Caracterização de Características Estomáticas e Epidérmicas Usando Peelings, Clearing e Análise de Imagens Baseadas em IA

Liisa Kübarsepp; Mait Rungi; Ülo Niinemets; Vivian Kuusk; Riccardo Scodeller; Tiina Tosens

doi:10.3791/69615

Artigo de método

Caracterização de Características Estomáticas e Epidérmicas Usando Peelings, Clearing e Análise de Imagens Baseadas em IA

DOI:

10.3791/69615

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27 de março de 2026

Liisa Kübarsepp¹ , Mait Rungi² , Ülo Niinemets²^,³ , Vivian Kuusk² , Riccardo Scodeller² , Tiina Tosens²

¹Centre of Estonian Rural Research and Knowledge, ²Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, ³Estonian Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo apresenta um método comparativo para avaliar características estomáticas e epidérmicas em duas espécies distintas, utilizando peelings epidérmicos, técnicas de limpeza e análise de imagem assistida por IA. O objetivo é possibilitar a quantificação reprodutível e de alta capacidade das estruturas celulares subjacentes à função estomática para aplicações agrícolas e pesquisas amplas sobre plantas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A caracterização precisa da morfologia estomática e das características epidérmicas ao redor é essencial para entender a função estomática. Um protocolo comparativo é apresentado usando duas técnicas complementares — peelings epidérmicos e limpeza foliar — para avaliar o tamanho, formato e densidade das células estomáticas e epidérmicas em duas espécies de dicotildeontes ecologicamente distintas, Fraxinus excelsior e Taraxacum officinale. O protocolo inclui etapas detalhadas para preparação de amostras, imagem e quantificação de características, utilizando medições manuais eficientes em custos e mão de obra (limpeza e descascamento de tecidos), e análise de imagens assistida por IA, com potencial para facilitar aplicações de alta produtividade. Três ferramentas de segmentação — um modelo de detecção estomática baseado em YOLOv8, uma ferramenta generalista de aprendizado profundo para segmentação celular e um classificador baseado em pixels — foram avaliadas quanto à sua precisão e adequação entre os métodos. Diferenças significativas em características estomáticas e epidérmicas são consistentemente observadas entre as técnicas de descamação e limpeza tanto em análises manuais quanto com IA. Ferramentas de IA permitiram quantificação reprodutível, com o modelo de detecção estomática baseado em YOLOv8 (StoManager1) apresentando melhor desempenho para características estomáticas e uma ferramenta generalista de aprendizado profundo para segmentação celular (Cellpose) para segmentação epidérmica. A detecção de características baseada em IA foi altamente consistente em T. officinale , mas limitada em F. excelsior; os resultados ainda divergiam das medições manuais, ilustrando como a anatomia específica da espécie e a qualidade da imagem impactam a adequação dos métodos. Esses achados sugerem que, embora a análise assistida por IA forneça uma estrutura útil para a quantificação de características estomáticas e epidérmicas, a validação por especialistas e os testes piloto continuam essenciais antes da aplicação mais ampla ou de alto rendimento.

Introdução

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Os estomatos são poros microscópicos na epiderme que desempenham um papel vital na regulação da troca gasosa e transpiração das plantas. Assim, compreender a base morfológica do funcionamento estomatal é fundamental para melhorar o desempenho das^{culturas 1}. Embora a maioria dos estudos sobre estrutura e função estomática foque exclusivamente na morfologia estomática, uma compreensão completa da resposta estomática também exige a caracterização do tamanho e da forma das células epidérmicas ao redor. A quantificação precisa dessas características é fundamental para entender as relações estrutura-função subjacentes à troca gasosa e à melhoria das culturas.

À medida que a melhoria das culturas depende cada vez mais de abordagens avançadas de edição genética, é fundamental compreender as principais características morfológicas — como estomatos — que influenciam a fotossíntese, a eficiência intrínseca do uso da água e o ganho de carbono. Essa necessidade é especialmente urgente diante das mudanças ambientais em curso, já que a demanda por culturas resilientes que mantenham tanto a capacidade fotossintética quanto a produtividade cresce diante de secas e ondas de calor mais^frequentes ^2,3. Consequentemente, há uma forte necessidade de protocolos padronizados de imagem e análise. A descascação estomática com verniz/esmalte é o método mais simples para obter impressões na superfície das folhas para medir o tamanho, formato e densidade dos estomas e ^epidérmicos ^4,5,6. Seu procedimento é rápido, não destrutivo, permitindo um processamento rápido das amostras. O método de limpeza de tecidos é uma abordagem alternativa que permite a caracterização simultânea da rede de veias e, potencialmente, uma caracterização mais abrangente da hidráulica foliar.

A limpeza química amolece e torna os tecidos opticamente transparentes, permitindo a imagem in situ de estomas e células epidérmicas sem interferências mecânicas. A limpeza é amplamente aplicável a uma variedade de tipos de tecidos, incluindo espécimes secos ou delicados, e pode ser usada não apenas para imagem estomática, mas também para visualização de redes de nervações, imagem por fluorescência e estruturas anatômicas^internas 7,8,9,10,11,12 , permitindo assim que características estomáticas sejam analisadas junto com outras características funcionais. Existem vários métodos de limpeza, envolvendo solventes orgânicos, soluções aquosas, hiperidratação ou incorporação de hidrogel 13,14,15. Esses diferem em duração, compatibilidade de imagem e disponibilidade de reagentes. O protocolo utilizado aqui é simples, econômico e não requer habilidades especializadas. Ambas as técnicas são baratas e rápidas em comparação com métodos mais laboriosos, como microscopia óptica ou microscopia eletrônica de varredura, que exigem fixação química, incorporação e separação de amostras.

Métodos tradicionais para analisar características estomáticas e epidérmicas frequentemente dependem da segmentação manual de imagens de microscopia, que é trabalhoso, demorado e sujeito a viés do observador, limitando o throughput e reduzindo a eficiência do pipeline^{de análise 16}. Além disso, características anatômicas como tricomas e paredes celulares irregulares apresentam desafios adicionais para a quantificação consistente de características. Embora ferramentas automatizadas de análise de imagens ofereçam grande potencial para extração de dados de alta produtividade, elas foram otimizadas para tecidos vegetais específicos e não são facilmente transferíveis entre tipos de folhas e métodos de preparação. Por exemplo, o StoManager1 (Figura Suplementar 1) oferece alta precisão na detecção de estomas usando um modelo de detecção de objetos baseado em YOLOv8, mas é especificamente treinado para características estomáticas. Cellpose (Figura Suplementar 2) é um modelo de segmentação generalista e pré-treinado que funciona bem quando os dados de entrada se assemelham aos seus modelos pré-treinados (por exemplo, cito, cito2), baseados originalmente em células e organelos animais. Ilastik (Figura Suplementar 3) é uma ferramenta de classificação baseada em pixels que se baseia em anotações definidas pelo usuário. Tanto o Cellpose quanto o Ilastik são amigáveis ao usuário, mas cada um pode exigir retreinamento ou ajuste fino para acomodar variações na qualidade da imagem, artefatos de fundo e recursos específicos do tecido.

