Modelos Animais Padronizados Induzidos por Instabilidade para Estudos Pré-Clínicos de Osteoartrite

Resumo

Esse protocolo visa estabelecer modelos animais adequados para pesquisar osteoartrite.

Resumo

Como a doença articular mais prevalente no mundo, a osteoartrite do joelho (OA) representa um peso significativo para a saúde global, levando a pesquisas extensas sobre sua patogênese e estratégias de tratamento. Apesar de inúmeros estudos, metodologias padronizadas para o estabelecimento de modelos ainda faltam. Assim, para suprir essa lacuna, apresentamos protocolos abrangentes e reprodutíveis para desenvolver modelos animais de osteoartrite induzidos por instabilidade, especificamente o modelo de Desestabilização do Menisco Medial (DMM) em camundongos e o modelo da Fenda do Menisco Medial (MMT) em ratos. Além disso, descrevemos um procedimento simples e facilmente implementável para avaliar limiares de dor pós-operatória e estabilidade da marcha espacial, com o objetivo de promover a consistência metodológica na pesquisa pré-clínica sobre artrodroa. A validação histológica e comportamental confirmou o sucesso de ambos os modelos, já que as pontuações da Osteoarthritis Research Society International (OARSI) foram marcadamente elevadas, o comprimento do passo foi significativamente alterado e os limiares de dor mecânica foram substancialmente reduzidos nos grupos DMM e MMT em comparação com os controles, indicando degeneração articular pronunciada e hipersensibilidade. Esses resultados de validação ressaltam a reprodutibilidade e a relevância translacional dos dois modelos. Assim, ao fornecer documentação detalhada em vídeo, esse trabalho promove a padronização procedural e facilita a consistência entre laboratórios, aumentando assim a confiabilidade e a comparabilidade dos resultados de pesquisa em AO.

Introdução

A osteoartrite (OA) é um distúrbio degenerativo articular altamente prevalente e uma das principais causas de incapacidade no mundo ^1,2. Apesar de extensas pesquisas, o desenvolvimento de medicamentos OA modificadores da doença (DMOADs) eficazes tem sido relativamente^{lento 3}. Hoje é amplamente reconhecido que a AAO é uma doença multifatorial que envolve alterações patológicas complexas em múltiplos tecidos periarticulares, incluindo cartilagem articular, osso subcondral, tendões e^{sinóvia 4,5}. Pesquisas pré-clínicas eficazes sobre os diversos processos patológicos da AO requerem o uso de modelos animais bem definidos e apropriados. Embora uma variedade de modelos animais de OA tenha sido estabelecida e^relatada 6,7,8,9,10,11, muitos estudos continuam a empregar modelos animais inadequados, limitando a relevância translacional de seus achados. Para abordar essa questão, apresentamos modelos padronizados de OA induzida por instabilidade, incluindo procedimentos de Desestabilização Reprodutível do Menisco Medial (DMM) e Ruptura do Menisco Medial (MMT), em formato de vídeo para servir como referência prática para pesquisas pré-clínicas em OA e padronização de modelos.

Como relatado em estudos anteriores, a instabilidade meniscal é um fator importante que contribui para a degeneração da articulação do joelho em casos clínicos. Portanto, a instabilidade meniscal induzida cirurgicamente em camundongos e ratos serve como uma abordagem eficaz para a indução experimental da OA. Nesse contexto, apresentamos dois modelos representativos de OA induzida por instabilidade, incluindo o modelo DMM em camundongos e o modelo MMT em ratos. O modelo DMM em camundongos é particularmente valioso para investigar os mecanismos moleculares da OA, pois os camundongos são suscetíveis à manipulação transgênica, e esse modelo apresenta uma progressão gradual e prolongada da doença, imitando de perto a OA humana. No entanto, é importante notar que o modelo DMM é menos adequado para estudos focados em alterações patológicas no osso subcondral, onde modelos alternativos podem oferecer maior relevância translacional.

