da síndrome alfa-gal (AGS), uma alergia à carne vermelha induzida por mordidas de carrapatos, e para um estudo deN-glicômica 11,21, 37. A conveniência do sistema individual permitia o uso de diferentes fontes de sangue, e a tampa transparente e a altura mínima da câmara facilitavam a visualização dos carrapatos durante o período de alimentação sob um estereoscópio com distância suficiente de trabalho.

Modificações recentes na umidade (de banho-maria, 90% HH, para banho seco, 63% ± 2% HR), temperatura (de 37 °C a 35 °C e novamente 37 °C) e espessura da membrana (Tabela 1) permitiram a alimentação bem-sucedida de múltiplas espécies de carrapatos. Embora a temperatura e a umidade relativa (HR) sejam variáveis importantes para controlar na alimentação in vitro de carrapatos, a espessura e resistência da membrana são fatores críticos que garantem o sucesso da alimentação entre diferentes espécies decarrapato 33,38. É essencial considerar que carrapatos com peças bucais curtas, como Rhipicephalus sanguineus e Dermacentor variabilis, exigirão membranas mais finas do que aquelas com peças bucaislongas 39, como Amblyomma spp e Ixodes spp. As maiores taxas de alimentação de carrapatos foram em Amblyomma americanum e A. maculatum, com espessura de membrana de 100–200 μm; Rhipicephalus sanguineus com espessuras entre 70–100 μm; Ixodes scapularis com espessuras <150 μm, e Dermacentor variabilis <150 μm (Tabela 1). Um fator chave a se observar na alimentação com carrapatos de membrana artificial é que ainda ocorrem flutuações nas taxas de alimentação. Nesse sistema, uma leve variação de temperatura, ou seja, de 37 °C para 35 °C e de volta para 37 °C após alguns dias, frequentemente aumenta ou restaura as taxas de alimentação dos carrapatos. Além disso, a troca do banho seco para o banho-maria produz resultados semelhantes para Amblyomma spp. e Ixodes scapularis; no entanto, esse efeito não foi observado para Rhipicephalus sanguineus, que se alimenta de forma mais eficaz com 63% ± 2% de UR em banhos secos.

Outros sistemas artificiais de alimentação de carrapatos, como aqueles adaptados do sistema de fluxo contínuo de cinco partes desenvolvido por Ueti, M. et al. (USDA-ARS) e posteriormente modificado para espécies adicionais de carrapatos por Yamasaki, Y. et al., demonstraram alta eficiência, proporcionando taxas consistentemente altas de sucesso na alimentaçãode carrapatos 27,40. No entanto, estudos que exigem acesso frequente ao sistema para a dissecação de carrapatos parcialmente alimentados tornam esses sistemas menos adequados, pois a abertura e fechamento repetidos da câmara de carrapato pode ser complicado. A câmara impressa em 3D descrita neste protocolo possui uma tampa magnética de trava segura e placas de Petri individuais, permitindo fácil manuseio e inspeção visual da alimentação dos carrapatos, sem perturbar a configuração. A tampa transparente permite monitoramento visual sem perturbação e se fixa firmemente à câmara por meio de ímãs embutidos, ao contrário dos sistemas mais comuns de alimentação de carrapatos, como os otimizados pelo design original de Kröber e Guerin22,29, onde a visualização individual não é possível sem remover a câmara de alimentação do sangue, já que todas as unidades de alimentação estão integradas em uma única placa e onde os métodos usados para evitar a fuga de carrapatos Não permita visualização. Além disso, esse sistema de alimentação in vitro com carrapatos pode ser ainda mais refinado para fornecer volumes menores de sangue, específicos para o local. Por exemplo, uma vez que as fêmeas estão presas em locais de alimentação definidos, a placa de Petri inferior pode ser substituída por reservatórios miniatura, como a parte superior de um tubo de PCR de 100 μL, contendo menos de 100 μL de sangue posicionado diretamente abaixo da área de fixação (Figura Suplementar 1). Essa abordagem de alimentação de baixo volume permitiria estudos detalhados sobre aquisição e transmissão de patógenos, bem como investigações sobre os efeitos de tóxicos para carrapato e anticorpos derivados do hospedeiro. Esse protocolo demonstrou ser eficaz na obtenção de carrapatos parcialmente alimentados de várias espécies adultas. Para os fins deste estudo, as taxas de postura de ovos e de ingurgimento total não foram avaliadas neste protocolo; no entanto, otimizações adicionais estão sendo realizadas com o objetivo de obter descendentes de carrapatos, o que poderia ser alcançado com Amblyomma americanum e Ixodes scapularis com base em observações preliminares. Talvez a característica mais inovadora desse sistema seja sua flexibilidade para manipulações experimentais em pequena escala, permitindo variação controlada de tratamentos e condições ambientais, além de apoiar aplicações de criação em colônias.

