Lesão testicular pós-exposição retardada e progressiva em ratos devido a partículas finas (PM2,5)

Resumo

A exposição a PM2.5 induz lesão testicular retardada em modelos de ratos por meio de respostas inflamatórias sustentadas, aumento da apoptose das células germinativas, regulação negativa de Connexin-43/Ocludin e sinalização consistente com a ativação da via JNK, destacando sua ameaça a longo prazo à saúde reprodutiva masculina.

Resumo

Partículas finas (PM2,5) estão cada vez mais implicadas na prejuízo reprodutivo masculino. No entanto, como a maioria das pesquisas permanece focada em áreas agudas,, persistentes ou progressivas no dano testicular pós-exposição — críticas para avaliação de risco de longo prazo — ainda são pouco compreendidas. Estabelecemos um modelo de ratos com resolução temporal para determinar se a lesão persiste ou piora após a exposição. Setenta e dois ratos Sprague-Dawley machos foram randomizados em nove grupos (controle; veículo às 24 horas, 1, 2 e 4 meses; PM2,5 nos mesmos pontos) e recebeu PM2,5 intranasal a 5 mg/kg/dia por 7 dias. Quantificamos a qualidade dos espermatozoides e os índices dos órgãos reprodutivos, examinamos histologia e ultraestrutura testicular, medimos testosterona sérica, FSH, LH e E2, perfilamos os mRNAs inflamatórios das citocinas (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ), avaliamos a apoptose das células germinativas pelo TUNEL e avaliamos proteínas juntais e relacionadas ao estresse (Connexin-43, Ocludin, JNK). A exposição a PM2,5 resultou em quedas sustentadas na concentração e motilidade dos espermatozoides, além de aumento das malformações e atrofia testicular e epididimal que não se recuperaram durante o período pós-exposição de 4 meses. A histologia mostrou afinamento progressivo do epitélio seminífero e degeneração ultraestrutural. Também foi evidente distúrbio endócrino, com redução de testosterona e alteração das gonadotrofinas. Mecanicamente, a exposição a PM2,5 manteve expressão elevada de IL-1β e IL-6, promoveu a apoptose das células germinativas e reduziu a Connexin-43 e Ocludin, ao mesmo tempo em que exibia padrões consistentes com a ativação da via JNK. Juntos, esses achados demonstram toxicidade testicular retardada e progressiva após o término da exposição a PM2,5 e sugerem que preservar a integridade da junção e direcionar o JNK pode mitigar danos reprodutivos a longo prazo.

Introdução

PM2.5, uma mistura complexa de partículas finas com diâmetro aerodinâmico de ≤2,5μm, origina-se de emissões industriais, escapamento de veículos e combustão de biomassa, e emergiu como um dos principais poluentes^{ambientais globais.} Estudos epidemiológicos relacionam a exposição a PM2.5 a doenças respiratórias^{e cardiovasculares 2}, bem como a comprometimentos do sistema^{reprodutor 3}. O impacto na fertilidade masculina é particularmente preocupante devido às evidências de que a poluição do ar pode reduzir a qualidade do^{esperma 4}. Fatores masculinos contribuem para mais da metade dos casos de infertilidade globalmente, e múltiplos estudos relatam declínios significativos nos parâmetros do esperma nas últimas^{décadas 5}. Análises globais recentes confirmam ainda quedas generalizadas na qualidade do esperma em múltiplas^{regiões 6}. Embora fatores como tabagismo, uso de álcool, radiação e exposição a produtos químicos sejam riscos^{estabelecidos 7}, PM2.5 surgiu como um tóxico reprodutivo adicional que atinge os^{testículos 8}.

Os testículos são altamente sensíveis a tóxicos ambientais devido à sua estrutura fisiológica única e atividade espermatogênica contínua. Pesquisas anteriores indicaram que a exposição ao PM2,5 pode induzir danos testiculares por múltiplas vias, como estresse oxidativo, respostas inflamatórias e rompimento da barreira^{sangue-testículo 9}. Esses efeitos agudos são caracterizados por redução da qualidade do esperma, histologia testicular anormal e desequilíbrios^{hormonais 10}. No entanto, a maioria dos estudos foca em lesões imediatas, deixando os efeitos de longo prazo ou retardados pouco caracterizados.