Além disso, a morfologia estomática e epidérmica apresenta alta variabilidade entre a espécie¹⁷. Características como densidade e tamanho estomatal são especialmente variáveis, mas normalmente são inversamente relacionadas e, juntas, determinam diferenças entre espécies na cinética estomática. Estomatos maiores podem compensar parcialmente a menor densidade, mas geralmente apresentam cinética^{mais lenta 5}, o que pode ser desvantajoso sob ondas de calor cada vez mais frequentes, onde respostas estomáticas rápidas são críticas para manter a assimilação de carbono e prevenir perda excessiva de água. No conjunto, essa variabilidade complica a medição dos traços estomatais e pode comprometer a validade do protocolo selecionado e a robustez dos resultados baseados em IA.

Esse protocolo integra duas técnicas clássicas de preparação — peelings epidérmicos e clearings químicos — com ferramentas modernas de inteligência artificial (IA) e aprendizado de máquina (ML) para segmentação e medição de características. Utilizando duas espécies comuns de dicotiledôneas que demandam luz e com estratégias ecológicas contrastantes (F. excelsior e T. officinale), examinamos a variabilidade em características estomáticas e epidérmicas para avaliar como três métodos se comparam e onde podem surgir potenciais imprecisões. O desempenho de três ferramentas de IA: StoManager1 (um modelo de deep learning baseado em YOLOv8 para detecção estomática), Cellpose (uma ferramenta generalista de segmentação de aprendizado profundo) e ilastik (um classificador baseado em pixels para tecidos epidérmicos) foi avaliado. Essa abordagem integrativa permite a quantificação reprodutível e de alta capacidade de traços estomais e epidérmicos, oferecendo uma estrutura robusta e escalável para análise fenotípica tanto em pesquisa ecológica quanto agrícola. No entanto, características anatômicas como tricomas densos, cutículas espessas ou baixo contraste na fronteira celular podem reduzir a precisão da segmentação e devem ser consideradas ao selecionar entre abordagens de descascamento e eliminação e ao aplicar quantificação baseada em IA.

Até onde sabemos, este é o primeiro protocolo passo a passo que compara diretamente as abordagens de descamação epidérmica e limpeza química em combinação com múltiplas ferramentas de segmentação baseadas em IA para quantificação de características estomáticas e epidérmicas. Ao unir técnicas clássicas de microscopia com fluxos de trabalho de ML acessíveis, o protocolo reduz o viés do usuário, aumenta o débito e facilita a fenotipagem reprodutível entre espécies. Isso torna a abordagem amplamente aplicável à ecologia, melhoria de culturas e pesquisa sobre mudanças climáticas, e fornece uma base para a expansão contínua das ferramentas por meio do retraining de modelos ou aprendizagem por transferência.

Protocolo

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NOTA: Não foram necessárias permissões ou aprovações específicas para a coleta das folhas de T. officinale e F. excelsior , pois essas espécies não protegidas foram amostradas em áreas de jardim acessíveis ao público. A coleta de todas as amostras estava em conformidade com as diretrizes institucionais e locais.

1. Coleta de material vegetal

Selecione folhas saudáveis para análise comparativa. Para o experimento atual, foram selecionadas folhas maduras saudáveis e expostas ao sol de duas espécies de dicotildeontes com distribuição estomática contrastante: a árvore hipoestomatosa F. excelsior, que possui estômatos apenas na superfície inferior da folha, e a planta perene anfitistomata T. officinale.
Para cada tipo/local de amostra, pegue de 3 a 5 folhas replicadas.
Dê a folha com uma tesoura limpa ou uma lâmina de barbear. Coloque a folha cortada imediatamente na água para evitar a desidratação.
Após a coleta, submerga completamente o pecíolo em água e armazene-o a 4°C.
Prossiga com as seções 2 ou 3 do protocolo dentro de 48 horas.

2. Preparação e visualização de cascas de impressão de estomas

NOTA: Todos os resíduos químicos gerados durante o protocolo de limpeza foram tratados de acordo com as normas institucionais e locais de segurança. Soluções contendo glutaraldeído foram coletadas separadamente e descartadas como resíduos químicos perigosos. As soluções de hidróxido de sódio (NaOH) foram neutralizadas para pH 6-8 antes do descarte, quando permitido. Soluções de água sanitária diluída e etanol foram descartadas pelo ralo junto com grandes quantidades de água fria nos locais permitidos por regulamentos institucionais e municipais. As soluções TBO eram coletadas e descartadas como resíduos químicos conforme as diretrizes locais. Os usuários devem consultar o escritório de segurança institucional para procedimentos aprovados para descarte.

Se necessário, enxágue suavemente a superfície da folha selecionada com água para remover poeira ou detritos. Imediatamente seque a superfície da folha usando papel de filtro ou papel toalha macio para remover o excesso de umidade. Não seque ao ar, pois isso pode causar encolhimento do tecido, levando a medições imprecisas de tamanho dos estomas e das células epidérmicas.
Rotule a lâmina do microscópio com detalhes da amostra (por exemplo, espécie, lado da folha e data de preparo) usando um marcador permanente para garantir a rastreabilidade de cada amostra durante a imagem, análise e interpretação dos dados, e permitir o armazenamento adequado da amostra para uso futuro.
Para espécies com tricomas não glandulares (peludos), remova os tricomas da superfície da folha com uma lâmina de barbear antes da preparação do peeling, pois sua presença pode obscurecer os limites celulares e reduzir a qualidade da imagem (Figura 1).
Usando um pincel pequeno, aplique uma camada fina e uniforme de esmalte transparente e não extensível (evite fórmulas de "elasticidade" ou "descolamento") na área alvo. Sempre selecione a parte central da folha para a preparação da casca, evitando a ponta e a base.
Deixe o esmalte secar completamente (normalmente de 2 a 5 minutos em temperatura ambiente). A exposição prolongada pode causar descoloração do tecido (por exemplo, tonalidade avermelhada em folhas mais macias), que pode ser visível na casca final, e interferir nas análises a jusante que exigem coloração uniforme.
Quando estiver seco, aplique uma tira de fita transparente na área revestida. Comece por uma das bordas do esmalte e apresente a fita gradualmente sobre a superfície, pressionando suavemente para garantir boa aderência e evitar bolhas de ar ou vincos. Use luvas de nitrilo para evitar impressões digitais.
Cuidadosamente retire a fita junto com o filme do esmalte (impressão epidérmica).
Coloque a fita (com o lado pegajoso para baixo) sobre uma lâmina limpa do microscópio, evitando dobras ou sobreposições.
Armazene lâminas preparadas em temperatura ambiente, protegidas da poeira e da luz solar direta.
Examine a lâmina sob um microscópio de luz composta com ampliação de 400x. Salve as imagens conforme o guia do software, junto com a escala correspondente.

