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Artigo de método

Investigando a glicólise na microglia primária usando ensaio de fluxo extracelular

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DOI:

10.3791/69638

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10 de abril de 2026

 , 
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University of Newfoundland

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma forma econômica de realizar um teste de esforço de glicólise para quantificar a reprogramação metabólica em micróglias primárias de camundongo. Após o isolamento e estimulação inflamatória, a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é medida usando reagentes recém-preparados e ajustados pelo pH, seguida pela normalização proteica para permitir uma avaliação precisa e reprodutível das mudanças glicolíticas.

Resumo

As micrófagos, as células macrófagas residentes do sistema nervoso central, alteram dinamicamente seus programas metabólicos em resposta a sinais fisiológicos e patológicos. Compreender essas mudanças metabólicas é crucial para elucidar seus papéis na inflamação. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para avaliar o perfil glicolítico da microglia primária isolada dos córtices cerebrais neonatais de camundongo, utilizando um teste de esforço de glicólise em um analisador de fluxo extracelular. Este ensaio permite a medição em tempo real da ECAR, um indicador da atividade glicolítica associada a pH baixo, como o lactato. Nossa abordagem envolve o tratamento de microglia cultivada sob diferentes condições para examinar como as vias metabólicas são alteradas em resposta a diversos estímulos, incluindo estímulos pró-inflamatórios. De forma única, nosso laboratório prepara soluções frescas de stock de diferentes reagentes, incluindo glicose, oligomicina e 2-desoxiglicose (2DG), para atingir os diferentes aspectos da via, com ajuste cuidadoso do pH para cada reagente para garantir precisão experimental e reprodutibilidade. Esse método oferece uma plataforma robusta para investigar a glicólise na microglia primária e oferece insights sobre seus estados funcionais sob condições inflamatórias ou relacionadas a doenças.

Introdução

As células do sistema nervoso central mudam a forma como produzem energia em resposta a condições normais edoenças. Entre as principais vias metabólicas, a glicólise e a fosforilação oxidativa (OXPHOS) são vias chave que regulam as funções das células imunológicas – elas passam por uma reação robusta e imediata a condições pró-inflamatórias e anti-inflamatórias, respectivamente 3,4. Assim, as células imunes podem alternar entre vias metabólicas em resposta a sinais inflamatórios e estadosfuncionais 5. A microglia, assim como seus equivalentes mieloides, está metabolicamente ligada às suas funções e se adapta rapidamente a diferentes vias como um combustível metabólico alternativo, demonstrando flexibilidademetabólica 6,7. A microglia passa por rápida reprogramação metabólica durante a inflamação, com glicólise aprimorada servindo como uma assinatura metabólica chave dos estadospró-inflamatórios. Assim, ensaios que identificam a dependência celular de um fenótipo metabólico nos permitem investigar seus estados funcionais sob diversas condições. No protocolo atual, nosso objetivo é determinar se a microglia primária depende do aumento da glicólise durante condições pró-inflamatórias. Para isso, realizamos testes de esforço de glicólise rotineiramente. Embora o analisador Seahorse XFe24 (analisador de fluxo extracelular) tenha sido amplamente utilizado para medir ECAR em linhagens celulares imortalizadas e células transformadas, a microglia primária apresenta desafios técnicos únicos, incluindo rendimentos celulares limitados, propriedades de adesão variável e alta sensibilidade a condições de cultura, o que pode confundir medições metabólicas. Além disso, fornece medição em tempo real da ECAR, permitindo uma avaliação precisa da glicólise impulsionada pelo lactato em múltiplos pontos de tempo, que não pode ser capturada apenas por ensaios de lactato no ponto final. O perfil metabólico baseado em fluxo extracelular tem sido amplamente adotado em pesquisas metabólicas para caracterizar a bioenergética celular, tornando esse protocolo bem adequado para estudos que investigam mudanças metabólicas nas células durante ativação, modelagem de doenças ou testes de medicamentos. Os leitores podem determinar a adequação com base na necessidade de medições glicolíticas dinâmicas e de alta resolução dentro das células primárias.

