Procedimentos para a Identificação de Inibidores de Entrada do SARS-CoV-2 como Potenciais Antivirais Utilizando Pseudovírus Baseados em MLV

Resumo

Este artigo descreve a metodologia para gerar partículas pseudotipadas de SARS-CoV-2 usando um sistema repórter de luciferase e seu uso para identificar inibidores de entrada. Esses protocolos são demonstrados usando dois diferentes inibidores de entrada, uma proteína de fusão humana recombinante ACE2-Fc e o composto de pequenas moléculas arbidol.

Resumo

O vírus SARS-CoV-2 é um patógeno zoonótico emergente que tem causado uma enorme carga de doenças e mortalidade ao redor do mundo desde seu surgimento em 2019. Plataformas seguras e acessíveis para avaliar a entrada viral e potenciais compostos antivirais continuam essenciais para a descoberta contínua de medicamentos contra variantes emergentes. Este artigo descreve um protocolo altamente otimizado para gerar partículas pseudotipadas baseadas no vírus da leucemia murina (MLV), expressando a proteína spike SARS-CoV-2 e portando um gene repórter de luciferase, possibilitando o estudo da entrada viral sob condições de biossegurança nível 2. Os métodos descritos detalham o uso de linhagens celulares otimizadas, alta eficiência de transfecção usando reagentes econômicos, produção de pseudovírus altamente eficazes e titulação da infectividade para determinar o mínimo de entrada viral para ensaios de triagem. Resultados representativos demonstram atividade robusta de luciferase em células infectadas em comparação com controles não infectados, enquanto os pseudovírus sem pico e VSV-G confirmam a especificidade do ensaio. Além disso, o sistema apoia a triagem de compostos quantificando os efeitos inibitórios na entrada viral e avaliando a citotoxicidade usando um ensaio de viabilidade MTT. No geral, esse protocolo reproduzível e escalável fornece uma plataforma confiável para triagem de média a alta capacidade de novos inibidores de entrada viral, contribuindo para a identificação de candidatos antivirais e o avanço da pesquisa sobre mecanismos de entrada do SARS-CoV-2.

Introdução

O surgimento do Coronavírus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) no final de 2019 levou a uma pandemia global que resultou em milhões de mortes no mundo todo e continua representando uma ameaça por meio de novas variantes com maior transmissibilidade e potencial de fuga^{imunológica 1}. Como um vírus de RNA envolto da família Coronaviridae, o SARS-CoV-2 utiliza sua glicoproteína trimérica spike (S) para mediar a entrada da célula hospedeira ao se ligar ao receptor da enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) e passar por ativação proteolítica por TMPRSS2 e outras proteases^{hospedeiras 2,3}. Embora várias opções de tratamento tenham sido desenvolvidas para controlar os sintomas da COVID-19, a evolução contínua e o rápido desenvolvimento das variantes virais destacam a necessidade urgente de sistemas seguros e escaláveis para estudar a entrada viral e avaliar novos compostos antivirais que visem essa etapa inicial da^{infecção 4}.

O vírus SARS-CoV-2 permanece classificado como agente^{de nível 5} de biossegurança 3 em alguns territórios devido ao seu alto potencial de transmissão. Portanto, qualquer tarefa de laboratório replicativo requer uma instalação BSL-3 de alta contenção, dificultando a capacidade da maioria dos laboratórios de campo de realizar pesquisas científicas com esse vírus. Sistemas baseados em vírus pseudotipados, também conhecidos como pseudovírus (PVs), oferecem uma alternativa prática que permite estudos de entrada viral em laboratórios de nível de biossegurança 2 (BSL-2), ampliando o acesso para esforços globais^{de pesquisa 6}. As partículas pseudotipadas que portam a proteína spike do SARS-CoV-2 não se replicam, tornando-as um substituto seguro para avaliar a entrada do vírus e rastrear inibidores de pequenas^{moléculas 7}. Essas partículas podem ser modificadas para carregar um gene de luciferase ou repórter fluorescente, permitindo a rápida detecção quantitativa da infecção por meio da medição do sinal repórter em células infectadas. Sistemas baseados no vírus da leucemia murina (MLV) ou nas espinhas dorsuais lentivirais têm sido amplamente utilizados para estudar a entrada de SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, vírus Ebola, entre^outros 8,9,10,11.