3. Preparação e visualização de seções liberadas

Corte pedaços de folha de aproximadamente 1^{cm 2}. Realize todas as etapas usando luvas de nitrilo e trabalhando sob uma exaustão de fumo.
Transfira as amostras para um frasco marcado, cubra-as com solução fixadora (aldeído glutárico a 4% em 0,1 M fosfato tampão, pH = 6,9) (CUIDADO) e armazene a 4°C por 24 horas (Tabela 1, para preparação da solução fixante).
Remova a solução fixante com uma pipeta e cubra as amostras com água destilada. Saia por 30 minutos. Repita três vezes (Figuras 2A-C).
Remova a água e cubra as amostras com 1 M de solução de NaOH (dissolva 20 g de NaOH em 0,5 L de água destilada).
Durante a limpeza das folhas, a solução de NaOH ficará verde. Troque a solução de NaOH uma vez por dia por uma solução nova. Continue por 3 a 4 dias, ou até que as amostras fiquem amarelo-pálido e a solução de NaOH permaneça transparente (Figura 2D-F).
Remova a solução de NaOH e cubra as amostras com água sanitária (5% de NaClO). Água sanitária doméstica comercial com essa concentração é adequada.
Incube as amostras em água sanitária por 1-2 minutos. As amostras ficarão brancas e translúcidas (Figura 2G-I).
Remova a solução anterior e cubra as amostras com água destilada por 2 minutos. Desidrate as amostras através de uma série graduada de etanol destilado da seguinte forma: 75:25, 50:50, 25:75 e 100% etanol.
Remova o etanol e cubra as amostras com uma solução alcoólica a 3% de toluidina azul O (TBO, dissolva 3 g TBO em 100 mL de 100% etanol). Vá embora durante a noite.
Remova a solução de mancha e cubra as amostras com etanol 100% por 2 minutos. Repita essa etapa usando uma série graduada de etanol destilado com água-etanol da seguinte forma: 25:75, 50:50, 75:25 e, finalmente, água destilada (Figura 2J-L). Consulte a Figura 3 para os erros comuns e as etapas de solução de problemas associadas ao processo de limpeza.
Mantenha as amostras em água destilada a 4°C até a visualização.
Transfira as amostras para uma lâmina de vidro, adicione uma gota de água destilada e cubra com uma capa de vidro para visualização e imagem microscópicas.
Examine a lâmina sob um microscópio de luz composta com ampliação de 400x. Salve as imagens conforme o guia do software, junto com a escala correspondente. Consulte a Tabela de materiais para mais informações.

4. Análise e medições de imagens

Use Fiji²³ (distribuição ImageJ, versão 1.54p) para processamento e análise de imagens.
Usando a ferramenta Linha, desenhe uma linha sobre a barra de escala, depois selecione Analisar > Definir Escala, modifique a distância conhecida para o comprimento da barra de escala e mude a unidade de comprimento para μm.
Vá para Analisar > Definir Medidas. Certifique-se de que as opções de Área e Diâmetro dos Ferets estejam verificadas.
Use a Ferramenta de Seleção de Polígonos para delinear o objeto de interesse. Registre a medida pressionando a tecla M .
Meça as seguintes características estomáticas e epidérmicas em Fiji e calcule tanto para amostras eliminadas quanto para cascas estomáticas (Figura 3).
Calcule o número de estomatas (Ns).
1. Determine a área média dos estomas (As).
2. Determinar a largura média dos estomas (Ws): usando o diâmetro mínimo de Feret.
3. Calcule a densidade estomática (DE) pela seguinte fórmula:
  
  ; por unidade Ia (a área da folha selecionada para medições, mm²).
4. Determine a área celular epidérmica média (Ae).
5. Determine a densidade celular epidérmica (ECD) usando a seguinte fórmula:

5. Estatísticas

Use o ANOVA e o teste pós-hoc HSD de Tukey para testar diferenças entre grupos de amostras.
Realize todas as análises estatísticas em R²¹.
Analise um total de 3 folhas replicadas por espécie e veja 3 cascas de cada folha.