Os modelos atuais de exposição a PM2.5 têm limitações inerentes: a inalação corporal inteira imita a exposição natural, mas requer equipamentos especializados e carece da precisão^{de dose 11}, enquanto a instilação intratraqueal garante controle da dose, mas é invasiva e não replica a deposição fisiológica^{de partículas 12}. Nosso modelo intranasal com resolução temporal evita essas desvantagens — sua entrega não invasiva se alinha com padrões de deposição respiratória superior, permite controle preciso da dose e apoia amostragem multi-time de longo prazo para capturar lesões, que excedem a capacidade dos modelos tradicionais focados em^{agudos 13}.

Nossa dose de 5 mg/kg/dia de PM2,5 está alinhada com paradigmas de exposição subaguda a roedores comprovadamente capazes de provocar respostas reprodutivas e, por conversão da área de superfície corporal, aproxima uma dose equivalente humana ~6 vezes maior que o padrão dos níveis ambientes para acelerar manifestações de toxicidade^{de longo prazo 14}. Considerações sobre espécies se aplicam: embora ratos compartilhem fisiologia testicular conservada com humanos, seu ciclo espermatogênico mais curto pode acelerar a progressão da lesão observada em nossos pontos^{de tempo 15}, e a entrega intranasal difere da deposição respiratória inferior humana, embora a disseminação sistêmica de toxina para testículos seja confirmada.

Os efeitos retardados da exposição a tóxicos ambientais são críticos para avaliar riscos reprodutivos a longo prazo, pois podem revelar danos irreversíveis que não são evidentes em observações de curto^{prazo 16}. Por exemplo, alguns tóxicos podem causar lesões latentes nos testículos, que gradualmente se manifestam ou pioram com o tempo, mesmo após a parada da exposição, potencialmente levando a disfunção reprodutiva^{crônica 17}. Dada a ubiquidade e persistência do PM2.5, determinar se sua toxicidade reprodutiva continua ou piora após a exposição é^{crítico 18}.

Inflamação sustentada, estresse oxidativo e mecanismos de reparo comprometidos são possíveis fatores que causam efeitos retardados. A regulação para cima induzida por PM2.5 de IL-1β, IL-6 e TNF-α pode manter a inflamação crônica, interromper a espermatogênese e promover a apoptose das células^{germinativas 19}. Danos a proteínas de junção chave, como Connexin-43 e Ocludin, comprometem a barreira sangue-testículo e podem impedir a recuperação^{funcional 20}. A ativação da via da quinase C-Jun N-terminal (JNK), mediadora do estresse e da sinalização apoptótica, também foi^{implicada 21}.

Apesar do crescente reconhecimento da toxicidade reprodutiva do PM2.5, há uma lacuna significativa de conhecimento sobre a dinâmica temporal do dano testicular após a cessação da exposição. Especificamente, ainda não está claro por quanto tempo as lesões testiculares persistem, se elas pioram com o tempo e quais vias moleculares impulsionam esses efeitos^{retardados 22}. Abordar essas questões é fundamental para desenvolver estratégias preventivas e terapêuticas direcionadas para mitigar os danos reprodutivos masculinos induzidos por PM2.5.

Persistem lacunas significativas quanto à duração, progressão e mecanismos da lesão testicular induzida por PM2,5 após a cessação da exposição. Este estudo aborda essas lacunas avaliando os desfechos reprodutivos; histopatologia; perfis hormonais — especificamente hormônio folículo-estimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH) e estradiol (E2); inflamação; apoptose; e expressão de proteínas barreira em múltiplos momentos após a exposição. Os achados fornecem insights sobre os riscos reprodutivos a longo prazo do PM2.5 e orientam estratégias de saúde pública para proteger a fertilidade masculina.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as normas institucionais e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Fujian Health College (Aprovação do Projeto nº: DW2024-01).

