Indução de ferroptose no glioma por calceolariosídeo A via modulação da via PI3K/Akt/Nrf2

Resumo

Este estudo explora o potencial terapêutico da Calceolarioside A no glioma, demonstrando sua capacidade de inibir a sinalização PI3K/Akt e promover a degradação do Nrf2, induzindo assim a ferroptose e suprimindo a progressão tumoral tanto in vitro quanto in vivo.

Resumo

Este protocolo demonstra o fluxo experimental utilizado para investigar os efeitos da Calceolariósida A (CaA) na indução e modulação da ferroptose da via fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)/Quinase Proteica B (Akt)/fator nuclear eritroide 2-relacionado ao fator 2 (Nrf2) em modelos de glioma. Os procedimentos incluem uma série de ensaios baseados em células em linhas de glioma humano U251 e U87 para avaliar a viabilidade, proliferação e quimiossensibilidade celular após o tratamento com CaA. As alterações associadas à ferroptose são avaliadas medindo espécies reativas de oxigênio (ROS), glutationa (GSH), malondialdeído (MDA) e níveis de ferro lábil, juntamente com a expressão de proteínas relacionadas à ferroptose, como a peroxidase de glutationa 4 (GPX4), a subunidade antiporter de cisteína/glutamato (xCT) e a ferritina via western blot. Para avaliar o envolvimento das vias, o protocolo detalha ensaios baseados em qRT-PCR, western blot e imunoprecipitação para expressão e ubiquitinação de Nrf2. Experimentos de superexpressão de Nrf2 estão incluídos para confirmar seu papel na regulação da ferroptose. O protocolo demonstra ainda o uso de um modelo de xenoenxerto de camundongo, onde células de U87 são implantadas subcutâneamente, seguidas pela administração intraperitoneal de CaA para avaliar o crescimento e a toxicidade do tumor in vivo. A análise histológica dos principais órgãos é realizada para avaliar a segurança sistêmica. Além disso, o acoplamento molecular é usado para prever a ligação direta entre CaA e a subunidade PI3K p110α (PIK3CA). Juntos, esses procedimentos fornecem uma estrutura reprodutível para examinar os mecanismos da ferroptose e a eficácia terapêutica de compostos naturais na pesquisa sobre glioma.

Introdução

Gliomas, especialmente glioblastomas de alto grau, representam uma das formas mais letais de tumores cerebrais, caracterizadas por rápida proliferação, resistência ao tratamento e prognóstico^{ruim 1}. Nos últimos anos, diversos agentes antiglioma foram explorados, incluindo quimioterapêuticos tradicionais como temozolomida e uma variedade de compostos naturais como^{curcumina 2}, resveratrol³ e epigallocatequina^{galato 4}. Esses agentes exercem seus efeitos por meio de múltiplos mecanismos, incluindo indução de apoptose, inibição da angiogênese e modulação das vias de estresse oxidativo. No entanto, muitos desses compostos enfrentam limitações, como baixa biodisponibilidade ou caracterização mecanicista incompleta. Isso destaca a necessidade crítica de metodologias abrangentes que não apenas confirmem a atividade antitumoral, mas também dissequem sistematicamente os mecanismos farmacológicos subjacentes. Estabelecer esses fluxos de trabalho mecanicistas é especialmente importante para acelerar o desenvolvimento de novos compostos anti-glioma desde a descoberta até a validação pré-clínica.

Para apoiar esse objetivo, um número crescente de estudos agora integra ferramentas computacionais avançadas e experimentais para aprimorar a resolução^{mecanicista 5,6}. Modelos de design de fármacos baseados em estrutura e inteligência artificial (IA) — como AlphaFold3 e acoplamento molecular — estão facilitando a identificação de interações promissoras entre fármaco e alvo com velocidade e precisão sem^{precedentes 7,8}. Essas ferramentas complementam métodos experimentais ao prever afinidades de ligação e identificar potenciais alvos moleculares antes da validação laboratorial. Ao mesmo tempo, o surgimento de ensaios funcionais baseados em vias, imagens de células vivas e técnicas proteômicas de alta resolução permitem aos pesquisadores avaliar o impacto celular de novos compostos em múltiplos eixos regulatórios, incluindo respostas ao estresse oxidativo, cascatas de transdução de sinais e modalidades de morte celular como^{ferroptose 9,10,11}.