6. Análise assistida por IA

Selecione ferramentas de aprendizado de máquina para segmentação.
1. Selecione ferramentas de segmentação apropriadas baseadas em aprendizado de máquina com base na estrutura-alvo (estomas ou células epidérmicas), qualidade da imagem e objetivos de análise.
2. Use um modelo de deep learning específico para estomas para detecção e medição automatizada de traços estomais e utilize ferramentas generalistas de deep learning ou segmentação baseada em pixels para segmentação celular epidérmica.
3. Consulte a seção Ferramentas e Software de Aprendizado de Máquina para implementações específicas de software (Arquivo suplementar).
4. Realize testes piloto em um subconjunto de imagens antes da análise em larga escala para avaliar o desempenho da segmentação e identificar possíveis fontes de falsos positivos.
Prepare o ambiente de computação.
1. Use uma estação de trabalho equipada com um processador de 8 a 12 núcleos, pelo menos 32 GB de RAM e uma GPU compatível com NVIDIA CUDA com no mínimo 24 GB de VRAM.
2. Use uma tela de alta resolução (preferencialmente 4K) para facilitar a anotação e a inspeção visual.
3. Instale todas as ferramentas de software selecionadas conforme as instruções dos desenvolvedores e registre versões do software para garantir a reprodutibilidade.
Prepare imagens para análise de aprendizado de máquina.
1. Importar imagens de microscopia em formato TIFF ou PNG, usando imagens em tons de cinza de 8 ou 16 bits sempre que possível.
2. Certifique-se de que cada imagem contenha uma barra de escala visível ou tenha sido calibrada espacialmente antes da análise.
3. Selecione regiões de interesse com detritos mínimos, dobras ou bolhas de ar, iluminação uniforme e limites celulares claramente definidos.
4. Exclua imagens com bordas borradas, sombras fortes ou baixo contraste, pois isso reduz a precisão da segmentação.
Realize segmentação estomática.
1. Carregue imagens no modelo de aprendizado profundo específico para estomatos (seção 1 do arquivo suplementar).
2. Configure parâmetros de detecção, incluindo limites de tamanho do objeto e limiares de confiança, de acordo com a espécie e a resolução da imagem.
3. Execute detecção automatizada para segmentar complexos estomais e extrair métricas de saída como número de estomais, área e diâmetros de Feret.
4. Exporte máscaras de segmentação e tabelas de medição para análise a jusante. Inspecione visualmente as sobreposições de segmentação e exclua manualmente objetos detectados incorretamente, se necessário.
Realize segmentação celular epidérmica.
1. Carregue imagens em uma ferramenta generalista de segmentação de aprendizado profundo ou em um classificador baseado em pixels (seção suplementar de arquivos 2 - 4).
2. Treine ou ajuste fino o modelo usando imagens representativas com exemplos anotados manualmente de células epidérmicas, limites celulares e fundo.
3. Execute segmentação para gerar máscaras de objetos e exporte as máscaras para pós-processamento em ImageJ/Fiji ou software de análise de imagem equivalente.
4. Aplique filtragem baseada em tamanho ou quantil para remover pequenos objetos falsos positivos e verifique a precisão da segmentação por meio de inspeção visual antes de extrair métricas epidérmicas celulares, como área e densidade celular.
Documente os parâmetros e realize o controle de qualidade.
1. Registre todas as versões de software, configurações de parâmetros, limiares de filtragem e especificações de hardware usadas durante a análise.
2. Mantenha sobreposições representativas de segmentação para a qualidade da segmentação do documento.
3. Valide visualmente as saídas automatizadas de segmentação antes da análise estatística ou do relatório de dados.
Preparação de imagem para todo processamento de ML
1. Imagem por amostra
  NOTA: Como a segmentação baseada em ML depende de gradientes de intensidade, continuidade das bordas e geometria consistente dos objetos, em vez do contexto biológico, o pré-processamento de imagens e a seleção de regiões determinam criticamente o desempenho do modelo e a estrutura do erro.
  1. Capture imagens de alta resolução de superfícies de folhas limpas ou descascadas com uma barra de escala visível. Para bons fluxos de trabalho de aprendizado de máquina, certifique-se de que os objetos mensuráveis estejam nítidos, contínuos e de alto contraste ao longo da imagem.
2. Seleção de regiões e qualidade de imagem
  NOTA: Após a aquisição de imagens na Seção 6.7.1, as imagens são inspecionadas visualmente e, quando a escala permite, regiões de interesse livres de artefatos são selecionadas manualmente para segmentação posterior. Selecione regiões de interesse com artefatos mínimos (por exemplo, detritos, dobras, bolhas de ar, iluminação desigual). Para modelos estomatais (por exemplo, StoManager1), priorize a visibilidade clara dos poros e uma silhueta bem definida da célula de guarda. Para modelos epidérmicos (por exemplo, Cellpose, ilastik), garantir gradientes de intensidade estáveis ao longo dos contornos celulares; bordas descontínuas ou de baixo contraste reduzem substancialmente o desempenho da segmentação. Imagens com limites mal definidos devem ser excluídas ou reprocessadas antes da segmentação.
3. Formato de arquivo
  Arquivos salvos em formato TIFF ou PNG (escala de cinza de 8 ou 16 bits recomendada para segmentação).
4. Aprimoramento de imagem opcional
  1. Aumente o contraste ou subtraia o fundo no ImageJ/Fiji se os limites forem fracos.
  2. Foque na geometria das arestas, pois elas podem criar gradientes falsos interpretados como bordas de células.
  3. Aplique esses ajustes de forma consistente em todas as imagens dentro de um conjunto de dados.
    NOTA: Atenção especial deve ser dada à geometria das bordas, pois sombras, halos ou gradientes de fundo irregulares podem criar transições artificiais de intensidade que modelos de ML podem interpretar erroneamente como bordas de células.
StoManager1 (versão da interface visual v1.0.0)
NOTA: O StoManager1 permite a detecção, medição e análise automatizadas e de alto rendimento de estomas foliares de plantas usando redes neurais convolucionais (YOLOv8-seg-x). A ferramenta quantifica métricas estomáticas chave (área, densidade, razão poro/célula guarda, índices de agregação, etc.) de vários tipos de imagem, reduzindo o esforço manual e o viés, e facilitando estudos ecológicos e fisiológicos em larga escala. Um aplicativo para Windows amigável está disponível, não exigindo habilidades de programação, exceto pós-processamento opcional (Seção de arquivo suplementar 1)²³.
1. Executando o StoManager1: instalar e configurar
  1. Acesso via GitHub (https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1) ou pelo aplicativo Windows independente ((Seção de arquivo suplementar 1)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)²³.
  2. Garantir versões de bibliotecas compatíveis (dependências de Python); conflitos podem ocorrer se outros softwares de ML/imagem forem instalados.
2. Inicie o StoManager1 via interface gráfica ou linha de comando.
3. Escolha seu diretório de entrada contendo imagens de folha.
4. Seleção de modelos; Confira o modelo YOLOv8-seg-x para métricas mais detalhadas baseadas em segmentação. Mantenha desmarcado para o modelo de caixa delimitadora (YOLOv3), menos métricas.
5. Ajuste de parâmetros; Ajuste os limiares de detecção, resolução da imagem, dilatação da máscara e limites de tamanho dos objetos conforme necessário para sua modalidade/espécie de imagem. Por favor, use parâmetros padrão quando alguns objetos estomatas permanecerem indetectados, principalmente (1) diminuir o limiar de confiança da detecção para recuperar mais estomas verdadeiros enquanto verifica a detecção de falsos positivos; e (2) aumentar a resolução da imagem, pois um valor maior pode melhorar a detecção de pequenos estomas ao custo de maior demanda computacional.
6. Segmentação de execução:
  1. Clique em " Iniciar Processo" para detectar, segmentar e medir estomatos e estomas inteiros.
  2. Clique em " Análise Estatística" para processar estatísticas em nível de grupo.
7. Colete resultados. A saída é salva em YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/ (modo segmentação) ou diretamente em YOUR_OUTPUT_PATH (modo caixa delimitadora). Arquivos CSV contêm métricas por objeto e de resumo; máscaras e imagens de resultados também são geradas.
8. Iniciar processamento em lote.
9. Ao concluir, colete a saída: máscaras de segmentação e arquivos de resultados CSV por imagem. Os resultados por imagem incluem: número e área estomática, diâmetro de Feret (máximo/min), métricas de células de guarda, índices de agregação/uniforme/divergência e razões de poro/célula de guarda.
10. Revise os resultados usando Excel, R ou Python para estatísticas e visualização adicionais.
11. Controle de qualidade; Inspecione visualmente máscaras e sobreposições. Remova objetos fora da curva por tamanho, formato ou curadoria manual, se necessário (veja abaixo).
  NOTA: Protocolos detalhados e etapas de pós-processamento para Cellpose e ilastik são fornecidos no arquivo suplementar. Para desempenho ideal com grandes conjuntos de dados e imagens complexas, recomendamos um sistema com processador de 8 a 12 núcleos, pelo menos 32 GB de RAM e uma GPU NVIDIA com CUDA e no mínimo 24 GB de VRAM. Uma tela grande e de alta resolução (preferencialmente 4K) também é fortemente recomendada para anotação e visualização eficientes.