A glicose é metabolizada em piruvato via glicólise e depois convertida em lactato no citoplasma ou em CO₂ e água nas mitocôndrias. A conversão da glicose em lactato leva à liberação de prótons no espaço extracelular, resultando na acidificação do meio. O analisador de fluxo extracelular quantifica essa acidificação como ECAR9. No teste de esforço de glicólise, as células são primeiro incubadas em um meio livre de glicose e piruvanato, e seu ECAR basal é registrado. A primeira injeção entrega uma quantidade saturante de glicose, que as células metabolizam via glicólise para piruvato, produzindo ATP, NADH, água e prótons. O aumento da liberação de prótons eleva a ECAR, refletindo a 'glicólise'. Em seguida, a oligomicina é adicionada para inibir a síntese de ATP mitocondrial, forçando as células a dependerem exclusivamente da glicólise. Essa mudança no gradiente de prótons aumenta ainda mais a ECAR e é medida como a capacidade glicolítica máxima da célula. Finalmente, a 2DG, um análogo da glicose, é introduzida. Ela inibe competitivamente a hexocinase, bloqueando a glicólise e reduzindo a ECAR. Essa queda confirma que a ECAR anterior era dependente da glicólise. A diferença entre a capacidade glicolítica máxima e o nível de glicólise define a reserva glicolítica. A ECAR inicial antes da adição de glicose representa acidificação não glicolítica de outros processos celulares (Figura 1).

Realizamos um teste de esforço de glicólise usando o analisador de fluxo extracelular. Os valores brutos de ECAR foram exportados para o Excel para análise. Para cada condição, identificamos os pontos de tempo correspondentes à ECAR basal (antes da adição de glicose), glicólise (após a injeção de glicose) e capacidade glicolítica (após o tratamento com oligomicina). Os valores de ECAR dos pontos de tempo relevantes dentro de cada fase e entre as quatro réplicas técnicas foram mediados, e a glicólise foi calculada como o aumento da ECAR após a adição de glicose. A capacidade glicolítica foi calculada como um aumento da ECAR após a adição de oligomicina. A reserva glicolítica foi calculada como uma diminuição da ECAR após a injeção de 2DG. Esses valores médios foram então usados para comparar respostas metabólicas entre os grupos.

Por outro lado, para avaliar a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e as funções mitocondriais, o teste de esforço mitocondrial (Agilent) é a abordagem padrão, que mede parâmetros como respiração basal, respiração ligada a ATP, vazamento de prótons, respiração máxima, capacidade respiratória sobrando e respiração não mitocondrial. Essas medições são obtidas injetando sequencialmente inibidores mitocondriais específicos, oligomicina (inibidor de ATP sintase), FCCP (cianeto de carbonila-4 (trifluorometoxi)) fenilhidrazona), um desacoplador que impulsiona a respiração máxima, e rotenona/antimicina A (inibidores complexos I/III), permitindo avaliação quantitativa da saúde e bioenergética mitocondrial 10,11,12,13 . Assim, os ensaios ECAR e OCR são realizados sob condições diferentes.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados Animais e receberam aprovação do Comitê de Cuidados Animais da Memorial University of Newfoundland sob o protocolo número 22-01-DK.

1. Preparativos antes do início dos experimentos

  1. Prepare a solução para dissecação adicionando 10 mM de HEPES a 1x HBSS sem Ca2+ e Mg2+.
  2. Prepare a solução digestiva (por 2–3 cérebros) combinando 1 mL de tripsina a 2,5% (10x estoque, não diluído), 2 mL de solução de dissecação e 200 μL de DNase I (1 mg/mL).
  3. Prepare médio glialical misto suplementando DMEM com 10% de FBS, 1x Glutamax e 1x antibiótico/antimicótico.
  4. Prepare o meio para microglia suplementando DMEM com 10% de FBS, 1x Glutamax, 1x NEAA em MEM, 1x piruvato de sódio e 1x penicilina/estreptomicina.