Entre as vias de sinalização envolvidas na biologia do glioma, as vias fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)/Quinase Proteica B (Akt) e o fator eritróide nuclear 2-relacionado ao fator 2 (Nrf2) são de particular interesse devido ao seu papel no crescimento tumoral, homeostase redox e resistência à terapia^12,13. A sinalização PI3K/Akt promove a sobrevivência, proliferação e adaptação metabólica nas células glioma, enquanto o Nrf2 atua como um regulador principal da resposta antioxidante, suprimindo a morte celular^{ferroptótica 14}. A ativação persistente dessas vias contribui para a evasão do tratamento, tornando-as alvos atraentes para intervenção^{farmacológica 15}. Métodos convencionais para interrogação de vias incluem western blotting para proteínas totais e fosforiladas, bem como qRT-PCR para análise de expressão gênica. No entanto, a análise aprofundada da sinalização Nrf2 requer ensaios adicionais que avaliem a estabilidade das proteínas, a translocação nuclear e as modificações pós-traducionais, como ubiquitinação. Essas estratégias multifacetadas de detecção são essenciais para entender como compostos específicos interrompem ou reforçam a regulação redox e o controle ferroptótico.

A calceolariosida A (CaA), um derivado do ácido hidroxicinâmico, oferece um mecanismo duplo ao inibir simultaneamente a sinalização PI3K/Akt e promover a degradação proteassomal do Nrf2, aumentando assim a sensibilidade ferroptótica. Essa estratégia de dupla direcionamento pode melhorar a reprodutibilidade e a profundidade mecanicista em relação a agentes existentes como erastin ou RSL3, que atuam após as defesas antioxidantes. Este protocolo apresenta uma abordagem experimental integrada para investigar o mecanismo farmacológico do CaA, que inclui acoplamento molecular para identificar sítios de ligação ao PI3K, imunoblotting e imunoprecipitação para detectar expressão e ubiquitinação do Nrf2, além de marcadores de ferroptose, como espécies reativas de oxigênio (ROS), glutationa (GSH) e malondialdeído (MDA). Além disso, um modelo de camundongo com xenoenxerto é utilizado para avaliar a eficácia terapêutica e a segurança sistêmica do CaA. Esse fluxo de trabalho abrangente oferece uma plataforma reprodutível e informativa para estudar o mecanismo de ação de agentes anticâncer, com ênfase na integração da modulação das vias do sinal e regulação da morte celular.

Protocolo

Cultura celular e tratamento
Células neuronais murinas HT22 e linhagens celulares de glioma humano U87 e U251 foram cultivadas no Meio Eagle Modificado de Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 4 mM de L-glutamina, sob condições umidificadas a 37 °C com 5% de CO₂. Para simplificar a consistência experimental, todos os tratamentos celulares foram padronizados e descritos aqui. Esta seção descreve as condições específicas utilizadas em cada grupo de tratamento e os ensaios correspondentes a jusante.

Tratamento CaA:
As células HT22 foram tratadas com concentrações crescentes de CaA (0, 0,1, 0,5, 1, 10, 50, 100, 250 e 500 μM) por 72 horas. Células de glioma U87 e U251 foram tratadas com CaA em concentrações de 5, 20 ou 50 μM durante 24 horas na maioria dos experimentos, ou com 50 μM em 0, 6, 12 ou 18 horas para estudos de longo prazo. Esses tratamentos foram utilizados nas seguintes análises: western blot para cisteína/subunidade antiportadora de glutamato (xCT), peroxidase de glutationa 4 (GPX4), ferritina (FTH1), glutaminase e PI3K/Akt/alvo mamífero da Rapamicina (mTOR)/ fator de iniciação eucariótico 4B (EIF4B) (níveis total e fosforilado); reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real (RT-qPCR) para Nrf2 e proteína associada ECH-like Kelch 1 (Keap1); Medição ROS usando diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA); quantificação de GSH e MDA; detecção Fe²⁺ baseada em FerroOrange; ensaio de proliferação de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU); Ensaio de formação de colônias; Ensaio de viabilidade celular de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT).

