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Artigo de método

Geração e manipulação genética de organoides cervicais humanos

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DOI:

10.3791/69617

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10 de março de 2026

 ,  ,  , 
1Department of New Biology, DGIST, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University Chilgok Hospital, 3Clinical Omics Institute, Kyungpook National University, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University School of Medicine, 5New Biology Research Center, DGIST, 6Graduate Program in Biomedical Science & Engineering, DGIST

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo detalhado para estabelecer e manipular geneticamente organoides cervicais humanos.

Resumo

O câncer cervical é o quarto câncer mais comum em mulheres e afeta com mais frequência o ectocolo uterino. O ectocervix uterino é revestido por epitélio escamoso estratificado, composto por células basais e células parabasais e suprabasais diferenciadas. A regeneração observada após a conização cervical sugere a presença de forte atividade de células-tronco. No entanto, nosso entendimento sobre a identidade e os mecanismos regulatórios das células-tronco cervicais e seu processo de transformação maligna tem sido limitado devido ao acesso restrito aos tecidos cervicais humanos e à falta de sistemas ideais para avaliar a atividade das células-tronco no ectocervix uterino. Organoides cervicais humanos recentemente estabelecidos podem ajudar a superar essas limitações e oferecer novas oportunidades para estudar fisiologia e patologia cervical. No entanto, não existe um método padronizado para isolar e estabelecer organoides cervicais humanos. Aqui, descrevemos um método para estabelecer organoides ectocervicais humanos. Especificamente, apresentamos um protocolo para isolar células individuais do epitélio ectocervical humano. Ao incubar tecido cervical em uma solução enzimática otimizada, removemos o epitélio cervical para maximizar o rendimento celular e minimizar a contaminação por fibroblastos. Detalhamos ainda as condições para o cultivo de organoides cervicais humanos usando uma formulação otimizada de meio. Além disso, detalhamos os procedimentos para a passagem e manipulação genética dos organoides cervicais. Esse protocolo oferece uma abordagem altamente eficiente para estabelecer organoides cervicais humanos e utilizá-los para estudar células-tronco e doenças cervicais.

Introdução

O ectocervix uterino é o local mais comum para câncercervical 1,2. Embora o câncer cervical tenha diminuído após a introdução da vacinação contra o papilomavírus humano (HPV) em países desenvolvidos, globalmente ele ainda permanece como o quarto câncer mais comum entremulheres 3,4. Além disso, a incidência de lesões pré-cancerosas cervicais continua aumentando em algunspaíses 5,6. Embora a lesão intraepitelial escamosa de baixo grau (LSIL) frequentemente regredia sozinha, a lesão intraepitelial escamosa de alto grau (HSIL) apresenta risco de progressão para câncer invasivo e normalmente requer intervenção cirúrgica, como excisão ou conização. Esses procedimentos podem encurtar o ectocervice e aumentar o risco de aborto espontâneo ou partoprematuro 7,8. Um entendimento mais profundo da biologia cervical, aliado ao desenvolvimento da terapia regenerativa, pode ajudar a enfrentar esses desafios, mas requer sistemas modelo robustos e fisiologicamente relevantes.

Modelos animais avançaram significativamente nossa compreensão sobre a homeostase cervical, mecanismos de doenças e estratégias terapêuticas. No entanto, suas diferenças inerentes em relação à biologia e patologia humanas limitam seu valor translacional. Como alternativa, os organoides surgiram como plataformas poderosas para modelar a biologia humana e as doenças. Organoides são microestruturas tridimensionais derivadas de células-tronco que recapitulam a histologia e as assinaturas moleculares de seu tecidode origem 9,10,11. Eles foram empregados para identificar diversas células-tronco de tecidos humanos em vários tecidos, incluindo traqueia, esôfago e colo doútero 12,13,14. Além disso, os organoides possibilitam a manipulação genética, possibilitando a modelagem da patogênese de diversas doenças, incluindo cânceres efibrose 15,16,17. Além disso, os organoides servem como uma plataforma eficaz para a triagem da eficácia e toxicidade de medicamentos ou terapiascelulares 18,19,20,21.