Além disso, estabelecemos o modelo MMT em ratos para complementar o modelo DMM em camundongos. O procedimento de TMM induz danos estruturais mais extensos envolvendo tanto a cartilagem articular quanto o osso subcondral, refletindo melhor as características patológicas avançadas da artrite observadas em ambientes clínicos. Isso torna o modelo MMT de ratos particularmente adequado para bioengenharia e pesquisa translacional, incluindo a avaliação de biomateriais, terapias regenerativas e sistemas de administração de medicamentos voltados para reparo articular. Embora as técnicas cirúrgicas de TMM e DMM tenham sido descritas em estudos anteriores, ainda falta um protocolo visual abrangente, passo a passo, que garanta padronização, reprodutibilidade e precisão técnica em laboratórios de pesquisa. Portanto, para suprir essa lacuna, desenvolvemos uma demonstração detalhada baseada em vídeo ilustrando cada etapa crítica do estabelecimento do modelo, desde a preparação animal até o cuidado pós-operatório. Além disso, introduzimos dois métodos de avaliação comportamental comumente utilizados, um para avaliar o limiar da dor e outro para analisar a estabilidade espacial da marcha, a fim de fornecer uma estrutura consistente para avaliação funcional após a indução da OA. Assim, ao integrar protocolos cirúrgicos e comportamentais, este manuscrito visa promover a padronização metodológica na pesquisa pré-clínica de OA, melhorando assim a comparabilidade de dados e a relevância translacional entre os estudos.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética e Bem-Estar Animal da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang e aprovados sob o protocolo número IACUC-20251020-11. Para a cirurgia de DMM, foram usados machos C57BL/6 camundongos de 10 a 12 semanas, enquanto ratos machos de Sprague-Dawley pesando entre 200 e 225 g foram selecionados para o procedimento de MMT. Todos os animais foram alojados sob condições específicas livres de patógenos (FPS) e receberam um período de aclimatação de uma semana antes da experimentação. As condições padrão de criação foram mantidas, com comida, água e cama substituídos pelo menos duas vezes por semana para garantir o bem-estar animal e a consistência experimental.

1. Preparação animal

1. Administrar analgesia adequada (por exemplo, buprenorfina) antes da cirurgia, de acordo com as diretrizes institucionais. Anestesie o animal usando um anestésico inalação (por exemplo, isoflurano a 2% a 0,4 L/min com fluxo de gás fresco de 4 L/min em uma câmara de indução) e mantenha a anestesia durante todo o procedimento por meio de um cone nasal. Confirme a profundidade da anestesia garantindo a ausência de reflexo de retirada do pedal.
2. Aplique uma tira de 2-3 mm de pomada oftálmica lubrificante no saco conjuntival da pálpebra inferior e massageie suavemente a pálpebra para garantir uma distribuição uniforme da pomada sobre a superfície ocular.
3. Raspe o pelo ao redor da articulação do joelho direito e desinfete o local cirúrgico usando um procedimento de limpeza em três etapas com povidona-iodo, seguido de 70% de etanol. Posicione o animal sobre uma mesa cirúrgica estéril.

2. Cirurgia de DMM em camundongos

NOTA: Este procedimento induz desestabilização articular ao seccionar o ligamento meniscotibial medial (MMTL), destacado em vermelho na Figura 1, que normalmente ancora o menisco medial ao platô tibial.

1. Posicione o camundongo anestesiado em posição de deitado supino e faça uma pequena incisão na pele parapatelar medial (aproximadamente 3-5 mm) sobre o joelho direito.
2. Dissece cuidadosamente os tecidos moles sobrepostos para expor a cápsula articular. Faça uma incisão medial ao tendão patelar e desloque suavemente a patela lateralmente para visualizar a articulação do joelho. Confirme que o MMTL aparece como uma faixa fina e ligamentar que conecta o chifre anterior do menisco medial ao platô tibial. Use um estereoscópio para melhorar a visualização e minimizar o risco de danificar a cartilagem articular.
3. Transecte cuidadosamente a fixação tibial do MMTL usando microtesoura, uma lâmina de bisturi #11 ou uma agulha de seringa dobrada. Ao usar uma agulha de seringa dobrada, a borda romba ajuda a proteger a cartilagem articular subjacente. Confirme a transseção bem-sucedida observando a desestabilização resultante do menisco medial.
4. Feche a cápsula articular incisada usando 8-0 Suturas absorvíveis, seguidas pelo fechamento da incisão cutânea com clipes de ferida ou pontos 6-0.
   NOTA: Tome cuidado para evitar furar ou danificar a cartilagem articular durante a sutura e garantir que a rigidez articular seja mantida corretamente ao fechar a incisão.
5. Permita que o animal se recupere em uma almofada térmica e monitore-o de perto até recuperar a mobilidade total.

3. Cirurgia MMT no rato

NOTA: Este procedimento induz OA ao criar uma ruptura completa do menisco medial após a transeção do ligamento colateral medial (LCM), gerando instabilidade articular e degeneração progressiva da cartilagem.