Nesses protocolos, descrevemos a geração de PVs baseados em MLV usando um sistema de três plasmídeos, com base no trabalho relatado por Millet e^{Whittaker 8}. Os plasmídeos utilizados incluem um plasmídeo de embalagem que codifica os genes centrais do MLV gag-pol (pCMV-MLVgagpol), um vetor de transferência que codifica o gene repórter luciferase (pTG-Luc) e um plasmídeo que expressa a glicoproteína do spike do SARS-CoV-2 correspondente à variante original de Wuhan-Hu-1. Além disso, pseudovírus também são gerados usando a glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) para serem usados posteriormente como contra-triagem de possíveis impactos. Pseudovírus são produzidos em células derivadas de HEK293 e usados para infectar células altamente suscetíveis que expressam hACE2 e TMPRSS2 de forma estável. A eficiência da transfecção é avaliada inicialmente usando um plasmídeo que expressa proteína fluorescente verde (GFP). Depois, usando condições de transfecção otimizadas, os PVs são gerados pela co-transfecção desses três plasmídeos, seguidos pela titulação dos vírus resultantes. Usando a quantidade apropriada de PVs, um ensaio é realizado em placas de 96 poços para rastrear compostos capazes de inibir a entrada dos vírus. Este protocolo utiliza polietilenimina ramificada (PEI) como reagente de transfecção de baixo custo, permitindo uma implementação mais fácil dos procedimentos.

Protocolo

1. Transfecção de alta eficiência de células derivadas de HEK293T usando polietileeneimina ramificada (PEI)

NOTA: Realize todas as etapas em um gabinete de biossegurança utilizando a técnica asséptica padrão e os procedimentos BSL-2. Use células derivadas de HEK293T para transfecção e geração de vírus pseudotipados. Neste método, as células são transfectadas em placas de 6 poços tratadas em cultura celular. A solução de stock PEI é preparada conforme descrito anteriormente por Yang e colegas (2017)¹². Antes de prosseguir com a transfecção tripla para gerar o pseudovírus, é recomendável otimizar a melhor proporção de DNA entre PEI e plasmídeo para garantir uma alta eficiência de transfecção (mais de 70-80%). Essa otimização deve ser feita pela transfecção de um plasmídeo que expressa proteína fluorescente verde (GFP) e, em seguida, verificando a proporção de células fluorescentes usando um microscópio de fluorescência. Para essa otimização, mantenha o DNA plasmídico constante em 2,5 μg por poço e teste várias quantidades de PEI, na faixa de 1-20 μL. Aqui estão as melhores condições para esses lotes de células e PEI, consistindo em 5 μL de solução de estoque PEI (1 mg/mL) e 2,5 μg de plasmídeo expressor de GFP por poço em uma placa de 6 poços.