Recentemente, dois grupos independentes estabeleceram sistemas organoides cervicais humanos22,23. Com base nesses avanços, melhoramos significativamente a eficiência da cultura de organoides cervicais e identificamos células-tronco cervicaishumanas 13. Além disso, ao remover o epitélio cervical, minimizamos a inclusão de fibroblastos sob o epitélio cervical. Ao empregar organoides cervicais com manipulação genética, descobrimos o papel dos metabólitos microbianos e suas vias posteriores na manutenção da homeostase cervical e na prevenção da progressão pré-cancerosa. Assim, um protocolo padronizado e otimizado para gerar, manter e modificar geneticamente organoides cervicais servirá como uma ferramenta essencial para estudar a biologia e patologia cervical.

Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado e otimizado para gerar e passar organoides cervicais humanos. Também descrevemos um protocolo para manipulação genética deles via eletroporação.

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Protocolo

O isolamento celular e a cultura organoide utilizando tecidos cervicais humanos foram aprovados e realizados de acordo com todas as normas éticas relevantes pelos comitês internos de revisão do DGIST, Daegu, Coreia, e do Hospital Nacional Universitário Chilgok Kyungpook, Gyeongsangbuk-do, Coreia (DGIST-20210401-BR-112-01 e KNUCH-2020-12-020-001). Tecidos ectocervicais humanos foram fornecidos pelo Departamento de Obstetrícia e Ginecologia do Hospital Nacional da Universidade Chilgok Kyungpook. Tecidos cervicais saudáveis foram obtidos de pacientes que passaram por histerectomia laparoscópica total para suas doenças uterinas benignas. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes.

1. Isolamento de célula única dos tecidos ectocervicais

NOTA: Este protocolo começa com uma amostra de biópsia de ectocérvix humano com aproximadamente 5 mm × 5 mm × 5 mm de tamanho (Figura 1).

  1. Coloque o tecido biópsico em uma placa de Petri de 10 cm e lave uma vez com DPBS gelado (sem cálcio e magnésio) para remover sangue e detritos.
    NOTA: Os tecidos cervicais humanos foram transportados para o laboratório em até 3 horas após a cirurgia em DMEM/F12 Avançado gelado e processados imediatamente após a chegada.
  2. Transfira o tecido para um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de solução de Dispase (2,4 U/mL) e incube por 1 hora a 37 °C com agitação suave em um tubo rotador (20 rpm).
    NOTA: A solução de Dispase (2,4 U/mL) foi preparada imediatamente antes do uso, dissolvendo o pó de Dispase até a concentração de trabalho em DPBS gelado.
  3. Transfira a amostra para uma nova placa de Petri de 10 cm. Separe cuidadosamente a camada epitelial branca do restante do tecido usando pinças.
  4. Use pinças afiadas para descolar suavemente a superfície epitelial como uma folha intacta. Transfira imediatamente a camada epitelial isolada para um tubo cônico de 50 mL mantido no gelo.
    NOTA: Se o epitélio superficial não for facilmente removido, raspe a superfície com pinças de extremidade romba.
  5. Adicione 1 mL de uma solução de dissociação à base de tripsina recombinante à amostra descascada ou raspada e transfira toda a mistura para um tubo cônico de 50 mL.
  6. Mantenha o tecido restante da etapa anterior no outro tubo cônico de 50 mL.
  7. Incube o tubo cônico de 50 mL contendo o epitélio cervical a 37 °C por 5 minutos com agitação suave em um rotador do tubo (20 rpm).
  8. Adicione 10 mL de Buffer Bloqueador Gelado recém-preparado (PBS com soro de bezerro bovino (BCS) a 2% na suspensão celular para interromper a reação enzimática.
  9. Centrifuge o tubo a 450 × g por 5 minutos a 4 °C. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
    NOTA: Se o sangue for observado visualmente no tecido dissociado ou se o tecido parecer pegajoso, prossiga com a seguinte etapa. Caso contrário, pule para o passo 1.13.
  10. Adicione 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos 1X e 20 μL de DNase (10 U/μL de estoque) ao pellet. Incube em temperatura ambiente por 5 minutos para lisar glóbulos vermelhos e quebrar o DNA pegajoso.
  11. Adicione 10 mL de Buffer Bloqueador gelado (PBS com soro de bezerro bovino (BCS) a 2% à suspensão celular para interromper a reação enzimática.
  12. Centrifuge o tubo a 450 × g por 5 minutos a 4 °C. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
  13. Lave o pellet celular com um tampão bloqueador gelado (PBS com soro de bezerro bovino (BCS) a 2%.
  14. Centrifuge o tubo a 450 × g por 5 minutos. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
  15. Resuspenda o pellet celular em 200-500 μL de meio de cultivo organoide.
  16. Conte o número de células usando hemocitômetro com solução de tripano azul. O rendimento esperado das células fica entre 50.000 e 500.000 células por amostra de biópsia.