1. Posicione o rato anestesiado adequadamente e faça uma incisão parapatela medial, com aproximadamente 6-8 mm de comprimento, sobre o joelho direito.
2. Realize uma dissecação contundente para separar as camadas musculares e expor claramente o LCM (Figura 2).
3. Usando tesoura cirúrgica, transectoe completamente o LCM em seu ponto médio.
4. Retraa suavemente o LCM seccionado para expor o menisco medial subjacente. Usando pinças finas, segure o menisco e realize uma transeção de espessura total em sua região mais estreita para criar um rasgo completo.
5. Reposicione os tecidos moles e feche a incisão em camadas, usando suturas absorvíveis 5-0 para o músculo e fáscia, seguidas de clipes para feridas ou suturas 5-0 não absorvíveis para fechamento da pele.
6. Permita que o animal se recupere seguindo o mesmo procedimento descrito no passo 2.5.

4. Avaliações comportamentais

1. Realize avaliações de base antes da cirurgia e avaliações repetidas nos períodos pós-operatórios designados (por exemplo, 2, 4 e 8 semanas).
   NOTA: Para minimizar a variabilidade entre operadores, testes comportamentais foram realizados pelo mesmo operador treinado que foi cegado para o agrupamento experimental. Cada medição foi repetida três vezes por animal, e o valor médio foi usado para análise.
   1. Teste mecânico simplificado de limiar de retirada
      1. Coloque os camundongos em compartimentos individuais sobre uma plataforma elevada de malha metálica e permita que se aclimatem por pelo menos 30 minutos antes do teste. A sensibilidade mecânica à dor é então avaliada usando um anestesiômetro eletrônico von Frey.
      2. Usando um filamento de Von Frey, aplique a sonda na superfície plantar da pata traseira direita do rato e aumente gradualmente a força¹².
      3. Registre a resposta, observando que uma reação positiva é indicada por retirada repentina da pata, sobressalto ou lamber. Avalie a presença ou ausência de uma resposta consistente para avaliar mudanças na sensibilidade ao longo do tempo.
   2. Análise da marcha
      1. Utilize um sistema automatizado de análise de marcha para avaliação.
      2. Permita que o animal caminhe voluntariamente pela passarela de vidro do aparelho. Defina um teste válido como aquele em que o animal se move em um ritmo constante sem pausa. Espere o software do sistema identificar automaticamente as pegadas e calcular múltiplos parâmetros de marcha. Analise métricas-chave para o membro posterior direito (operado), incluindo duração da fase da postura, velocidade do balanço e pressão da pata, e compare com as do membro contralateral e controles operados por simulação.
         NOTA: Todos os animais foram aclimatados ao aparelho de teste com sessões diárias de treinamento antes da avaliação inicial. Para cada animal, três corridas foram registradas por ponto de tempo, e apenas os testes em que o animal manteve uma velocidade consistente sem pausas foram considerados válidos. Todas as medições foram realizadas por operadores treinados sob um projeto duplo-cego para minimizar a variabilidade entre operadores, e as execuções repetidas foram médias para garantir a reprodutibilidade dos dados.

Resultados

Caracterização e validação do modelo de camundongo DMM OA
Após um período de aclimatação de 1 semana, o modelo de osteoartrite (OA) induzida por DMM em camundongos foi estabelecido após o procedimento ilustrado na Figura 1. Avaliações patológicas e comportamentais foram realizadas duas semanas após a cirurgia. Como mostrado na Figura 2A, as alterações degenerativas mais pronunciadas foram localizadas na articulação femorotibial medial. A exte...

Discussão

Esse protocolo fornece uma estrutura padronizada para a indução e avaliação de dois modelos cirúrgicos de AA amplamente utilizados. Esses modelos são particularmente valiosos porque replicam de perto as características fisiopatológicas da artritis pós-traumática humana, oferecendo assim forte relevância translacional. O modelo DMM envolve a transeção do ligamento meniscotibial medial, enquanto o modelo MMT envolve uma ruptura direta do menisco medial. Em nosso laboratório, o procedimento...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de análise de marcha	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-FP202
Liposico			Pomada oftálmica
Ratos	Instituto de Animais Modelo de Nanjing	C57/BL6
Sistema de teste de dor	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-XZD	Anestesiômetro eletrônico de von Frey
Rato	Instituto de Animais Modelo de Nanjing	S/D