1. Semente 7,5 x^{10 células derivadas} de 5 HEK293 por poço em uma placa de cultura de tecido de 6 poços, em volume total de 2 mL por poço de meio completo (DMEM-C: Dulbecco's Modified Eagle's Medium suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) inativado por calor, 20 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfônico (HEPES), 100 IU/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) 24 h antes da transfecção.
   NOTA: Ao semear células, evite mover a placa de cultura em movimentos circulares, pois isso pode causar agregação celular no centro dos poços, resultando em distribuição celular irregular e, consequentemente, menor eficiência de transfecção. Uma placa de 6 poços é suficiente para um experimento, incluindo um poço como controle celular (não transfectado), e o restante da placa para testar várias proporções de DNA de plasmídeos PEI.
2. Incube as células a 37 °C com 5% de CO₂ durante a noite. No dia seguinte, certifique-se de que as células estejam aproximadamente 50-60% confluentes.
3. No dia da transfecção, prepare os complexos de DNA do plasmídeo PEI em tubos microcentrífugos estéreis de 1,5 mL.
   1. Para cada poço, prepare um tubo de solução PEI contendo 5 μL de estoque PEI (1 mg/mL) em 50 μL de meio sérico reduzido, e um tubo de solução de DNA contendo 2,5 μg do plasmídeo expressor de GFP, em 50 μL do mesmo meio.
   2. Se vários poços forem transfectados, as soluções podem ser ampliadas de acordo. Misture cada tubo brevemente com o vórtice e gire para baixo por 5 segundos. Incube os tubos em temperatura ambiente (RT) por 10 minutos.
4. Durante o período dessa incubação, remova cuidadosamente o meio de cada poço da placa de 6 poços, evitando a ruptura da monocamada celular. Substitua cuidadosamente por 1 mL/poço de meio de transfecção completo (DMEM-T, igual ao DMEM-C, mas sem antibióticos).
5. Prepare o complexo de transfecção. Após os 10 minutos de incubação, adicione os 50 μl do tubo de solução de DNA ao tubo de solução PEI. Misture rapidamente pipetando para cima e para baixo seis vezes e incube em ritmo de descanso por exatamente 3 minutos. Imediatamente proceda a adicionar complexo em gota às células de cada poço correspondente.
6. Sele as bordas da placa com parafilme e centrífuga a 1.000 x g por 30 minutos em RT, sem freio, usando um rotor oscilante e um balde de placa.
7. Após a centrifugação, remova o parafilme suavemente e incube a placa a 37 °C, 5% de CO₂ por 3 horas.
8. Após a incubação, remova suavemente o meio de transfecção de cada poço e substitua-o lentamente por 2 mL de DMEM-C pré-aquecido por poço.
9. Incubar as células transfectadas a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 horas.
10. Avalie a eficiência da transfecção por expressão de GFP usando microscopia de fluorescência. A frequência das células fluorescentes deve ser superior a 70-80% (Figura 1). Isso é fundamental para a eficiência do próximo método na seção 2.

2. Geração de partículas pseudovirais pseudotipadas de espike- e VSV-G do SARS-CoV-2

NOTA: Este método utiliza o mesmo procedimento da seção 1, exceto que, em vez de usar o plasmídeo GFP, as células serão co-transfectadas com os três plasmídeos necessários para gerar vírus pseudotipados, usando as condições ótimas de transfecção para garantir alta eficiência de transfecção. O protocolo também utiliza células derivadas de HEK293T em placas de 6 poços, suficientes para as seguintes três condições necessárias: a) células não transfectadas (um poço), b) células transfectadas apenas com o plasmídeo de embalagem MLV e o vetor de transferência de repórter de luciferase (um poço; pseudovírus sem espinhos) e c) células transfectadas com esses dois plasmídeos e o plasmídeo expressor de picos para gerar vírus pseudotipados SARS-CoV-2 (quatro poços). O plasmídeo expressor de picos usado aqui codifica o pico da cepa de Wuhan do SARS-CoV-2, e contém modificações de sequência para permitir uma apresentação eficiente da proteína em PVs. O pseudovírus sem picos será necessário como controle posterior durante as infecções, para validar a entrada dependente do pico em células permissivas. De forma semelhante, VSV-G-PVs são gerados usando o mesmo desenho experimental para serem usados posteriormente como contra-triagem de potenciais compostos inibitórios. Se for necessário um volume maior de pseudovírus, o protocolo pode ser ampliado para duas placas de 6 poços, o que também pode ser prático para a etapa de centrifugação de placas.