Co-tratamento com Liproxstatina-1 (Lip1):
As células foram pré-tratadas com 50 nM Lip1 por 2 horas antes da adição de 50 μM CaA. Essas condições foram usadas no ensaio MTT (0, 24, 48, 72 h); ensaio de formação de colônias; Ensaio EdU; Ensaio de apoptose Annexin V/PI (com/sem cisplatina de 20 nM).

Co-tratamento com MG132:
As células foram tratadas com 10 μM MG132 sozinha ou combinadas com 50 μM CaA por 24 horas. Isso foi aplicado ao western blot para estabilização da proteína Nrf2 (total e nuclear); Ensaios de imunoprecipitação (IP) para Nrf2 e Keap1 ubiquitinados.

Co-tratamento com cisplatina:
As células foram tratadas com cisplatina de 20 nM sozinho ou em combinação com 20 μM de CaA por 24 horas. Esses tratamentos foram utilizados no ensaio de apoptose com Anexina V/iodeto de propidio (PI).

Superexpressão Nrf2 :
As células foram transfectadas com plasmídeo de superexpressão de Nrf2 de 2,5 μg ou vetor vazio usando agente transfector por 18 horas, depois tratadas com 50 μM CaA por 24 horas. Essa condição foi usada em western blot para xCT, GPX4, FTH1 e glutaminase; ensaios ROS, MDA, GSH; Coloração FerroOrange para ferro intracelular.

Um diagrama de fluxo de trabalho (Figura Suplementar S1) resume as condições experimentais acima e as análises correspondentes. Essa figura vincula visualmente cada protocolo de tratamento aos seus ensaios posteriores específicos para melhorar a clareza e reprodutibilidade.

Avaliação da viabilidade celular
A viabilidade celular foi avaliada usando o método colorimétrico convencional MTT, conforme descrito^{anteriormente 16}. As células HT22, U251 e U87 foram placadas em placas de cultivo de 96 poços e incubadas durante a noite para permitir a aderência. Após o término do período de tratamento, 15 μL de solução de MTT foram introduzidos em cada poço e as placas foram incubadas por 4 horas a 37 °C. O meio era então descartado, e 150 μL de dimetil sulfóxido (DMSO) eram adicionados para solubilizar os cristais formados de formazan. A absorção foi posteriormente registrada em 490 nm usando um leitor de microplacas. Valores de absorção mais altos indicam maior viabilidade celular, enquanto uma redução na absorção sugere efeitos citotóxicos.

Ensaio de incorporação EdU
Para avaliar a síntese de DNA e a proliferação celular, foram realizados ensaios de incorporação de EdU usando um Kit de Imagem EdU, conforme descrito^{anteriormente no 17}. Brevemente, células de glioma U251 e U87 foram semeadas em placas de 24 poços. Após o tratamento, as células foram incubadas com EdU (concentração final de 10 μM) e cultivadas por mais 24 horas. Após a etapa de incubação, as células foram fixadas usando paraformaldeído a 4% e depois permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100, e coradas conforme as instruções do kit. A porcentagem de células EdU-positivas (células proliferantes) foi quantificada por microscopia de fluorescência e normalizada para núcleos totais coloridos com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Ensaio de formação de colônias
Para o ensaio de formação de colônias, células de glioma U251 e U87 foram placadas em placas de 3,5 cm a baixa densidade (500 células por prato). Após o tratamento, o meio de cultivo era trocado por meio fresco, livre de medicamentos, e as células eram mantidas por mais 14 dias para permitir a formação da colônia, com trocas de meio realizadas a cada três dias. As colônias resultantes foram posteriormente fixadas usando paraformaldeído a 4%, coradas com 0,1% de violeta cristalino e contadas manualmente ao microscópio. Aglomerados acima de 75 μm de diâmetro foram marcados como colônias. Cada experimento foi realizado em triplicado e repetido três vezes. Esse ensaio seguiu protocolos comumente aceitos para avaliar a capacidade proliferativa^{de longo prazo 18}. Colônias devem aparecer como aglomerados densos e circulares; colônias menores e menos indicam capacidade proliferativa reduzida.