Resultados

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Comparação dos resultados entre descascamento e limpeza

Tanto T. officinale quanto F. excelsior apresentaram variabilidade em características estomáticas e epidérmicas, dependendo se as amostras foram removidas ou descascadas (Figura 4). Amostras eliminadas geralmente forneceram limites celulares mais nítidos e visualização mais clara do formato da célula de proteção e da abertura dos poros, embora camadas de tecido sobrepostas ocasionalmente obscurecessem estomas menores e estimativas de tamanho enviesadas para cima. Em F. excelsior, a área e largura média dos estomas foram significativamente maiores em amostras eliminadas do que em peelings, enquanto em T. officinale não foram observadas diferenças significativas. A densidade estomática foi significativamente maior em amostras descascadas de F. excelsior, enquanto nenhum efeito de método foi detectado em T. officinale. A área celular epidérmica não diferia entre os métodos em nenhuma das espécies, mas a densidade celular epidérmica era ligeiramente maior em amostras descascadas de F. excelsior.

No geral, as diferenças dependentes do método foram específicas de características e espécies, sugerindo que a descascação oferece uma opção confiável para medições estomáticas, especialmente quando os estomatos variam em tamanho (por exemplo, em folhas em desenvolvimento), enquanto características epidérmicas foram em grande parte inalteradas (Figura 5).

Resultados de IA e como eles se relacionam com métodos de descascamento e limpeza

O modelo específico para estomas, o StoManager1, detectou estomatos de forma mais confiável em imagens descascadas (Figura 6), enquanto o desempenho caiu significativamente em amostras eliminadas (Figura 7). Para avaliar melhor o desempenho do StoManager1 em todos os métodos de preparação, comparamos a detecção de características estomáticas em T. officinale e F. excelsior usando tanto peelings quanto imagens limpas (Figura 8). Em T. officinale, o modelo detectou de forma confiável a presença e densidade estomática em todos os métodos de preparação. No entanto, os valores resultantes diferiram significativamente das medições manuais (Tabela 2 e Figuras 5 e 8). A maioria dos traços estomatais diferiu significativamente (p < 0,05) entre amostras descascadas e limpas (Figura 8), indicando que os pipelines de detecção de IA são altamente sensíveis a métodos de preparação e requerem validação cuidadosa antes da aplicação em larga escala. Em contraste, em F. excelsior, a detecção foi limitada à superfície abaxial devido à ausência de estomas adaxiais, e em amostras eliminadas a detecção foi inconsistente, com falsos positivos frequentes (Figura 8). Esses resultados destacam a forte influência das características anatômicas específicas de cada espécie e da qualidade da imagem na eficácia das análises baseadas em IA. Ferramentas generalistas de ML como Cellpose (Figura 9A) e Ilastik (Figura 9B) segmentaram células epidérmicas de forma mais eficaz em imagens descascadas do que em imagens limpas. No entanto, ambas as ferramentas produziram inúmeros falsos positivos com ambas as técnicas de preparação (descascamento e limpeza), especialmente sob condições de baixo contraste ou quando os contornos celulares estavam borrados. Nesses casos, contornos estomatais ou epidérmicos indistintos eram frequentemente supersegmentados em múltiplos objetos minúsculos mal classificados como células epidérmicas individuais (ver Figura 10). Como resultado, o pós-processamento é essencial, não apenas a remoção de outlances, mas também a filtragem por quantis superiores, para reter células identificadas de forma confiável.

Figura 1: Cascas estomáticas de folhas de F. carica antes e depois da remoção dos tricomas usando uma lâmina de barbear. Tricomas grandes podem deixar impressões na casca, formando bolsas de ar que resultam em superfícies irregulares e dificultam o foco consistente (visíveis como grandes pontos cinza). F. carica foi incluído como um caso fora da curva para estender o protocolo às folhas peludas. (A) Com ampliação de 200x, a imagem antes da remoção do tricoma é parcialmente obstruída pelas impressões do tricoma. (B) A qualidade da imagem melhora após a remoção dos tricomas. (C) Em uma ampliação de 400x antes da remoção dos tricomas é, em sua maioria, obstruída por impressões de tricomas. (D) A obstrução é mínima na imagem após a remoção do tricoma com uma lâmina de barbear. Barras de escala 100 μm (A, B) e 50 μm (C, D). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Etapas consecutivas do protocolo de compensação. Imagens representativas de T. officinale, F. excelsior e F. carica ilustram as etapas sucessivas do protocolo de limpeza. (A-C) Folhas frescas. (D-F) sai depois de liberar com NaOH. (G-I) vai embora depois de descolorir com NaClO. (J-L) folhas após tingir com azul-toluidina O. Este recurso visual mostra a aparência esperado da amostra antes de prosseguir para a próxima etapa e destaca a variabilidade do protocolo entre espécies. F. carica foi incluída como uma espécie fora do comum para demonstrar a aplicabilidade do protocolo em uma gama mais ampla de morfologias de folhas e nervações. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Exemplos de medições de características estomáticas e epidérmicas. As características medidas são ilustradas na imagem da seguinte forma: As = área estomática; Ls = comprimento dos estomas; Ws = largura dos estomas; Ae = área celular epidérmica. A densidade estomática e a densidade celular epidérmica foram calculadas dentro da área marcada, conforme descrito no protocolo. Imagem com ampliação de 400x. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Comparação de imagens obtidas com o protocolo de limpeza e o protocolo de descascamento. Imagens representativas de T. officinale e F. excelsior comparando imagens de limpeza e peeling estomatal mostrando a visibilidade e variabilidade do tamanho e densidade das células dos estomas e da epiderme. Barra de escala 50 μm, e imagens são tiradas com ampliação de 400x. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Diferenças nos resultados manuais de medição de traços entre o protocolo de limpeza e o descascamento. Gráficos de caixa mostrando diferenças em características estomáticas e epidérmicas entre métodos de limpeza e peeling epidérmico em T. officinale e F. excelsior. (A) Área média dos estomas: (B) largura média dos estomas, (C), densidade estomática, (D), área média das células epidérmicas, e (E) densidade celular epidérmica. Asteriscos indicam níveis de significância estatística (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). A significância estatística foi avaliada usando ANOVA unidirecional seguida pelo teste post-hoc HSD de Tukey. Tamanho da amostra por grupo: n = 3-5. Abreviações: As = área estomática; Ws = largura dos estomas; DS = densidade estomática; Ae = área celular epidérmica; ECD = densidade celular epidérmica. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Exemplo de resultados de segmentação usando um modelo de detecção estomática em amostra de peeling. Resultado de segmentação StoManager1 para uma amostra descascada de T. officinale (lado inferior de uma folha madura exposta à sombra), mostrando boa precisão na detecção. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Exemplo de resultado de segmentação usando um modelo de detecção estomática em amostra eliminada. Resultado de segmentação StoManager1 para uma amostra limpa de T. officinale (lado inferior de uma folha madura exposta à sombra), mostrando menor precisão na detecção em comparação com amostras descascadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 8: Diferenças nos resultados de medição de traços assistidos por IA entre o protocolo de limpeza e descascamento. Gráficos de caixa mostrando medições derivadas de IA de traços anatômicos estomais a partir de imagens processadas pelo StoManager1 em T. officinale e F. excelsior. As características incluem área estomática (As), largura estomática (Ws), comprimento estomatal (Ls) e densidade estomática (Ds). As unidades são as da Figura 5. A significância estatística foi avaliada usando ANOVA unidirecional seguida pelo teste post-hoc HSD de Tukey. Asteriscos indicam níveis de significância estatística (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). Tamanho da amostra por grupo: n = 3-5. Abreviações: As = área estomática; Ws = largura dos estomas; Ls = comprimento estomatário; Ds = densidade estomática. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 9: Capturas de tela mostrando segmentação com ferramenta generalista de deep learning e classificador baseado em pixels. Segmentações de amostra de F. excelsior descascada (superfície abaxial da folha) com (A) ferramenta generalista de aprendizado profundo (Cellpose (cyto2)) e (B) classificador baseado em pixels (ilastik). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 10: Máscara de segmentação Ilastik para uma amostra descascada de F. excelsior (lado abaxial de uma folha), mostrando inúmeros falsos positivos. Pequenos pontos são mal classificados como células epidérmicas distintas. Durante o pós-processamento, é necessária uma inspeção manual (visual) para definir limiares baseados em tamanho e filtrar efetivamente falsos positivos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Solução	Preparação	Volume final
Base para o buffer 1	7,12 g (Na₂HPO₄ *2H₂O) em 200 mL de dist. H₂O	200 mL
Base para o buffer 2	7,12 g de Na₂_{HPO 4} *2H₂O) em 200 mL de dist. H₂O	200 mL
Tamponador de fosfato	Misture 36 mL de base 1, 14 mL de base 2 + 50 mL de distância. H₂O	100 mL
Solução fixativa	Misture 9,25 mL de glutaraldeído a 5% com 12,5 mL de tampão fosfatado e 28,25 mL de dist. H₂O	50 mL