2. Revestimento para culturas gliais mistas (Figura 2A)

  1. No dia 1:
    1. Colete filhotes pós-natais de dia (P0)-P2 de camundongos C57BL/6C e extraia os córtices usando um microscópio estereoscópico e remova as meninges. Depois, disseca os córtices em pedacinhos minúsculos em solução de dissecação e transfira-os para um tubo cônico de 15 mL. Deixe os tecidos se assentarem no fundo do tubo.
    2. Decante a solução de dissecação e substitua-a por 3 mL de solução digestiva por 2–3 cérebros. Triture suavemente usando uma pipeta sorológica de 2 mL para dissociar o tecido.
    3. Coloque os tubos em um rotor dentro de uma incubadora a 37 °C e misture triturando usando uma pipeta sorológica de 2 mL a cada 8 minutos, totalizando cerca de 24 minutos.
    4. Após a digestão do tecido, centrifuge as células a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente (RT). Depois, descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet em 5 mL de mídia glial mista.
    5. Usando uma agulha de 18 g em uma seringa de 5 mL, triture as células e depois passe por um escorredor de células de nylon de 70 μm. Centrifuge novamente as células coletadas a 300 x g por 5 minutos em RT.
    6. Resuspenda o pellet em 1 mL de meio glialar misto inicialmente e triture várias vezes para remover aglomerações celulares, e depois ressuspenda novamente em volume maior, chegando a até 12 mL em cada frasco T75 (recomenda-se 2–3 córticos cerebrais por frasco)
      NOTA: Não é necessário revestir o frasco com poli-D-Lisina ou outro reagente.
  2. No segundo dia, mude toda a mídia e adicione mídia glial mista fresca.
  3. No terceiro dia, substitua cerca de 2/3 do substrato por meio misto fresco da glía. Deixe as células crescerem por mais sete dias, totalizando 10 dias.
    NOTA: Neste ponto, uma camada de astrócitos pode ser observada.
  4. No dia 6, substitua 2/3 do substrato por meio misto fresco de glia media. Confirme a presença de uma camada confluente de astrócitos.

3. Obtenção de microglia primária pura (Figura 2A)

NOTA: Por volta do dia 10, pequenas células redondas flutuando sobre a camada de astrócitos são visíveis; estes são predominantemente microglólicos (Figura 2B).

  1. Agite o frasco a 250 rpm por 2 horas a 37 °C. Reúna todo o meio contendo as células flutuantes em um tubo cônico de 15 mL e centrifuge a 300 x g por 10 minutos.
  2. Ressuspenda o pellet em meios microgliosos e coloque cerca de 250.000 células por poço nas microplacas de cultura celular do analisador de fluxo extracelular.
    NOTA: Cerca de 3 a 4 milhões de células por mL são obtidas de três frascos de T75; o revestimento das placas de cultura celular com poli-D-lisina ou outros reagentes não é obrigatório.
  3. Incube a microplaca a 5% de CO2 por 30–45 minutos. Depois disso, mude novamente o meio para obter uma cultura pura de microglia e remover quaisquer oligodendrócitos que ainda possam estar flutuando. As células estão prontas para tratamento no dia seguinte (Figura 2C).
  4. Exclua os quatro poços designados como controles 'de fundo' da seed de células: um em cada linha (Figura 3C). Esses poços recebem mídia para ensaios.
    NOTA: Preencha os poços não utilizados com água estéril ou PBS para evitar a evaporação do meio, e placar as células em um padrão aleatório em vez de fileiras ou colunas fixas para minimizar a variabilidade baseada em placas.

4. Tratamento da microglia primária com estímulos pró-inflamatórios

  1. No dia 11, trate as células com 100 ng/mL lipopolissacarídeo (LPS) por 24 horas. Randomize poços de controle e tratados com LPS para descartar quaisquer efeitos posicionais.
    NOTA: A duração dos tratamentos pode variar dependendo das condições experimentais e necessitar de otimização prévia.

5. Preparação para o ensaio de fluxo extracelular um dia antes de realizar o experimento

  1. No dia 11, adicione 1 mL de buffer de calibrante à placa de calibração (formato de 24 poços; kit de ensaio de fluxo extracelular) em todos os poços. Mantenha a placa durante a noite a 37 °C semCO2.
    NOTA: A placa de calibração consiste em 4 poços de injeção. Para o teste de esforço de glicólise, a glicose é adicionada ao Porto A, a oligomicina ao Porto B e o 2DG é injetado no Porto C (veja a Figura 4A).
  2. Prepare soluções de Glicose e 2DG para estoques
    1. Glicose – Dissolva 90 mg de glicose em 2 mL de meio extracelular de ensaio de fluxo (Tabela de Materiais). Inicialmente, dissolva cerca de 1,9 mL para que, quando o pH for ajustado no dia seguinte com 1N NaOH, o volume final não ultrapasse 2 mL, o que é fundamental para manter a molaridade.
    2. 2DG – Dissolva 328 mg em 2 mL de meio de ensaio de fluxo extracelular.
      NOTA: Armazene tanto a glicose quanto a 2DG a 4 °C durante a noite
  3. Aliquota 30-40 mL de meio de ensaio em um tubo cônico de 50 mL e armazene a 4 °C para realizar os ensaios no dia seguinte.