Avaliação da apoptose celular
A morte celular apoptótica foi avaliada usando o kit de detecção de apoptose FITC-Annexin V, conforme descrito^{anteriormente 16}. Células de glioma U87 e U251 foram tratadas com cisplatina de 20 nM na presença ou ausência de 20 μM CaA por 24 horas antes da coloração. Para experimentos envolvendo inibição de ferroptose, as células foram pré-tratadas com 50 nM Lip1 por 2 horas, seguidas de cotratamento com 20 μM CaA e 20 nM cisplatina por mais 24 horas. Após os tratamentos indicados, as células foram colhidas (300 × g, 5 min) e coradas com Annexin V-FITC e PI conforme as instruções do fabricante. Após a rotulagem, as amostras eram examinadas em um citômetro de fluxo. A aquisição de dados foi realizada usando canais FL1 (FITC) e FL2 (PI), com configurações de compensação aplicadas para minimizar a sobreposição espectral. A proporção de células V-positivas para Annexin foi posteriormente calculada para determinar o grau de apoptose.

Análise do Western blot
Western blotting foi realizado de acordo com procedimentos^{estabelecidos 19,20}. Brevemente, após os tratamentos indicados, as células foram lisadas em um tampão RIPA contendo inibidores de protease e fosfatase, e os níveis de proteína foram determinados usando o ensaio de Bradford. Para experimentos que avaliaram a distribuição subcelular do Nrf2, proteínas nucleares e citoplasmáticas foram extraídas usando um kit comercial de extração nuclear, conforme as instruções do fabricante.

Um total de 40 μg de proteína de cada amostra foi resolvido em um gel SDS-PAGE de 10% e posteriormente transferido para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado preparado em PBST (PBS com 0,1% Tween-20) por 1 hora em temperatura ambiente, seguida de incubação noturna com anticorpos primários a 4 °C. Após a lavagem, anticorpos secundários conjugados com HRP (1:5.000) foram aplicados por 1 hora a 37 °C, e os sinais foram detectados usando um sistema de quimioluminescência (ECL) aprimorada.

Os níveis de expressão de xCT, glutaminase, GPX4 e FTH1 foram medidos, usando gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como controle de carga. Proteínas fosforiladas (p-PI3K, p-Akt, p-mTOR e p-EIF4B) foram quantificadas em relação aos seus respectivos níveis totais de proteínas, enquanto as proteínas totais foram normalizadas contra o GAPDH. O Nrf2 nuclear foi normalizado para Lamin B. Os desfechos esperados incluem redução dependente de dose e tempo em Nrf2 e p-PI3K/Akt/mTOR/EIF4B, e regulação para baixo de marcadores relacionados à ferroptose em células tratadas com CaA.

Para ensaios de ubiquitinação, as células foram tratadas com MG132 (10 μM) com ou sem CaA (50 μM) por 24 horas. Após a lise, os complexos proteicos foram imunoprecipitados usando anticorpos anti-Nrf2 ou anti-Keap1; IgG normal de coelho foi usado como controle negativo. Os imunoprecipitados foram então sondados com anticorpos antiubiquitina para detectar formas ubiquitinadas, enquanto lisados totais também foram sondados para os níveis de Nrf2 e proteína ECH-associada semelhante a Kelch 1 (Keap1) para confirmar a entrada.

Extração de RNA e PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)
A extração de RNA e a qRT-PCR foram realizadas seguindo os protocolos^{padrão 21}. Resumidamente, células gliomas U87 e U251 foram tratadas com ou sem 50 μM CaA por diferentes durações (6 e 18 h). O RNA total foi isolado e convertido em cDNA por meio da transcrição reversa. A PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) foi realizada usando um Master Mix SYBR Green qPCR em uma plataforma de PCR em tempo real. A expressão gênica relativa foi determinada usando o cálculo 2-ΔΔCt. As sequências de primer usadas para Nrf2, Keap1 e o gene de limpeza GAPDH foram as seguintes:

Nrf2 atacante, 5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′;
Nrf2 reverso, 5′-GGAATGTCTGCCAAAAGCTG-3′