Tabela 1: Receita para a solução fixadora²⁴. Composição das soluções utilizadas neste estudo.

Espécies	Side	Método	Homem (As)	IA (As)	Homem (Ws)	IA (Ws)	Homem (Ls)	IA (Ls)
Fraxinus	Abaxial	Peel	177.43	9.32	12.71	2.85	17.58	3.58
Taraxacum	Abaxial	Liberado	408.09	18.84	20.1	4.19	26.14	5.39
Taraxacum	Abaxial	Peel	262.54	13.93	15.18	3.47	22.2	4.68
Taraxacum	Adaxial	Liberado	414.48	14.91	20.11	3.44	26.09	5.71
Taraxacum	Adaxial	Peel	258.72	11.37	15.72	3.3	21.15	4.08

Tabela 2: Comparações indicativas entre medições manuais e IA. ML (StoManager1) escalou resultados. Homem e IA indicam, correspondentemente, resultados manuais e AI (StoManager1). As unidades são as da Figura 5. As medições manuais e de IA diferem significativamente. Algumas comparações não estão disponíveis por vários motivos, incluindo a ausência de estomas (por exemplo, F. excelsior adaxial) ou falha na detecção (por exemplo, os estomas foram mais difíceis de detectar em amostras eliminadas devido a contornos celulares mais difusos).

Figura suplementar 1: Exemplos de erros comuns ocorrendo durante a limpeza das folhas que afetam os resultados. Imagens mostradas para fins de diagnóstico: (A) manchagem desigual devido à reidratação incompleta da amostra durante a seção 3.10; (B) danos mecânicos resultantes do manuseio incorreto da amostra muito frágil processada quimicamente; (C) tom esverdeado no centro da amostra devido à remoção incompleta da clorofila durante a seção 3.5. Por favor, clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 2: Exemplo da interface do usuário StoManager1. Captura de tela da interface do usuário do StoManager1 mostrando a configuração de entrada e tabela de resultados (esquerda), e vistas micrográficas com imagens originais (canto superior direito) e sobreposição de detecção estomática (canto inferior direito, superfície adaxial de uma amostra descascada de T. officinale ). Por favor, clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 3: Exemplo da interface do usuário do Cellpose. Captura de tela da segmentação do Cellpose em andamento pela interface gráfica com parâmetros ajustáveis (por exemplo, seleção de modelo - modelo pré-treinado recomendado de cyto2 ou modelo treinado sob medida, limiares e calibração do diâmetro celular). A anotação manual supervisionada das células epidérmicas destaca cada célula em uma cor única para orientar a calibração do modelo. A sobreposição mostra segmentação de um peeling epidérmico abaxial de F. excelsior . Por favor, clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 4: Processo de segmentação do Ilastik. A sobreposição ilustra a classificação baseada em pixels em uma imagem de peeling epidérmico abaxial de F. excelsior . (A) Captura de tela da segmentação do ilastik em andamento mostrando treinamento supervisionado com classes rotuladas manualmente: células epidérmicas (amarelo), contornos celulares (azul) e fundo não epidérmico, como tricomas (vermelho). (B) Captura de tela mostrando apenas a classe da epiderme (amarelo), ilustrando como o classificador isola células epidérmicas individuais. Note a presença de múltiplas detecções "minúsculas" falsos positivos, especialmente em regiões de baixo contraste ou iluminação desigual. (C) Captura de tela mostrando apenas a classe de contorno (azul), ilustrando como o classificador isola os limites celulares do tecido epidérmico ao redor. Note que alguns contornos são descontínuos e que ocorrem múltiplas detecções falsas positivas "minúsculas", especialmente em regiões de baixo contraste ou iluminação desigual. (D) Captura de tela mostrando a turma de fundo. A máscara destaca complexos estomatais, tricomas glandulares e detritos diversos (vermelho), enquanto exclui os corpos celulares epidérmicos. Numerosas pequenas detecções falsas positivas "minúsculas" são visíveis nas regiões epidérmicas, surgindo de artefatos em escala de cinza e classificação incorreta baseada em textura. Por favor, clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 5: Configurações de treinamento com cellpose. Exemplo de configurações de treinamento (GUI) do Cellpose para uma amostra de T. officinale liberada (ambas as superfícies das folhas), mostrando parâmetros padrão do modelo antes do ajuste. O modelo pré-treinado de cyto2 é selecionado, com uma taxa de aprendizado de 0,1 e 100 épocas de treinamento (valores padrão), que determinam, respectivamente, a velocidade de atualização dos pesos do modelo e o número de passagens de treinamento. Esses padrões são comumente modificados (por exemplo, taxa de aprendizado = 0,15; épocas = 12) para reduzir o tempo de treinamento e adaptar o modelo à morfologia epidérmica das plantas; No entanto, números de época mais baixos podem reduzir o desempenho da detecção e aumentar os falsos positivos. Por favor, clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 6: Cellpose "etiqueta" a máscara. Aplicação da máscara de "etiquetas" Cellpose para uma amostra descascada de F. excelsior (superfície abaxial da folha), mostrando o resultado de um treinamento supervisionado no qual cada objeto segmentado recebe um identificador único. Células epidérmicas (marcadas com e) dominam, enquanto pares de células guardiãs estomáticas (marcadas com g) também são detectados. Falsos positivos são evidentes quando tricomas são classificados erroneamente como células epidérmicas (no canto superior esquerdo) ou estomas (parte inferior central), assim como falsos negativos quando as células epidérmicas permanecem não marcadas em partes da imagem. Esse tipo de máscara é usado para quantificação e refinamento posteriores de modelos supervisionados. Por favor, clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 7: Quantificação de células epidérmicas segmentadas em ImageJ/Fiji. Capturas de tela mostrando quantificação segmentada de células epidérmicas após a classificação de pixels de ilastik para uma amostra descascada de F. excelsior (superfície abaxial da folha). (A) Na máscara exportada, cada cluster de pixels detectado corresponde a uma partícula individual, permitindo a extração automática de métricas em nível de objeto (por exemplo, área, perímetro, diâmetros de Feret). A janela de Resultados (na parte inferior) exibe medições brutas para milhares de objetos; Note o número excepcionalmente alto de pequenas partículas surgindo de ruídos de pontos "minúsculos" e contornos fragmentários, indicando a presença de numerosos falsos positivos. Esses artefatos requerem filtragem subsequente biologicamente informada para isolar células epidérmicas verdadeiras antes da análise estatística a jusante. (B) Filtragem baseada em área de objetos epidérmicos segmentados em ilástico no ImageJ/Fiji. Pequenos fragmentos e ruído são excluídos aplicando um limiar de área mínima de 150-350 μm², reduzindo o número de partículas detectadas em aproximadamente uma ordem de magnitude (dez vezes) em relação à máscara não filtrada no painel A. Embora essa etapa de filtragem remova substancialmente pequenos falsos positivos, a classificação imperfeita persiste: contornos fragmentados e elementos não epidérmicos residuais permanecem e exigem refinamento adicional, como limiares de circularidade ou triagem pós-triagem biologicamente informada. Por favor, clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 8: Pós-processamento de uma máscara de "etiquetas" do Cellpose no ImageJ/Fiji. Ao usar o plugin Labels to ROIs para uma amostra descascada de F. excelsior (superfície abaxial da folha), cada objeto segmentado na máscara é convertido em uma região de interesse (ROI), permitindo a inspeção e medição individual de células epidérmicas e complexos celulares de proteção estomática. Os ROIs são sobrepostos à micrografia original (à esquerda), enquanto a janela de Resultados (canto inferior direito) exibe métricas em nível de célula (por exemplo, área, diâmetros de Feret, perímetro). Essa etapa permite uma curadoria biologicamente informada, permitindo que os usuários verifiquem se cada ROI corresponde a uma célula epidérmica verdadeira e descartem artefatos como tricomas ou estomas mal segmentados que persistem após a filtragem limiar, informando assim as etapas subsequentes da análise. Por favor, clique aqui para baixar esta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para medições estomáticas consistentes, as cascas devem ser retiradas da lâmina central para obter resultados padronizados, evitando veias maiores, pois a densidade estomática apresenta forte variação dentro da folha, diminuindo em direção à base, ponta e margens da^{folha 25,26}. Folhas frescas produzem as cascas mais confiáveis, desde que esmalte transparente e não encolhível e fita transparente de alta qualidade sejam usados para evitar distorções ou artefatos. Atrasos além de ~12 horas reduzem a clareza dos contornos por desidratação. Como os peelings são montados temporariamente e podem reter ar, a imagem precoce é recomendada, mas a qualidade permanece aceitável também após um mês.