2. Semeadura e cultura de organoides ectocervicais

  1. Resuspenda de 500 a 2.000 células viáveis em um volume final de 50 μL de meio de cultivo organoide (composição descrita na lista de materiais) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. A viabilidade celular foi avaliada por exclusão de azul de tripano antes da semeadura.
  2. Adicione 50 μL de uma matriz de membrana basal (por exemplo, Matrigel) à suspensão celular. Misture delicadamente sobre gelo para evitar a formação de bolhas e dispense a mistura de 100 μL no interior de um inserto de cultura celular colocado em uma placa de 24 poços. Todos os procedimentos envolvendo o manuseio da matriz de membrana do basamento foram realizados em gelo ou a 4 °C para evitar gelificação prematura, salvo especificação em contrário.
  3. Incube a placa por 20-30 minutos a 37 °C até que a mistura matriz membrana basal solidifique.
  4. Uma vez que a mistura tenha solidificado, adicione 400 μL de meio de cultura organoide ao poço abaixo do inserto.
  5. Cultive os organoides por 1 a 2 semanas até que atinjam um diâmetro médio de 150-250 μm (o diâmetro máximo é cerca de 500 μm).
    NOTA: Quando os organoides atingem um tamanho apropriado e apresentam o padrão lamelar concêntrico das microestruturas semelhantes à pele de cebola, considere a passagem se necessário.

3. Dissociação e resemeadura de organoides

  1. Adicione 1 mL de solução de Dispase (2,4 U/mL) sobre o inserto de cultura celular e dissocia suavemente a matriz da membrana basal usando uma pipeta.
  2. Transfira a mistura da matriz de membrana basal dispase para um tubo de 15 mL e incube por 1 hora a 37 °C.
  3. Adicione 10 mL de Buffer Bloqueador Gelado recém-preparado (PBS com soro de bezerro bovino (BCS) a 2% na suspensão celular para interromper a reação enzimática.
  4. Centrifuge o tubo a 450 × g por 5 minutos a 4 °C.
  5. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet em 200 μL de TrypLE Express.
  6. Incube por 5 minutos a 37 °C.
  7. Adicione 1 mL de tampão bloqueador gelado (PBS com soro de bezerro bovino (BCS) a 2% e pipete suavemente para neutralizar a enzima.
  8. Filtre a suspensão por um filtro de célula de 40 μm para obter células individuais.
  9. Centrifuge o tubo a 450 × g por 5 minutos a 4 °C. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
  10. Resuspenda o pellet celular em 200-500 μL de meio de cultivo organoide.
  11. Conte o número de células usando hemocitômetro com solução de tripano azul. O rendimento esperado da célula está entre 50.000 e 500.000 células por poço de inserção de cultura celular de 24 poços.
  12. Depois, resuspenda 500-2.000 células em 50 μL de meio de cultivo organoide (composição descrita na lista de materiais). Adicione 50 μL de matriz de membrana basal à suspensão celular. Misture suavemente, evite a formação de bolhas e dispense a mistura de 100 μL no interior de um inserto de cultura celular colocado em uma placa de 24 poços.
  13. Incube a placa por 20-30 minutos a 37 °C até que a mistura matriz membrana basal solidifique.
  14. Uma vez que a mistura esteja totalmente solidificada (normalmente após 20-30 minutos a 37 °C), adicione 400 μL de meio de cultura organoide ao poço abaixo do inserto.
  15. Cultive os organoides por 1 a 2 semanas em meio de cultivo organoide (composição descrita na lista de materiais) usando um método 3D de matriz extracelular embutida. Mantenha as culturas a 37 °C, 5% de CO₂ em uma incubadora umidificada. Substitua o meio a cada 2-3 dias e monitore o crescimento até que os organoides atinjam um diâmetro médio de 150-250 μm.
  16. Passem os organoides para a próxima rodada quando atingirem o tamanho adequado e exibam o padrão lamelar concêntrico de microestruturas semelhantes a pele de cebola, se necessário.