Keap1 avançado, 5′-CAACTTCGCTGAGCAGATTGGC-3′;
Keap1 reverso, 5′-TGATGAGGGTCACCAGTTGGCA-3′

GAPDH dianteiro, 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′;
GAPDH reverso, 5′-AGCCTTCTACATGGTGGTGAAGAC-3′

Transdução Nrf2
Células de glioma U251 e U87 foram transfectadas transitoriamente com um plasmídeo de superexpressão de Nrf2 ou um vetor controle vazio correspondente usando o reagente de transfecção à base de lipídios; O procedimento foi baseado em métodos convencionais de transfecção^{transitória 22}. Brevemente, as células foram semeadas em placas de 6 poços com uma densidade de 3 × 10⁵ células por poço e cultivadas durante a noite para alcançar aproximadamente 70-80% de confluência no momento da transfecção. Para cada poço, 2,5 μg de DNA plasmídico foram diluídos em 125 μL de Meio Sérico Reduzido e misturados com 5 μL do reagente de transfecção. Separadamente, 3,75 μL do reagente de transfecção foram diluídos em outros 125 μL do meio sérico reduzido. As misturas de DNA diluído e reagentes de transfecção foram então combinadas, suavemente misturadas e incubadas por 10-15 minutos em temperatura ambiente para permitir a formação complexa. Os complexos de transfecção resultantes (volume total 250 μL) foram adicionados gota a gota a cada poço contendo células em meio fresco e completo.

Após 18 horas de incubação a 37 °C em uma incubadora de CO₂, o meio de transfecção foi substituído por meio de cultivo fresco. As células foram então ensaiadas subsequentes, incluindo western bloting, análise ROS, quantificação MDA/GSH e estudos de acúmulo de ferro. Esse protocolo segue procedimentos amplamente aceitos de expressão gênica transitória e permite uma expressão robusta de Nrf2 dentro de 24 a 48 horas após a transfecção.

Medição do ferro intracelular
Os níveis intracelulares de^{Fe 2+} foram medidos usando o indicador fluorescente FerroOrange. Células de glioma Brief, U251 e U87 foram semeadas em placas de 24 poços e tratadas com concentrações variadas de CaA (5, 20 e 50 μM). Para avaliar o efeito da superexpressão de Nrf2 na ferroptose, células U87 e U251 foram transfetadas com plasmídeo de expressão de Nrf2 ou vetor vazio. Após 18 horas, o meio era substituído e as células eram tratadas com 50 μM de CaA por 24 horas. Posteriormente, as células foram expostas a 1 μM de FerroOrange em meio sem soro e incubadas a 37 °C por 30 minutos antes da análise. Após a incubação, as células foram enxaguadas e observadas sob um microscópio de fluorescência, usando um conjunto de filtros TRITC (excitação ~543 nm, emissão 560-600 nm), onde o aumento da intensidade da fluorescência laranja indica níveis mais altos de Fe²⁺ lábil, tipicamente localizado no citoplasma. Esse método foi adaptado a partir de ensaios de ferro baseados em sondas^{fluorescentes estabelecidos 23}.

Medição de GSH e MDA
Os níveis intracelulares de GSH e MDA foram determinados após protocolos padronizados de avaliação para avaliar o estresse^{oxidativo 24}. Células de glioma Brief, U251 e U87 foram semeadas em placas de 24 poços e tratadas com concentrações variadas de CaA (5, 20 e 50 μM). Para avaliar o efeito da superexpressão de Nrf2 na ferroptose, células U87 e U251 foram transfetadas com plasmídeo de expressão de Nrf2 ou vetor vazio. Após 18 horas, o meio era substituído e as células eram tratadas com 50 μM de CaA por 24 horas. Posteriormente, as células foram lisadas no tampão RIPA, e as concentrações totais de proteínas foram medidas usando um kit de quantificação de proteínas BCA. Os conteúdos de GSH e MDA foram posteriormente analisados usando kits comerciais de detecção de acordo com os protocolos dos fabricantes.