Existem vários métodos de limpeza para tipos específicos de tecido, metas de imagem e considerações de^segurança 13,14,15. A eliminação química foi realizada usando um protocolo aquoso baseado em NaOH para sua acessibilidade, baixa toxicidade e ampla aplicabilidade entre tipos de folhas. Como as respostas dos tecidos variam entre as espécies, testes e otimização são necessários. Folhas esclerófilas podem levar ≥2 semanas, e tecido verde residual pode interferir na mancha e obscurecer características anatômicas (Figura suplementar 1C). Para uma limpeza mais rápida, a concentração de NaOH pode ser aumentada para 2,5 M ou 5 M. Folhas macias tornam-se frágeis após o branqueamento (Seção 3.7; Figura suplementar 1B), e a exposição excessiva ao hipoclorito de sódio (NaClO) podem degradar tecidos ou causar separação da camada epidérmica. Embora 30 s a 2 minutos de branqueamento sejam suficientes para a maioria das folhas macias, espécies mais resistentes podem precisar de até 1 h²⁷. Embora a limpeza seja mais lenta que a preparação da casca, exigindo ~5 dias e sem treinamento especializado, pode ser ajustada para espécies diversas. Amostras limpas e manchadas podem ser armazenadas em água destilada a 4°C, com a fixação permanente recomendada para preservação a^{longo prazo 15,27}.

O StoManager1 específico de estomatas detectou de forma confiável complexos estomais na maioria dos tipos de imagem (Figura suplementar 2), com resultados de detecção geralmente consistentes com anotação manual para métodos baseados em peel. No entanto, as medições de área estomática diferiram sistematicamente das medições manuais (Tabela 2), exigindo calibração baseada em um pequeno subconjunto medido manualmente (por exemplo, 10-20 estomatas por espécie) antes da análise em grande escala. O StoManager1 aumenta substancialmente a taxa de transferência, sendo necessária verificação manual em casos não padronizados.

A segmentação simultânea estoma-epiderme é desafiadora porque a nitidez ótima difere, e a heterogeneidade na morfologia e clareza das membranas introduz erro de segmentação. Da mesma forma, treinar em conjuntos grandes de imagens (por exemplo, superfícies adaxiales/abaxiais, descascadas/limpas) perde especificidade. Não existe um modelo Cellpose pré-treinado para a epiderme vegetal; Os modelos padrão "CITO" e "CYTO2", treinados principalmente em células animais, têm desempenho inferior em imagens epidérmicas. Portanto, é necessário treinamento personalizado para confiabilidade (Seção Suplementar 2). Mesmo após o treinamento, a supersegmentação e falsos positivos continuam comuns, especialmente em imagens de baixo contraste ou não aclaradas (Figura suplementar 3).

No ilastik (seção suplementar 3, figura suplementar 4), máscaras de objeto devem ser geradas para as classes celulares-alvo (por exemplo, classe 1 para epiderme), mantendo máscaras de classe para auditoria e correção manual. O processamento em lote e os fluxos de trabalho subsequentes do ImageJ/Fiji podem economizar tempo e reduzir erros manuais. Filtragem consistente por área, desvio padrão ou quantículos é essencial para suprimir ruído e detecções espúrias. Após a filtragem, a área da célula mediana e a contagem de células se aproximam dos valores manuais. A comparação com medições manuais e ferramentas alternativas de ML (Weka, RootPainter) continua essencial para ajustar parâmetros e avaliar a qualidade da segmentação. O processamento em lote de ML consome muitos recursos. Treinamento estável e segmentação em lote em larga escala exigem uma GPU compatível com NVIDIA CUDA e ≥32 GB de RAM. Em sistemas de médio porte (por exemplo, 16 GB de RAM com gráficos integrados), o treinamento supervisionado normalmente requer ~5-10 minutos para <10 imagens e frequentemente travava quando múltiplas classes de anotação ou tipos de imagem heterogêneos eram usados. O CUDA aumentou a velocidade de processamento em ~10-20x em relação à execução da CPU ou GPU integrada.