1. No dia anterior à transfecção, semente as células derivadas da HEK293T em duas placas de 6 poços, conforme descrito na seção 1. Use uma placa para a geração de SPIKE-PVs e a outra para os VSV-G-PVs.
2. No dia da transfecção, prepare as misturas de transfecção conforme mostrado na Tabela 1, seguindo o passo 1.3.
   NOTA: A solução PEI é preparada conforme^{relatado anteriormente 12}. Plasmídeos pCMV-MLVgagpol e pTG-Luc foram obtidos de Millet e Whittaker⁸. O plasmídeo pVSV-G foi obtido de Gee et al 2020¹³. Todos os plasmídeos devem ser preparados com antecedência como preparações de alta qualidade, livres de endotoxinas. Recomenda-se o uso de kits maxiprep comercialmente disponíveis, com uma etapa final de filtração estéril através de filtro de seringa de baixa ligação e 0,2 μm.
3. Misture cada tubo conforme descrito na seção 1 e incube em RT por 10 minutos.
4. Durante essa incubação, remova cuidadosamente o meio de cada poço das placas de 6 poços, evitando a perturbação da monocamada celular. Substitua lentamente por 1 mL de meio DMEM-T pré-aquecido em cada poço, garantindo que o meio desça pela parede do poço e não diretamente sobre as células.
5. Prepare os complexos de transfecção conforme descrito na seção 1 e transfecte células usando o protocolo descrito anteriormente.
6. Após a incubação de 48 horas pós-transfecção, colete os supernatantes, transfira-os para tubos centrífugas cônicos estéreis de 50 mL e centrifuge a 290 x g por 7 minutos a 4 °C. Colete o supernadante livre de células e filtre usando uma unidade de filtro de polivinilideno fluoreto (PVDF), estéril de 0,45 μm com tampo. Prepare alíquotas de 1 mL e armazene-as a -80 °C.
   NOTA: Partículas pseudotipadas permanecem estáveis a -80 °C por vários meses. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento para preservar a infectividade.

	Para picos-PVs de SARS-CoV-2 (por poço)	Para VSV-G-PVs (por poço)	Para PVs sem picos (por poço)
Solução PEI:
PEI (1 mg/ml)1	5 μL	5 μL	5 μL
Meio sérico reduzido	45 μL	45 μL	45 μL
Solução de DNA plasmídico:2
pCMV-MLVgagpol	0,79 μg	0,79 μg	0,79 μg
pTG-luc	0,92 μg	0,92 μg	0,92 μg
Puno1-spike	0,79 μg	-	-
pVSV-G	-	0,79 μg	-
Meio sérico reduzido	até 50 μL	até 50 μL	Para 50 μL

Tabela 1: Preparação de misturas de transfecção para geração de PVs.

3. Titulação de partículas pseudotipadas SARS-CoV-2 e VSV-G

NOTA: Esta etapa é essencial para confirmar que as partículas pseudotipadas produzidas são infecciosas e para determinar o volume efetivo mínimo necessário para aplicações posteriores, como a triagem de compostos. A titulação deve ser feita para cada novo lote de pseudovírus. Para isso, células altamente suscetíveis à infecção por SARS-CoV-2 (células HSI) são infectadas com quantidades decrescentes dos vírus pseudotipados. A entrada dos pseudovírus, mediada pela interação spike-humano ACE2, ou pelo VSV-G com outros receptores celulares, é monitorada 72 horas depois pela detecção da atividade da luciferase em um ensaio de luminescência.