4. Manipulação genética de organoides cervicais humanos por eletroporação

NOTA: Este protocolo é baseado no uso de um Lonza Amaxa 4D-Nucleofector e do Kit P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X (#V4XP-4032).

  1. Após o isolamento da suspensão de células cervicais humanas, transfira de 100.000 a 200.000 células para cada tubo de 1,5 mL.
  2. Centrifuge os tubos a 450 × g por 3 minutos a 4 °C. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
  3. Resuspenda o pellet celular em 20 μL da mistura de Solução/Suplemento Nucleofector do Kit P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X. A mistura é preparada combinando 16,4 μL de Solução Nucleofector e 3,6 μL de suplemento por tubo.
  4. Adicione 300 nM de siRNA oligo controle ou alvo a cada tubo contendo as células ressuspensas. Misture suavemente pipetando.
    NOTA: O volume do oligo do siRNA não deve exceder 2 μL por tubo.
  5. Transfira cuidadosamente a mistura de nucleofecção (20 μL de células ressuspensas em mistura de solução/suplemento nucleofector + até 2 μL de siRNA; total 20-22 μL) para os vasos da cuveta de eletroporação do kit P4 Primário 4D-Nucleofector X.
  6. Bata suavemente nos vasos Nucleocuvette para garantir que a amostra cubra o fundo da cuvetta.
  7. Feche a tampa dos Vasos Nucleocuvette e coloque-a no retentor de uma unidade 4D-Nucleofector ligada.
    NOTA: Certifique-se da orientação correta dos vasos Nucleocuvette no retentor.
  8. Inicie o processo de nucleofecção. Defina o código de pulso EA-125 para cada cubeta com o processo da célula primária P4.
  9. Após a conclusão, remova cuidadosamente os Vasos Nucleocuvette do aparelho.
  10. Incube os vasos Nucleocuvette em temperatura ambiente por 10 minutos para permitir que as células se estabilizem.
  11. Abra a tampa dos Vasos Nucleocubette, adicione 180 μL de meio de cultura organoide pré-aquecido a 37 °C a cada cuveta e transfira suavemente a suspensão celular para um novo tubo de 1,5 mL para ressuspensão.
  12. Pegue um volume de suspensão celular contendo 500-2.000 células e o ressuspenda em meio de cultura organoide até um volume final de 50 μL.
    NOTA: Não descarte as células restantes da etapa 4.12. Eles serão usados na etapa 4.14.
  13. Cultive os organoides seguindo o protocolo do Método 2: Semeadura e Cultura de Organoides do Ectocervix. Compare os efeitos do siRNA avaliando diversos fatores, incluindo o número, tamanho e estrutura dos organoides resultantes.
  14. Dispense as células restantes do passo 4.12 em uma placa de fixação ultrabaixa de 96 poços e incube por 48 horas a 37 °C.
  15. Após 48 horas, transfira as células para um tubo de 1,5 mL e centrifuge a 450 × g por 3 minutos. Descarte o supernadante.
  16. Use o pellet celular para experimentos de PCR em tempo real para confirmar a eliminação dos genes-alvo e avaliar quaisquer alterações na expressão gênica.
    NOTA: Todos os tecidos cervicais humanos e suspensões celulares devem ser tratados como material potencialmente infeccioso. Realizar todos os procedimentos envolvendo espetáculos humanos primários em um gabinete de biossegurança certificado sob as práticas BSL-2 e de acordo com as normas éticas e de biossegurança institucionais. Use equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, luvas e proteção ocular) e desinfete superfícies e equipamentos de trabalho após o uso com um desinfetante aprovado pela instituição. Reagentes enzimáticos (por exemplo, enzimas de dispase e dissociação, como TrypLE Express) podem causar irritação na pele e nos olhos e podem gerar aerossóis durante a pipetagem; evite a geração de aerossols, mantenha os tubos tampados sempre que possível e enxágue imediatamente com água em caso de contato, seguindo os procedimentos de exposição institucional e as orientações de SDS do fabricante. Descarte todos os resíduos biológicos (incluindo materiais contendo matrix e plásticos contaminados) conforme as diretrizes institucionais. Para eletroporação de siRNA, siga as instruções de segurança elétrica do fabricante: certifique-se de que as cuvetas estejam devidamente encaixadas e a tampa totalmente fechada antes de iniciar os pulsos, evite operar o dispositivo com luvas molhadas ou perto de derramamentos, inspecione o dispositivo e acessórios para danos e evite contato direto com os eletrodos da cuveta imediatamente após o pulso.