Ensaio ROS
A geração intracelular de ROS foi avaliada usando a sonda fluorescente DCFH-DA, de acordo com os protocolos^{estabelecidos 25}. Células de glioma Brief, U251 e U87 foram semeadas em placas de 24 poços e tratadas com concentrações variadas de CaA (5, 20 e 50 μM). Para avaliar o efeito da superexpressão de Nrf2 na ferroptose, células U87 e U251 foram transfetadas com plasmídeo de expressão de Nrf2 ou vetor vazio. Após 18 horas, o meio era substituído e as células eram tratadas com 50 μM de CaA por 24 horas. Posteriormente, as células foram tratadas com 5 μM DCFH-DA a 37 °C por 1 hora, seguidas de lavagens PBS para remover o excesso de corante. Os sinais de fluorescência foram visualizados usando um microscópio de fluorescência invertida, equipado com um filtro FITC (excitação 488 nm, emissão 525 nm), e imagens foram capturadas para análise. O aumento da intensidade da fluorescência verde corresponde a níveis elevados de ROS intracelular.

Experimentos com animais
Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais do Weifang Peoples Hospital sob o número de aprovação [2025SDL579]. Para gerar o modelo do xenoenxerto de glioma, 2 × 10^{células de 6} U87 foram ressuspensas em 0,2 mL de PBS e inoculadas subcutâneamente no flanco esquerdo de camundongos NUS machos BALB/c de 4 semanas. Após permitir o desenvolvimento dos tumores por 7 dias, os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em três grupos (n = 8 por grupo): controle não tratado, tratado com CaA (2,5 mg/kg) e CaA (2,5 mg/kg) combinado com Lip1 (10 mg/kg). Os tratamentos foram administrados por meio de injeção intraperitoneal diária por 14 dias consecutivos. As dimensões tumorais foram medidas a cada 3 dias usando cápaître, e os volumes foram calculados usando a fórmula: volume = (comprimento × largura²) / 2. No dia 21, todos os camundongos foram eutanasiados, e tumores foram excisados e fotografados para análise adicional.

Sequenciamento de RNA e análise da via KEGG
O sequenciamento de RNA foi realizado para perfilar alterações transcricionais após a exposição ao CaA. A integridade do RNA foi confirmada usando um espectrofotômetro UV-VIS em microvolume e um sistema de eletroforese baseado em capilares antes do sequenciamento na plataforma Illumina. Leituras limpas foram mapeadas para o genoma de referência humano (GRCh38) com HISAT2, e a expressão gênica foi quantificada como FPKM. Genes diferencialmente expressos foram identificados usando DESeq2 (FDR < 0,05, |log₂FC| ≥ 1), e o enriquecimento funcional foi avaliado por análise de vias KEGG (ajustado P < 0,05).

Análise de acoplamento molecular
O acoplamento molecular foi empregado para prever a interação entre CaA e a via PI3K/Akt. A estrutura cristalina da subunidade catalítica humana PI3K p110α (PIK3CA) foi obtida do Banco de Dados de Proteínas (PDB ID: 8BFU). A estrutura do CaA foi recuperada do PubChem e minimizada de energia usando software de modelagem molecular. Usando software de preparação de acoplamento molecular, todas as moléculas de água e ligantes não essenciais foram removidos da estrutura PIK3CA, e átomos de hidrogênio foram adicionados. Uma grade de acoplamento foi definida ao redor do local ativo do PIK3CA (baseada nas coordenadas conhecidas do local de ligação), e um algoritmo de acoplamento foi usado para realizar o acoplamento. As poses de ligação com maior pontuação do CaA foram selecionadas de acordo com a afinidade de ligação (kcal/mol) e examinadas para interações chave. Interações proteína-ligante, como ligações de hidrogênio e contatos hidrofóbicos, foram visualizadas com software de visualização molecular e uma ferramenta de mapeamento de interações 2D.

Segurança e descarte de resíduos
Todos os experimentos envolvendo reagentes químicos como DMSO, corantes fluorescentes (DCFH-DA, FerroOrange) e fixadores foram realizados em uma exaustão com equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados, incluindo luvas e óculos de proteção. O DMSO e as sondas fluorescentes foram manuseados com cautela devido à sua capacidade de penetrar a pele e potencial citotoxicidade. Materiais contaminados, incluindo pontas de pipeta, placas de cultura e luvas, foram descartados em recipientes de resíduos perigosos designados. Tecidos e carcaças animais foram tratados como resíduos bio-perigosos e incinerados ou autoclavados de acordo com regulamentos institucionais de biossegurança e diretrizes ambientais locais.