1. No dia anterior à transdução, seme 2,5 x 10⁴ células HSI por poço em uma placa de cultura de tecido com 96 poços, em 50 μL de meio completo (DMEM-C). Prepare três poços para cada quantidade de pseudovírus a ser testada, incluindo poços para infecção, também com pseudovírus sem espinhos e para células não infectadas. Incube a placa a 37 °C com 5% de CO₂ durante a noite.
2. No dia da transdução, descongele uma aliquota de cada lote de pseudovírus para testar no gelo e misture suavemente por inversão. Inclua também uma aliquota do controle sem picos. Adicione diretamente a cada poço várias quantidades da preparação do pseudovírus (100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5 e 0,8 μL). Ajuste os volumes de todos os poços para 150 μL com DMEM-C.
3. Sele a placa com parafilme e centrífuga a 2.500 × g por 45 minutos em RT, sem freio.
4. Remova o selo do parafilme e incube a placa por 72 horas a 37 °C, 5% de CO₂.
5. Após a incubação, prepare-se para o ensaio de luciferase seguindo as instruções do fabricante. Descongelar substrato de luciferase (armazenado a -80 °C) e 5x tampão de lise para ensaio de luciferase (armazenado a -20 °C) e equilibrar em RT (10-15 min).
6. Dilua o tampão de lise do ensaio de luciferase para 1x com água estéril. Prepare pelo menos 3 mL.
7. Aspire e descarte lenta e cuidadosamente o sobrenadante de cada poço usando uma pipeta multicanal.
8. Adicione 30 μL de 1x tampão de lise a cada poço usando uma pipeta multicanal. Coloque a placa em um agitador de placas por 10 minutos a 150 rpm, em RT. Verifique a lise completa sob um microscópio invertido (todas as células devem estar lisadas e não distinguíveis ao exame visual).
   NOTA: Prepare o leitor de microplacas com antecedência para realizar a detecção de luminescência imediatamente após a adição do substrato, garantindo consistência e evitando a decomposição do sinal.
9. Transfira os lisados para uma placa opaca branca de 96 poços.
10. Adicione 50 μL de substrato de luciferase a cada poço e misture brevemente movendo a placa em movimentos circulares. Coloque a placa no luminômetro e meça a luminescência.
11. Analise os dados obtidos.
    1. Verifique se os controles fornecem os valores esperados de luminescência. Certifique-se de que as células não infectadas apresentem valores de luminescência de fundo muito baixos.
       NOTA: Células infectadas com pseudovírus sem espinho devem apresentar valores no nível das células não infectadas, e células infectadas com quantidades decrescentes de pseudovírus apresentador de espinhos devem apresentar valores altos de luminescência dependentes da dose (Figura 2). Os valores de luminescência gerados pelos VSV-G-PVs geralmente são muito maiores do que os dos spike-PVs, cerca de uma ou duas ordens de grandeza.
    2. Para triagens subsequentes, selecione a quantidade de pseudovírus que gera um sinal pelo menos cem a mil vezes maior que o das células não infectadas.