6. Ensaio de Fluxo Extracelular (Dia 12)

  1. No dia 12, aqueça a glicose pré-constituída, a 2DG e o meio de ensaio aliquotado a 37 °C. Ajuste o pH da glicose e da 2DG, assim como o do meio de ensaio aliquotado, para 7,4 adicionando 1N NaOH em incrementos (por exemplo, 5 μL, depois 10 μL).
  2. Faça vórtice brevemente para mistura uniforme até que o pH atinja acima de 7.
    NOTA: Tiras indicadoras de pH são recomendadas para monitoramento consistente do pH.
  3. Adicione 2 μL de solução estocada de 10 mM de oligomicina em 2 mL de meio de ensaio ajustado por pH.
    1. Preparação em solução estocada de 10mM de oligomicina: Reconstitua um frasco de 10mg de oligomicina em 1mL de DMSO estéril, atingindo uma concentração de 10 mg/mL, e armazene a -80 °C até novo uso.
  4. Retire as células da incubadora (do passo 4) e colete o meio em tubos microcentrífugas de 1,5 mL e centrifuge a 300 x g por 5 minutos.
  5. Colete o sobrenadante (descarte o pellet para eliminar células/detritos) e armazene-o a -80 °C para medições de lactato, mencionado no Passo 8.
  6. Lave as células com 1 mL de meio de ensaio ajustado com pH muito suavemente para evitar que as células se soltem.
  7. Descarte o meio de ensaio e adicione 500 μL de meio ajustado pelo pH e incube a 37 °C (sem CO2) por 45 min a 1 hora.
  8. Enquanto isso, adicione todos os inibidores necessários à placa de calibração do analisador de fluxo extracelular em suas respectivas portas - 55 μL de glicose para a porta A no canto superior esquerdo em todos os poços, 60 μL de oligomicina na porta B para os poços superior direito e 65 μL de 2DG na porta C para os poços inferior esquerdo (incluindo poços de fundo) (veja a Figura 4A).
    NOTA: O aumento de volume a cada etapa é necessário para manter a molaridade, pois os volumes aumentam com a adição prévia de glicose e oligomicina.
  9. Após adicionar os inibidores, configure um teste de esforço de glicólise usando o software Agilent Seahorse Wave (veja a Figura 3). Depois, execute a placa de calibração assim que solicitado.
    NOTA: Remova a tampa superior da placa e a tampa rosa entre as placas antes de colocar a placa de calibração na máquina. Durante essa etapa, os sensores de pH eO2 serão testados e verificados pelo controle de qualidade.
  10. Após a calibração terminar, a máquina solicitará para descarregar a placa de calibração e carregar a placa de cultura.
    1. Passo I: Selecionar o Modelo de Ensaio (Figura 3A)
      1. Abra o software Wave e, na seção de Modelos , escolha o modelo de ensaio apropriado para o experimento.
      2. Nesse caso, selecione "Teste de Estresse de Glicólise XF" no analisador de fluxo extracelular.
    2. Passo II: Defina Grupos e Estratégias de Injeção (Figura 3B)
      1. Vá até a aba Definições de Grupos e crie grupos experimentais (por exemplo, Background, Control e LPS).
      2. Defina a Estratégia de Injeção selecionando os compostos a serem injetados em cada porta (por exemplo, glicose, oligomicina, 2DG para teste de esforço de glicólise; essas configurações são pré-definidas pelo software como padrão, verifique de acordo).
    3. Passo III: Atribuir Grupos ao Mapa de Placas (Figura 3C)
      1. Abra a visualização do Mapa de Placas e atribua poços a cada grupo arrastando os nomes dos grupos (por exemplo, Fundo = preto, Controle = verde, LPS = vermelho) para o layout das placas.
      2. Certifique-se de que poços em branco/fundo sejam designados para normalização precisa.
    4. Passo IV: Configurar o Protocolo (Figura 3D)
      1. Na aba Protocolo , programe os ciclos de medição e as injeções. A sequência típica para o teste de estresse de glicólise inclui acidificação não glicolítica, injeção de glicose (Porto A) → mede glicólise, injeção de oligomicina (Porto B) → mede a capacidade glicolítica, injeção de 2-DG (Porto C) → mede a reserva glicolítica
      2. Defina o número de ciclos de medição após cada injeção e ajuste o tempo (por exemplo, 3 ciclos de mistura de 3 minutos, 2 minutos de espera, medida por 3 minutos).
        NOTA: Para nossos experimentos, usamos as configurações padrão do software.
      3. Revise o tempo total do ensaio antes de executar o ensaio.
    5. Passo V: Normalização (Figura 3E)
      1. Normalize dados com os valores de concentração de proteínas obtidos a partir do ensaio de ácido bicincônínico (BCA) dentro do software Wave usando a opção de normalização embutida (por exemplo, por conteúdo de proteína, número de células ou outros métodos disponíveis). As medições de concentração de proteínas são apresentadas na Tabela 1.
        NOTA: O protocolo para isolar a proteína para o ensaio de BCA após a medição da ECAR é descrito no seguinte Passo 7.