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Resultados

Cultura 3D de organoides cervicais humanos

Tecidos ectocervicais humanos recém-isolados foram dissociados em células individuais na ordem mencionada acima, que foram então placadas sobre inserções de cultura celular de 24 poços e cultivadas para formar organoides cervicais conforme descrito neste protocolo (Figura 1). Organoides cervicais humanos crescem até 500 μm de diâmetro a partir de células individuais ao lo...

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Discussão

Neste manuscrito, descrevemos o protocolo para estabelecer e passar organoides cervicais humanos. Também fornecemos um protocolo para manipulá-los geneticamente, o que avança significativamente o estudo da biologia e patologia cervical. Embora tenhamos otimizado o protocolo especificamente para organoides uterinos humanos, nosso protocolo pode ser aplicado a outros sistemas organoides com pequenas modificações.

As informações essenciais para estabelecer e otim...

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Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado por uma bolsa do Ministério da Saúde e Bem-Estar (RS-2024-00439434 para Y. Jeong).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de Núcleo X 4D de Célula Primária P4LonzaV4XP-4032
Placa de fixação ultrabaixa de 96 poçosSPL39796
Filtro celular 40 & micro; mSPL93040
Tubo cônico de 50 mL 500/caixaFonoaudiologiaSPL50050
Tubo cônico de 15 mlSarstedt62.554.502
Tubo CryoPure 1,8 mL - brancoSarstedt72.379P
37 & deg; C, 5% CO2 & nbsp; incubadoraEppendorf9734IQ905476
Inserto de cultura celularSPL37024
Amaxa 4D-NucleofectorLonzaAAF-1003X
Buffer de bloqueio (BCS de 2% em DPBS)Gibco / WelgeneBCS: 26010074; DPBS: LB001-02
Pólvora Dispase IIGibco17105041
DNAse IEnzimômicaM059L
MatrigelCorning356231
Buffer de lise de glóbulos vermelhosBiosesangR2015
TrypLE ExpressGibco12605
Amortecedor de lavagem (HBSS)JBIBL003-1
DMEM/F12 AvançadoGibco12634028
Suplemento GlutaMAXGibco35050-061
Penicilina– EstreptomicinaBiowestL0022-100
HEPESGibco15630-080
Suplemento B27Gibco17504044
NogginPeproTech118214
N-acetil-l-cisteínaSigmaA9165
Y-27632Tecnologias STEMCELL72307
FGF2PeproTech100-18B-50UG
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG
A83-01SelleckchemS7692 
ForskolinSigmaF6886
Neuregulina 1PeproTech100-03-50UG
NGFPeproTechAF-450-01-100UG
R-spondinSinobiológico11083-HNAS
HGFPeprotech100-39H-250ug
FGF10Peprotech100-26
Petridish 35 mm SPL10035
receita de mídia organoide
NomeCompanhiaNúmero de Catálogoforte
DMEM/F12 AvançadoGibco12634028
Suplemento GlutaMAXGibco35050-0611x
Penicilina– EstreptomicinaBiowestL0022-1001x
HEPESGibco15630-08010 mM
Suplemento B27Gibco175040441x
sem vitamina A
NogginPeproTech118214100 ng/ml
N-acetil-l-cisteínaSigmaA91651 mM
Y-27632Tecnologias STEMCELL7230710 uM
FGF2PeproTech100-18B-50UG50 ng/ml
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG25 ng/ml
FGF10Peprotech100-26100 ng/ml
A83-01SelleckchemS7692 500 nM
ForskolinSigmaF688610 & mu; M
Neuregulina 1PeproTech100-03-50UG50 ng/ml
NGFPeproTechAF-450-01-100UG20 ng/ml
R-spondinSinobiológico11083-HNAS100 ng/ml
HGFPeprotech100-39H-250ug25 ng/ml

Referências

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Ectocérvice HumanaCultura de OrganoidesIsolamento de Células ÚnicasEpitélio Escamoso EstratificadoEletroporaçãoAtividade de Células-TroncoColoração ImunofluorescenteTriagem de Fármacos
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