4. Triagem de compostos para inibição de entrada pseudoviral usando spike-PVs

1. Semente 2,5 x 10⁴ células HSI por poço em 50 μL de meio completo (DMEM-C) em uma placa de 96 poços, conforme descrito na seção 3. Incube durante a noite a 37 °C, 5% de CO₂.
   1. Considere um desenho de placas que inclui as colunas 1 a 11 para compostos mais pseudovírus, e a coluna 12 para os controles. Na coluna 12, aloque quatro poços para controle viral (apenas pseudovírus) e quatro poços para células não infectadas e não tratadas.
2. No dia seguinte, prepare diluições seriadas (1:3) dos compostos a serem testadas, começando em 50 μM (concentrações finais durante infecções: 50, 16,6, 5,5, 1,8, 0,6, 0,2 e 0,06 μM), em DMEM-C contendo 0,5% de DMSO.
   1. Para conveniência, prepare diluições em uma "placa de diluição" separada de 96 poços, onde as diluições seriadas são feitas primeiro e depois transferidas (50 μL) para a placa contendo as células.
   2. Se o número de compostos for muito grande, na ordem de centenas ou mais, reduza essa primeira série de diluição para cerca de 4 pontos, usando um único poço por ponto de diluição, e considere uma pré-triagem. Depois, reteste os impactos potenciais usando diluições seriais de 7 pontos, 1:3, com três replicados, começando na mesma concentração de 50 μM.
3. Uma vez que as diluições dos compostos estejam prontas, aspire suavemente o meio das células usando uma pipeta multicanal e adicione 50 μL de diluições compostas aos poços correspondentes. Incube por 1 hora a 37 °C, 5% de CO₂. Para controles na coluna 12, adicione apenas DMEM-C.
4. Sem remover os compostos, adicione a cada poço a quantidade predeterminada de pseudovírus SARS-CoV-2 pseudotipado, em um volume de 50 μL de meio completo, contendo os compostos nas mesmas concentrações. Vede as placas com parafilme.
5. Centrifuge a placa a 2.500 × g por 45 minutos em RT sem freio, depois remova o parafilme e incube a 37 °C, 5% de_CO2 por 72 horas.
6. Prossiga com a quantificação da infectividade baseada em luciferase, conforme descrito na seção 3.
7. Realize análise de dados.
   1. Exporte valores de luminescência para uma planilha para formatar os dados para posterior importação em softwares de análise e gráficos.
   2. Prepare gráficos de barras que plotem a média de cada ponto de concentração, incluindo o erro padrão das barras médias. Plote também os valores obtidos de controles positivos (PVs sozinhos) e negativos (células não infectadas).
      NOTA: Os resultados do ensaio são considerados válidos se 1) células não infectadas apresentarem valores muito baixos, 2) controles PVs mostrarem valores altos, 3) controle positivo da inibição (ou seja, arbidol ou hACE2-Fc) mostrar inibição da infecção, de forma dependente da dose (Figuras 3A, B).
   3. Depois, observe os valores produzidos por compostos desconhecidos para avaliar se há inibição e se há efeito dependente da dose. Se sim, submeta esses compostos a análises confirmatórias adicionais.
      NOTA: Para confirmação adicional de possíveis impactos, siga os próximos passos. Primeiro, teste novamente os potenciais compostos de impactos conforme sugerido no passo 4.2. Se o efeito da resposta à dose for confirmado, então realize uma contra-triagem usando a mesma série de diluição, mas infectando com os VSV-G-PVs. Este teste é importante para verificar se a inibição de entrada é específica para a interação spike-ACE2, e não devido a interferência em qualquer outra etapa posterior da produção da luciferase nas células infectadas (Figuras 3A, B). Aqui, o composto positivo não deve apresentar atividade inibitória contra os VSV-G-PVs. Se for esse o caso, a mesma série de concentrações deve ser testada quanto à citotoxicidade usando um ensaio de viabilidade celular (ensaio MTT, mostrado na seção 5). Em resumo, um composto potencial de impacto deve apresentar inibição de SARS-CoV-2-spike-PVs, e nenhuma ou menor inibição de VSV-G-PVs, e nenhuma, ou pelo menos uma inibição muito mais fraca da viabilidade das células. Ajustar uma curva dose-resposta usando os dados de luminescência permitirá estimar a concentração inibitória metade máxima (IC₅₀) para a inibição dos PVs, e uma concentração citotóxica semimáxima (CC₅₀) a partir do ensaio de viabilidade. A razão CC₅₀ / IC₅₀ é usada para calcular o índice de seletividade (SI), que é um indicador importante da utilidade potencial do composto positivo. Para a análise das curvas dose-resposta e a estimativa do IC₅₀ e CC₅₀ , foram descritos procedimentos muito^{detalhados 14}.