7. Coleta de células para quantificação e normalização de dados

  1. Uma vez concluído o ensaio de fluxo extracelular, remova a placa de cultura e proceda imediatamente à extração da proteína ou armazene a placa a -80 °C até estar pronta para extração proteica.
    NOTA: Ensaios proteicos nos permitem normalizar valores entre diferentes condições de tratamento (são um dos métodos para normalizar os dados, não o único).
  2. Para isolamento imediato de proteínas, remova o meio de ensaio dos poços e lave uma vez com 500 μL de PBS RT (1x) (recomenda-se uma lavagem suave com uma única lavagem para minimizar a perturbação da monocamada celular).
  3. Para coletar células que possam se soltar durante esse processo, centrifuge a placa uma vez a 300 × g por 5 minutos, descarte o PBS e ressuspenda o pellet resultante no tampão RIPA para garantir medições totais precisas de proteínas.
  4. Adicione cerca de 75–100 μL de buffer RIPA a cada poço e coloque a placa sobre um shaker (rotação baixa-média) por 30 minutos (RT). Depois, transfira o conteúdo para um tubo novo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: Triturar e misturar bem dentro dos poços antes de transferir o tampão RIPA para o tubo microcentrífuga de 1,5 ml.
  5. Incube o tubo da microcentrífuga em um rotador por cerca de 30 minutos em RT para a lise adequada das células. Durante esse tempo, pré-resfrie a centrífuga a 4 °C.
  6. Centrifuge o lisado celular a 16.000 x g por 15 minutos a 4 °C. Descarte o pellet, pois ele conterá detritos celulares.
  7. Colete o sobrenadante para quantificação de proteínas usando o ensaio BCA (ou qualquer outro método preferido). Proceda imediatamente ou armazene os lisados após remover todo o meio de ensaio a -20 °C (para armazenamento de curto prazo) ou -80 °C (para armazenamento a longo prazo).
  8. Ao reiniciar após armazenar as amostras a -20 °C ou -80 °C, descongele-as no gelo por cerca de 20–30 minutos, faça um breve vórtice/giro e continue com o protocolo padrão BCA.
  9. Alternativamente, conte as células por poço usando um hemocitômetro ou um citômetro de fluxo e integre-a às estratégias de normalização. Nesse caso, adicione cerca de 100–200 μL de tripsina (pré-aquecida a 37 °C) imediatamente após o ensaio ser concluído e o meio de ensaio removido, e incubar a 37 °C por 5 minutos. Colete as células adicionando 100–200 μL de 10% FBS para neutralizar os efeitos da tripsina.
    1. Centrifuge as células a 300 x g por 5 minutos, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em cerca de 1 mL de 10% de FBS antes de contar usando um hemocitômetro. Alternativamente, as células podem ser fixadas com 4% de PFA por 15 minutos antes de prosseguir com a contagem celular baseada em citometria de fluxo.
      NOTA: Se proceder imediatamente com a contagem celular, a fixação baseada em PFA não é necessária.
  10. Normalize os valores de ECAR com a concentração de proteínas do Passo 7.8 ou as contagens celulares do Passo 7.9.1 em cada poço usando o software Wave , como no Passo 6.10.5.1. Os valores resultantes são os valores normalizados para o ensaio do teste de esforço de glicólise.
  11. Gere os resultados e o gráfico usando a opção "Exportar" seguida pela opção "Graph Pad Prism" e "Folha do Excel" para cada valor de ponto de dados para quantificação.
    NOTA: Na placa de cultura celular, a escolha de quatro poços em branco designados é flexível e pode ser definida pelo experimentador. A disposição padrão de blanks é mostrada na Figura 3C.