A alimentação in vitro com carrapatos é uma ferramenta valiosa para pesquisadores que estudam biologia, fisiologia e competência em vetores. No entanto, a alimentação com carrapatos de membrana artificial é uma tarefa que consome tempo e trabalho. Esse protocolo, que conta com uma câmara impressa em 3D com sistema de trava segura e uma membrana simples feita em laboratório, oferece uma configuração simples assim que as câmaras são impressas e as membranas preparadas, permitindo uso prolongado. Além disso, ajustando a espessura da membrana, o sistema pode ser adaptado efetivamente a diferentes espécies de carrapatos. Otimizações adicionais, incluindo tamanho da câmara e espessura da membrana, podem permitir sua aplicação em vários estágios de vida dos carrapatos.

Divulgações

Os autores não declaram interesses financeiros materiais relacionados à pesquisa descrita neste artigo.

Agradecimentos

Os autores gostariam de reconhecer o trabalho dedicado dos estudantes e trabalhadores de graduação, Kara Golden, Sydney Ingham e Omayma Jaddou Najma, que ajudaram na alimentação dos carrapatos e na montagem da câmara e membrana.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa Luer-Lok de 1 mLBD309628Luer-Lok Tip
Silicone Transparente Avançado  General Electric2810435Silicone transparente. Essa massa forma uma barreira impermeável à água após a cura.
Cola epóxi transparenteJB Weld-Clear‎ B009EU5ZM0Número do produto Amazon
Envoltura transparente para alimentos (vedação aderente)Que bomCLO00020
Sangue bovino desfibrinadoLaboratórios HemostatDBB100
Sangue humano desfibrinadoBioIVT
Espátulas descartáveisLevGo, Inc.17211Número do produto Amazon
Incubadoras de banho secoONiLAB ScientificHB120-SNúmero do produto da Amazon. O bloco de aquecimento é invertido para obter uma superfície plana.
Sal sulfato de gentamicinaMillipore SigmaG3632-5G
Papel de Limpeza de LentesTiffenEK1546027T
Pontas de micropipeta, 200 e mu; L Biotix uTIP63300057Para seringa. Aplicador de silicone para calafetar
Luvas de nitriloInspireCOBALT-OGNúmero do produto Amazon
NistatinaBiorreagentes FisherBP2949-5
Placa de Petri 35 mm x 10 mmFalcon351008
Impressora de resina Phrozen Sonic MEGA 8K V2PhrozenB0F9NBXVVTVolume de construção de 320 x 175 x 300 mm. Pode ser comprado pela Amazon, se preferir impressão interna
Pro 8K fotopolímero  Cinza Aqua ResinaPhrozenAtravés da Universidade do ArizonaBaixa encolhimento. Alta qualidade & modelos 3D extremamente intrincados com resolução 8K.
Ímãs redondos 3mm x 2mmMealosB08NZTN426Número do produto Amazon
Fotopolímero RPG Resina Smoke WhitePhrozenAtravés da Universidade do ArizonaAlta qualidade & modelos 3D extremamente intrincados. Ótima flexibilidade com curvatura impressionante.
Óleo de siliconeMillipore Sigma378321-250ml
Design de software 3D gratuito do TinkercadTinkercadN/Ahttps://www.tinkercad.com
Pesagem de barcos (capacidade de 100 mL)Pura PontaMDO-AZOC-1030

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