5. Ensaio de viabilidade celular baseado em MTT

1. Semeie 2,5 x 10⁴ células HSI por poço em 50 μL de DMEM-C em uma placa de 96 poços. Incube a placa durante a noite a 37 °C, 5% de CO₂. Certifique-se de que as células estejam com cerca de 50% de confluência no dia seguinte. Preparar poços suficientes, considerando todas as diferentes concentrações do composto a serem avaliadas, células não tratadas e poços em branco contendo apenas meio, em triplicado. Testar os potenciais compostos de impacto nas mesmas concentrações avaliadas no ensaio de inibição de entrada PV.
2. Após a incubação, remova cuidadosamente o meio e substitua-o por 100 μL de meio completo contendo diferentes concentrações do composto para avaliação, em 0,5% de DMSO.
3. Centrifuge a placa a 2.500 × g por 45 minutos em RT sem freio e incube por 72 horas a 37 °C, 5% de CO₂. Essa etapa é incluída para lidar com as células exatamente como feito na seção anterior, exceto pela adição dos PVs.
4. Prepare uma solução de MTT de 0,5 mg/mL usando DMEM. Esterilize filtrando por 0,2 μm e mantenha no escuro.
   NOTA: 3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-brometo de tetrazólio (MTT) é sensível à luz. Deve ser mantido congelado, no escuro.
5. Remova cuidadosamente o meio de cada poço e substitua por 100 μL de solução MTT. Incubar por 2 horas a 37 °C, 5% de CO₂.
6. Durante essa incubação, prepare uma solução de solubilização contendo 40 mM de HCl em álcool isopropílico.
7. Remova cuidadosamente a solução MTT usando uma pipeta multicanal, sem perturbar os cristais de formazan no fundo de cada poço.
8. Adicione 100 μL da solução de solubilização a cada poço. Embrulhe o prato em papel alumínio e coloque-o em um agitador de placas a 150 rpm por 15 minutos.
9. Registre absorção em 570 nm e 630 nm.
10. Realize análise de dados.
    1. Usando os valores brutos da densidade óptica, subtraia os valores obtidos a 630 nm daqueles obtidos a 570 nm para cada poço. Depois, faça a média dos valores corrigidos dos poços de células não tratadas. Considere essas células não tratadas 100% viáveis.
    2. Em seguida, normalize os valores das células tratadas em relação aos poços das células não tratadas, usando a fórmula:
       Viabilidade (%) =
11. Plote as porcentagens de viabilidade como barras que representam a média de réplicas ±± erro padrão da média. Realize análises estatísticas adicionais para comparar grupos usando procedimentos implementados em software de análise de dados e gráficos, comparando viabilidades em diferentes concentrações com o controle das células não tratadas.
12. Compare as médias de cada ponto de concentração com as das células tratadas apenas com DMSO usando Kruskal-Wallis não paramétrico com o pós-teste de Dunn (as diferenças são consideradas significativas em valores p < 0,05). Para traçar uma curva dose-resposta e estimar o CC₅₀ a partir dos valores de OD, verifique o procedimento relatado em^{outros 14}.

Resultados

Vários métodos de transfecção foram relatados como geradores de PVs, incluindo fosfato de^{cálcio 15}, métodos à base de^{lipídios 16} e PEI, tanto lineares quanto ramificados. Este artigo mostra que a transfecção de células derivadas de HEK293T com PEI ramificada permite transfecção de alta eficiência (Figura 1), geralmente comparável a métodos de transfecção usando agentes transfeccionistas à base de lipídios comer...