Análise estatística
Todos os resultados são apresentados como a média ± desvio padrão (DS). As diferenças entre os dois grupos foram avaliadas usando um teste t de Student de duas caudas. Para análises envolvendo múltiplos grupos, foi aplicada ANOVA unidirecional seguida de comparações post hoc adequadas (como o teste de Tukey). Um valor p abaixo de 0,05 foi considerado indicativo de significância estatística.

Resultados

Supressão da proliferação e aumento da quimiossensibilidade das células U251 e U87 in vitro por CaA
A Figura 1A ilustra a estrutura de CaA. Primeiro avaliamos os efeitos citotóxicos do CaA usando um ensaio MTT em células neuronais murinas normais HT22 e células de glioma humano U251 e U87. Comparado com células não tratadas (0 μM CaA), CaA teve impacto mínimo na viabilidade das células HT22 em concentrações abaixo de 100 μM ao l...

Discussão

O CaA apresenta um efeito antitumoral convincente no glioblastoma ao modular de forma única dois eixos críticos de sobrevivência: a via PI3K/Akt/mTOR e o mecanismo de defesa contra a ferroptose Nrf2. A via PI3K/Akt é frequentemente hiperativada no glioblastoma multiforme (GBM, alterado em até ~88-90% dos casos) devido à perda de PTEN ou ativação do RTK, impulsionando a proliferação e resistência^{à terapia 26}. No entanto, atacar apenas essa via resultou em apoptose ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agilent 2100 Bioanalyzer			sistema de eletroforese capilar
Annexin V-FITC Apoptosis Kit	Roche Diagnostics	11858777001	N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)			software de preparação de docking molecular (algoritmo de docking)
Calceolarioside A (CaA)	Sigma-Aldrich	SMB00246	N/A
Chem3D			software de modelagem molecular
cDNA Synthesis Kit	Vazyme Biotech	R223	N/A
DCFH-DA	Sigma-Aldrich	D6883	N/A
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	N/A
DMSO	Merck	D8418	N/A
FerroOrange probe	Dojindo	F374	N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442	N/A
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAriaIII Flow Cytometry	Instrumento para análise de células coradas com Annexin V
Fluorescence microscope	Olympus	IX73	Instrumento para observação de fluorescência de FerroOrange e DCFH-DA
FTH1 antibody	Abcam	ab75973	AB_1310150
GAPDH antibody	Abcam	ab8245	AB_2107448
GLS antibody	Abcam	ab93434	AB_10563527
GPX4 antibody	Abcam	ab125066	AB_10972289
HT22 murine neuronal cell line	AddexBio	C0011008	CVCL_0321
jetPRIME transfection reagent	Polyplus-transfection	114-07	reagente de transfecção baseado em polímero
Keap1 antibody	Abcam	ab139729	AB_2732852
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	N/A
LigPlot+			ferramenta de mapeamento de interação 2D
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific		reagente de transfecção baseado em lípidos
Liproxstatin-1	Selleck	S7699	N/A
MG132	Selleck	S2619	N/A
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	H1M	Instrumento para medir absorvância no ensaio de MTT (em 490 nm)
MTT	Sigma-Aldrich	M5655	N/A
NanoDrop			espectrofotômetro UV-Vis de microvolume
Nrf2 antibody	Abcam	ab62352	AB_945626
Nude BALB/c mice	Vital River, China	N/A	IMSR_CRL:028
OptiMeM reduced serum medium
PyMOL			software de visualização molecular
QuantStudio 5 Real-Time PCR System
SYBR Green Master Mix	Vazyme Biotech	Q711	N/A
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	N/A
U251 human glioma cell line	CLS Cell Lines Service	300385	CVCL_0021
U87 human glioma cell line	ATCC	HTB-14	CVCL_0022
Ubiquitin antibody	Abcam	ab7780	AB_306981
xCT/SLC7A11 antibody	Abcam	ab175186	AB_2715513