Segurança e resíduos perigosos
Reagentes tóxicos, incluindo formol, tetróxido de ósmio e clorofórmio, foram manuseados em uma exaustão certificada enquanto se usava o equipamento de proteção individual adequado. Resíduos orgânicos halogenados e soluções contendo ósmio foram coletados em recipientes designados e descartados conforme os requisitos institucionais. O pentobarbital sódico foi registrado como substância controlada, e os objetos cortantes foram manuseados com segurança durante todo o estudo.

Material e manuseio PM2.5
Um material de referência padrão PM2.5 foi usado para a dosagem. Seguindo procedimentos estabelecidos de preparação de partículas, o pó seco foi suspenso em PBS estéril na concentração necessária e sonicado em banho-maria por 10 a 15 minutos imediatamente antes do uso, sem surfactante. As suspensões de trabalho eram preparadas a cada dia. Os níveis de endotoxina foram avaliados por ensaio de lisato de limulus amebocyte e foram indetectáveis. Quando necessário, controles de polimixina-B foram incluídos para excluir efeitos impulsionados pelo LPS.

Construção de modelos animais in vivo
Setenta e dois ratos machos de Sprague-Dawley com SPF (2 meses, 190 ± 10 g) foram alojados em condições padrão e randomizados em nove grupos (n = 8 por grupo), consistindo em um grupo controle, grupos de veículos amostrados aos 24 h, 1, 2 e 4 meses, e grupos expostos a PM2,5 nos mesmos períodos de tempo. PM2,5 foi administrado intranasalmente a 5 mg∙^kg-1∙^dia-1 em 10-20 μL por naris sob anestesia leve de isoflurano uma vez ao dia por 7 dias. Após a administração, os ratos eram colocados em posição supina por 1 a 2 minutos para facilitar a inspiração. Os animais foram mantidos até a eutanásia nos pontos de tempo pós-exposição designados, e a massa corporal foi registrada para cálculos de coeficientes de órgãos. Os critérios finais incluíam coeficientes de órgãos, qualidade do esperma, histologia e ultraestrutura, hormônios reprodutivos séricos e ensaios moleculares.

Morfologia dos órgãos reprodutivos e avaliação da qualidade dos espermatozoides
Testículos e epidídimes foram dissecados sob anestesia pentobarbital profunda, secados e pesados para calcular os coeficientes dos órgãos. Os espermatozoides foram coletados da cauda epidídimo por moção em tampão pré-aquecido a 37 °C. A concentração foi determinada usando um hemocitômetro. A motilidade foi avaliada examinando pelo menos 200 espermatozoides em cinco ou mais campos não sobrepostos em lâminas pré-aquecidas. A morfologia foi avaliada após fixação, espalhamento e coloração com eosina-nigrosina ou Diff-Quik, com pelo menos 200 espermatozoides por rato. Todas as avaliações foram cegas, e as réplicas técnicas foram médias para obter um valor por animal.

Análise histológica e ultraestrutural do tecido testicular
Os testículos foram fixados em formalina tamponada neutra a 10%, processados por etanol e xileno graduados, embutidos em parafina e seccionados a 5 μm para coloração com HE. As seções coradas foram avaliadas usando amostragem aleatória sistemática, com exclusões aplicadas para cortes oblíquos, artefatos ou fixação inadequada. Os diâmetros dos túbulos foram calculados a partir de eixos ortogonais, e a espessura epitelial foi medida em pontos espaçados uniformemente. As análises foram cegas, e um mínimo de 10 túbulos por rato foi avaliado.

Para MET, pequenos blocos de tecido foram fixados em glutaraldeído, pós-fixados em tetróxido de ósmio, desidratados, infiltrados com resina e polimerizados. Seções ultrafinas foram coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo e imagens a 60-120 kV sob configurações consistentes. A QC incluiu avaliação da integridade das membranas e mitocondrias e a evitação de artefatos de extração.

Ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA)
O sangue foi coletado da aorta abdominal sob anestesia dentro de uma janela matinal fixa para controlar a variação circadiana. Após coagulação e centrifugação, o soro era aliquotado e armazenado a −80 °C. Testosterona, FSH, LH e E2 foram quantificados usando uma plataforma de imunoensaio validada. As amostras eram processadas em duplicado com controles apropriados, e a precisão do ensaio seguia as especificações da plataforma. Amostras hemolisizadas ou lipêmicas foram excluídas.

Reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real (RT-qPCR)
O RNA total foi extraído do tecido testicular usando fenol-clorofórmio e purificado por precipitação com isopropanol e lavagem com etanol. A qualidade do RNA foi verificada espectrofotometricamente. CDNA foi sintetizado, e a RT-qPCR foi realizada com química baseada em corantes sob condições padrão de ciclagem, seguida por análise da curva de fusão. Os níveis de expressão foram normalizados para GAPDH usando o método 2^−ΔΔCq .

Análise do Western blot
Lisados proteicos foram preparados em tampão RIPA com inibidores de protease, quantificados por ensaio BCA e desnaturados em tampão de carga. A transferência SDS-PAGE e PVDF foi realizada sob condições controladas. As membranas foram bloqueadas, incubadas com anticorpos primários para Connexin-43, Ocludin, JNK e GAPDH, seguidas por anticorpos secundários conjugados com HRP. As bandas foram detectadas por quimioluminescência, e a densitometria envolveu subtração de fundo, normalização para GAPDH e escalonamento para o grupo controle.

Análise estatística
Os dados foram reportados como médias ± SD. ANOVA unidirecional com o teste post hoc de Tukey ou o teste t de Student foi usado quando apropriado, com dados não paramétricos analisados pelo teste Mann-Whitney U . Um valor-p < 0,05 foi considerado significativo.

Conclusão e Limpeza
Todo o lixo químico perigoso foi registrado e descartado adequadamente. Dados brutos, incluindo saídas de instrumentos e arquivos de análise, eram arquivados com as anotações correspondentes para garantir a rastreabilidade.

Resultados

Deterioração persistente da função reprodutiva masculina em ratos, caracterizada por redução da qualidade do esperma e desenvolvimento dos órgãos reprodutores prejudicados devido à exposição a PM2,5

Foi examinado o impacto do PM2,5 na função reprodutiva masculina, qualidade dos espermatozoides, coeficientes dos órgãos reprodutivos e indicadores relacionados, em nove grupos de ratos machos. As análises foram realizadas em relação ao ponto de tempo pós-exposição de 24 horas. Emb...

Discussão

A exposição de curto período a PM2.5 foi seguida por deterioração progressiva da função reprodutiva masculina após a exposição ao longo de 1 a 4 meses. Esses achados apoiam a toxicidade reprodutiva dependente do tempo que persiste após o fim da dose e estendem observações prévias de comprometimento reprodutivo associado a^{PM2,5 23}.