8. Medições de lactato a partir de supernadantes em cultura

  1. Gradualmente descongele gradualmente as alíquotas sobrenadantes no gelo que foram coletadas no dia 12 e armazenadas a −80 °C a partir do Passo 6.5.
  2. Determine as concentrações de L-lactato usando o Kit de Ensaio de L-Lactato em modo fluorométrico, seguindo o protocolo do fabricante.
    Nota: O modo fluorométrico é muito mais sensível do que o ensaio colorimétrico.
  3. Preparar padrões por diluição serial do padrão de lactato fornecido para gerar uma curva de calibração variando de 0 a 0,1 nmol/poço.
  4. Adicione amostras e padrões a uma microplaca transparente de 96 poços em duplicado, depois adicione a mistura de reação contendo a mistura de enzimas lactato e sonda fluorescente em cada poço.
  5. Incube em RT por 30 minutos protegido da luz. Meça a intensidade de fluorescência usando um leitor de microplacas de fluorescência com comprimentos de onda de excitação/emissão ajustados a 535/587 nm.
  6. Calcule as concentrações de lactato em amostras a partir da curva padrão e expresse-as como pM. Os níveis de lactato de supernadantes de microglia primária não tratada (controle) e tratada com LPS são apresentados na Tabela 2.

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Resultados

O teste de esforço extracelular baseado em fluxo de glicólise mede com sucesso o perfil glicolítico da micróglia primária. O ensaio mede a glicólise basal, ou seja, glicólise após a injeção de glicose, capacidade glicolítica após a injeção de oligomicina e inibição da glicólise após a injeção de 2DG. Para nosso experimento, comparamos microglia primária controle (não tratada) e tratada com LPS. Observamos pequenas mudanças morfológicas entre a microglia controle e a microglia tratada com...

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Discussão

A resposta microglial durante a neuroinflamação é acompanhada por uma profunda reprogramação metabólica que permite que essas células atendam às demandas energéticas e biossintéticas de seu estado funcional. O teste de esforço extracelular baseado em fluxo de glicólise oferece um método sensível e em tempo real para medir o fluxo glicolítico, permitindo dissecar como a microglia primária adapta seu metabolismo sob condições pró-inflamatórias. Neste estudo, utilizamos microglia murina pri...

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Divulgações

Os autores não têm conflito de interesses a declarar.

Agradecimentos

O trabalho é financiado por meio de uma bolsa de projeto do CIHR para a DKK. O RTI ao Dr. Craig Moore para o analisador XFe24 do ensaio Seahorse é muito reconhecido.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução 1M HEPESSigma AldrichH0887
1X HBSSGibco   14175-079
2,5% de tripsinaGibco   15090-046
2DGMillipore sigma D6134
Antibiótico/Antimicótico & nbsp;Gibco15240-062
D & ndash; (+)Glicose, anidro e nbsp;Termociência    A16828.36
DMEMGibco  11965-092
DNase IMillipore sigma 11284932001- Roche
FBSFisherbrandFB12999102
GlutamaxGibco   35050-061
Kit de L-LactatoAbcamAB65330
LPS Sigma Aldrich  L4391
MEM NEAA Gibco   11140-050
Oligomicina AMillipore sigma 495455
Penicilina/EstreptomicinaGibco   15240-062
Tiras indicadoras de pHFisherbrand13-640-516
Seahorse XFe24Tecnologias AgilentN/ANome genérico: Analisador de fluxo extracelular
Microplacas de cultura celular Seahorse 24 V7 PSCavalo-marinho Agilent100777-004Nome genérico: Microplacas de cultura celular de fluxo extracelular
Ensaio de cavalo-marinho XF Tampão calibrante (pH 7,4)Cavalo-marinho Agilent    100840-000Nome genérico: Buffer calibrante de fluxo extracelular
Ensaio de cavalo-marinho XF mídia DMEM (pH 7,4)Cavalo-marinho Agilent      103575-100Nome genérico: Mídia extracelular de ensaio de fluxo
Kit de ensaio de fluxo extracelular SeahorseCavalo-marinho Agilent  102342-100Nome genérico: Placa de calibração de fluxo extracelular  
Piruvato de sódio  Gibco   11360-070

Referências

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Investigando a glicólise na microglia primária usando ensaio de fluxo extracelular
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