Discussão

Essa versatilidade do sistema MLV para gerar pseudotipos para outros vírus foi relatada por outros vírus importantes, como o vírus^{Ebola 18}, MERS-CoV⁸, SARS-CoV¹⁹, vírus La^{Crosse 20}, Hantavírus²⁰, vírus^{Visna 21}, Arenavírus²², vírus da^{influenza 23}, entre outros. Esses pseudotipos têm sido muito úteis ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.2 & micro; m Filtros de seringa de baixa ligação a proteínas	Termo Científica	720-1320	Filtros de Seringa (0,2 & mu; m,13 mm, PES, estéril)
Solução 1X de Tripsina-EDTA 0,25%	Gibco	25200-056	Tripsina-EDTA (0,25%), fenol vermelho
0,45 & micro; m Unidades de Filtro de Tampa de Garrafa PVDF	Avantor	514-1045	Sistemas de Filtragem a Vácuo com Tampa de Garrafa (PVDF, 250 ml, 50 mm, 0,45 & micro; m)
Tubos de Microcentrífuga Estéreis de 1,5 mL	Eppendorf	30123611	Lock-Safe  Tubos
Solução 100 X de penicilina Estreptomicina	Corning	30-002-CI	Solução de Penicilina-Estreptomicina, 100x
5 x Luciferase ensaio de lise buffer	Promega	E2650	parte do Sistema de Ensaio de Luciferase Promega Bright-Glo
Tubos cônicos estéreis de 50 mL	Corning	352070	Tubo centrífugo PP de alta clareza de 50 mL, fundo cônico, estéril
Placas de Cultura de Tecidos de 6 Poços	Termo Científica	140675	Multipratos tratados com cultura celular
Placas de Cultura de Tecidos com 96 poços	Termo Científica	168055	Nunc™ MicroWell&comércio; 96-Poço, Nunclon Delta, Microplaca de fundo plano
Cloridrato de arbidol	Sigma-Aldrich	SML0860
Polietilenemina ramificada, 25 kDa	Sigma-Aldrich	408727
Microscópio a laser confocal   (FV 3000)	Olympus Co.	SKU: FV3000
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM (Médium Eagle Modificado da Dulbecco) com: glicose alta, L-glutamina, fenol vermelho, piruvato de sódio)	Gibco	11995-065
Soro Bovino Fetal (FBS)	Gibco	26140-079	Inativado por calor (56° C, 30 min)
Células derivadas de HEK293T (Linha Celular Lenti-X 293T)	Biografia de Takara	632180	Subclone altamente transfectável da linhagem celular HEK293 e suporta altos níveis de expressão de proteínas virais
HEPES Buffer	Gibco	15630-080
Células altamente suscetíveis à infecção (293T-ACE2. TMPRSS2 (mCherry) Linha Celular)	Recursos do BEI	NR-55293	HEK293T linha celular modificada para expressar ACE2 e TMPRSS2
Ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	H1758-500ML
Microscópio de contraste de fase invertido	Olympus Co.	SKU: 2404040005
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-500ML
Substrato de luciferase	Promega	E2650	parte do Sistema de Ensaio de Luciferase Bright-Glo
Leitor de microplacas com detecção de luminescência	Agilent BioTek	BTH1MG
MTT [brometo 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]	Sigma-Aldrich	M2128
Placas brancas opacas de 96 poços	Corning	3917	Microplacas de poliestireno branco plano com fundo sólido de 96 poços tratados com TC
Parafilm	Bemis	PM999
plasmídeo pcDNA3-EGFP	Addgene	13031	pcDNA3-EGFP foi um presente de Doug Golenbock (plasmídeo Addgene #13031 ; http://n2t.net/addgene:13031 ; RRID:Addgene_13031)
pCMV-MLVgagpol plasmid	-	-	Doação gentilmente feita pelo Dr. Gary Whittaker
Soro salino tamponado com fosfato sem Ca2+ e Mg2+ (PBS)	Corning	21-040-CV	Soro tampado com fosfato, 1X sem cálcio e magnésio
Sistema de Plasmídeos Promega PureYield Maxiprep	Promega	A2393
Plasmídeo pTG-Luc	-	-	Doação gentilmente feita pelo Dr. Gary Whittaker
Plasmídeo do Spike pUNO1-SARS-CoV-2 (Wuhan)	Invivogen	P1-Espinho
plasmídeo pVSV-G	Addgene	138479	pVSV-G foi um presente de Akitsu Hotta (plasmídeo Addgene # 138479 ; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID:Addgene_138479)
Proteína de fusão humana ACE2-Fc recombinante	Invivogen	FC-HACE2
Meio sérico reduzido (Opti-MEM)	Gibco	31985-070	Opti-MEM Meio Sérico Reduzido