Para aumentar a reprodutibilidade, padronizamos quatro elementos. Primeiro, a consistência da exposição foi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tetróxido de ósmio a 1%	TCI, China	O0308	Para pós-fixação na análise TEM do tecido testicular
Formalina tamponada com 10% de neutro	Solarbio, China	PC0020	Para fixação de amostras de tecido testicular em coloração HE
2,5% de glutaraldeído	Solarbio, China	G1102	Para fixação de amostras de tecido testicular em análise TEM
75% de etanol	Acros Organics, EUA	61509-0040	Para purificação de RNA precipitado em RT - qPCR
Imager Automático de Quimioluminescência	Bio-Rad, EUA	ChemiDoc	Usado para imagem automática de sinais quimioluminescentes em Western bloting.
Kit de ensaio proteico BCA	Solarbio, China	PC0020	Para determinar a concentração total de proteínas na análise Western blot
Buffer de bloqueio	Não especificado	T7131A	Usado na análise de Western blot para eliminar ligações não específicas
Clorofórmio	Acros Organics, EUA	327270010	Usado na separação de RNA durante RT - qPCR
Connexin - 43	Abcam, EUA	AB11370	Detecta a expressão e distribuição de uma proteína chave da barreira sanguíneo - testículo para ajudar a avaliar a integridade da barreira
Kit ECL	Biosharp, China	BL520B	Para visualizar bandas proteicas na análise de Western blot
Kits ELISA (para testosterona, FSH, LH, E2)	Abcam, Reino Unido	ab108666; ab108702; ab108651; ab108667	Para detectar hormônios reprodutivos séricos
Eosina	Solarbio, China	G1002	Usado na coloração HE de tecido testicular
Resina epóxi	Solarbio, China	GP2001	Para incorporação de amostras de tecido testicular em análise TEM
GAPDH	Abcam, EUA	ab128915	Avalia a apoptose das células testiculares induzida por PM2.5 e fornece uma base morfológica para estudar seu impacto na apoptose das células testiculares
Hematoxilina	Solarbio, China	G1077	Usado na coloração HE de tecido testicular
Sistema de Imagem	Nikon, Japão	Nikon DS-U3	Usado para tirar imagens de amostras ao microscópio.
Isopropanol	Acros Organics, EUA	AC447080025	Usado na precipitação de RNA durante RT - qPCR
JNK	Abcam, EUA	ab124956	Explora o mecanismo molecular da lesão testicular causada pelo PM2.5 e identifica os tipos celulares nos quais ele é ativado
Leitor de Microplacas	DISPOSITIVOS MOLECULARES, EUA	SpectraMax iD3	Usado para detectar sinais em microplacas (por exemplo, absorvida, fluorescência).
Ocludina	Abcam, EUA	ab31721	Compreende o grau de dano da barreira sangue-testículo e explora as interações entre proteínas relevantes
Microscópio Óptico	Chongqing Opto - Instrumento Eletrônico, China	BDS200	Usado para observação microscópica óptica geral.
Microtomo Patológico	Instrumento Kaiyu de Xangai, China	RM2016	Usado para cortar seções de tecidos patológicos.
Pentobarbital sódico	Solarbio, China	G1102	Usado para injeção intraperitoneal em ratos antes da coleta de sangue
Material de referência padrão PM2.5	Instituto Nacional de Metrologia, China	GBW13643	Para exposição a PM2.5 em grupo experimental
Membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF)	Thermo Fisher, EUA	88585	Usado em análise de Western blot para transferência de proteínas
Kit de reagentes PrimeScript RT	TAKARA, Japão	RR037Q	Para síntese de cDNA em RT - qPCR
Sistema de PCR em Tempo Real	Roche, Suíça	LightCycler 480	Usado para reação em cadeia da polimerase em tempo real para análise de expressão gênica.
Buffer de lise RIPA	TAKARA, Japão	RR9161	Para extração de proteínas na análise de Western blot
Shaker	Thermo, EUA	MAXQ-4000	Usado para agitar amostras em experimentos.
SPSS	IBM, EUA	28	Para análise de dados
Solução salina estéril	Solarbio, China	S8160	Uso no tratamento em grupos veiculares
Kit TB Green Premix Ex Taq II	TAKARA, Japão	RR820S	Usado em RT - qPCR
Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)	Hitachi, Japão	HT7800/HT7700	Usado para observação ultraestrutural em escala nanométrica.
Reagente Trizol	Ambion, China	15596018	Para extração de RNA total em RT - qPCR
Ultramicrônomo	Leica, Alemanha	Leica UC7	Usado para cortar seções ultra finas para TEM.
Sistema Universal de Transferência de Proteínas / Máquina de Transferência de Proteína Blot	Bio-Rad, EUA	Trans-Blot Turbo	Usado para transferência de proteína em Western bloting.
Microscópio Óptico Vertical	Nikon, Japão	Nikon Eclipse E100	Usado para observação microscópica óptica vertical.
Acetato de uranila	Merck, Alemanha	201030	Para coloração de seções ultrafinas em análise TEM de tecido testicular