Diferenças de desempenho entre Cellpose, ilastik e StoManager1 surgem de suas representações distintas de características. Cellpose prevê campos de fluxo vetorial em direção aos centros do objeto e é sensível a halos ópticos e limites refrativos abruptos, que interrompem o fluxo e geram agrupamentos de falsos positivos em F. excelsior resolvido. Ilastik, como classificador de pixels guiado por humanos, sobresegmenta paredes celulares de pavimento em alto relevo ou halos, a menos que explicitamente rotulado como fundo. O StoManager1 detecta complexos estomatais usando padrões de forma em nível de objeto (células guarda pareadas com um poro central) e tem bom desempenho em preparações de peeling, incluindo F. excelsior²⁸; no entanto, o borramento induzido por halo afeta a visibilidade dos poros na limpeza, produzindo falsos negativos em vez de classificação incorreta (seções 1 e 3 dos arquivos suplementares). Assim, Cellpose e StoManager1 operam como segmentadores automatizados, enquanto ilastik funciona como classificador guiado por humanos (Arquivossuplementares seções 1-3)²⁸^,.

A arquitetura celular específica de espécie modula o desempenho da IA. Em T. officinale, margens suaves e elípticas da célula guarda correspondem à distribuição de treinamento do StoManager1, permitindo a detecção em amostras descascadas (Figura suplementar 2), enquanto ferramentas generalistas frequentemente confundiam células de guarda e de pavimento. Em F. excelsior, estomas recuados e células pavimentadas em alto relevo levam a falsos negativos em imagens apagadas. Essas discrepâncias refletem geometria de imagem dependente da espécie e da preparação. Diferenças sistemáticas entre medições manuais e derivadas de IA surgem de duas fontes: a ausência de codificação em escala a partir da imagem pela IA e artefatos ópticos induzidos pela preparação. As estratégias de mitigação incluem triagem visual de borrões e halos da preparação tecidular, uso preferencial de peelings sob condições descritas acima, calibração manual com correção linear em um pequeno subconjunto de estomas (manual = a + b × IA). Estratégias adicionais incluem aumento específico de táxons e design de classes auxiliares para treinamento (no entanto, os treinados por si mesmos provavelmente permanecerão abaixo dos modelos pré-treinados em grandes conjuntos de dados diversos), e filtragem de quantiles superiores pós-segmentação.

Como os erros de segmentação da IA são sistemáticos e não aleatórios, o pós-processamento é essencial. Diagnósticos de qualidade de imagem podem seguir uma árvore de decisão simples. Comece verificando o contraste e a nitidez epidérmica: se for agudo, passe para falsos positivos; Se estiver borrado, espere pequenos artefatos de alta frequência e ajuste os filtros. Se falsos positivos (por exemplo, pontos, detritos) forem mínimos, ±2-3 filtragem de outliers SD geralmente é suficiente. Se pequenos artefatos dominarem, use filtragem baseada em quantis. Depois, compare as distribuições de características (por exemplo, mediana Ae) com expectativas biológicas ou dados manuais. Refinar os limiares conforme necessário – manter apenas quantis superiores de 10-50% em conjuntos de dados ricos em artefatos garante resultados significativos (Figurassuplementares 7 e 8). Devido às altas taxas de falsos positivos produzidas por ferramentas de ML epidérmico, estimativas confiáveis de densidade estomática não puderam ser derivadas automaticamente, enquanto o StoManager1 forneceu medições estomatais^{precisas 28} quando os limites estavam claros (ver Figuras 6 e 7). Para a mediana epidérmica, Ae mostrou-se robusta, sendo menos sensível a pequenos falsos positivos do que a média.

A escolha do método influenciou a detecção de traços. A descascação superou a limpeza da densidade estomática ao expor totalmente os estomatas (Figura 3), enquanto a limpeza frequentemente ocultava estomatas menores em tecidos em camadas ou pigmentados, apesar de às vezes preservar melhor a forma estomática²⁷. Entre as ferramentas de IA, o StoManager1 forneceu consistentemente medições estomáticas robustas com curadoria mínima, especialmente em preparações de^{peeling 23}, e o peeling também melhorou as medições epidérmicas ao aumentar células corretamente identificadas e a cobertura^{de imagem 2}. Os ganhos futuros provavelmente deverão surgir de modelos pré-treinados grandes, taxonomicamente diversos, para integração em pipelines automatizados de imagem para ecofisiologia e melhoria de culturas.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores reconhecem o Programa H2020 da União Europeia (projeto GAIN4CROPS, GA nº 862087). O Centro de Excelência AgroCropFuture Agroecology e novas culturas em climas futuros (Ministério da Educação e Pesquisa da Estônia), Conselho de Pesquisa da Estônia (PRG 3201, PRG 2207 e TARISTU24-TK28).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Desinfetante líquido limpador NaClO < 5%	Domestos, GB	H000023244	Queimaduras na pele
Fosfato de hidrogênio dissódico diidratado (Na₂HPO₄^. 2H₂O)	PENTA, CZ	10028-24-7	NA
Etanol, abs. 100% de a.r.	Chem-Lab NV, BE	CL00.0505.1000	Altamente inflamável & nbsp;
Frasco de vidro 2 mL	VWR Ciências da Vida, EUA	548-0045
Solução de glutaraldeído 50%	VWR Ciências da Vida, EUA	23H2856331	Fatais se inalados. Tóxico se engolido. Use luvas de proteção, roupas, Óculos.
Lâminas de microscópio	Normax, PT	5470308A	NA
Camada de limpeza rápida para cuidados com unhas	BK (INEZA), LT	LT-02244	NA
Nikon Eclipse E600 e Nikon DS0Fi1 5 MP	Nikon Corporation, JP	https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600	NA
Pipeta e pontas de pipeta	Termociência, FI	KJ16047	NA
Lâminas de aço de um solo gume	Instrumentos Oxford	51-1625-0182	NA
Dihidrogênio fosfato de sódio (NaH₂PO₄^. 2H₂O) puro	PENTA, CZ	13472-35-0	NA
Pellets de hidróxido de sódio (NaOH) puros	Merck KGaA, DE	1310-73-2	Queimaduras graves.
Fita transparente para papelaria	FOROFIS, LV	91231	NA
Azul toluidina, grau de uso geral	ThermoFisher Scientific, GB	2045836	NA