Mapeamento genômico amplo de modificações histonas e sítios de ligação de fatores de transcrição em linhas celulares neuroendócrinas de câncer de pulmão de pequenas células usando CUT&RUN

Resumo

Um protocolo otimizado de Clivagem Sob Alvos e Liberação Usando Nuclease seguida de sequenciamento de próxima geração (CUT&RUN-seq) é descrito para linhas celulares de câncer de pulmão de pequenas células neuroendócrinas. Ele permite o mapeamento genômico de várias modificações de histonas e locais de ligação do fator de transcrição (por exemplo, E2F7) para investigar a desregulação epigenética e transcricional na patobiologia do SCLC.

Resumo

Proteínas remodeladoras de cromatina e fatores de transcrição (TFs) desempenham papéis críticos na biologia tumoral do câncer de pulmão de pequenas células (SCLC). A caracterização genômica em todo o genoma das modificações pós-traducionais de histonas (PTMs) e dos sítios de ligação das TF é essencial para identificar elementos reguladores do DNA e vias genéticas que levarão a uma compreensão mecanicista mais profunda do SCLC e indicarão alvos para intervenção terapêutica. Clivagem sob alvos e liberação usando nuclease, seguida de sequenciamento de próxima geração (CUT&RUN-seq), é um método poderoso para mapear modificações específicas de histonas e determinar os perfis de ligação ao DNA de uma ampla gama de proteínas in situ no genoma celular. No CUT&RUN, a nuclease microcócica (MNase) fundida à Proteína A/G é recrutada por meio de anticorpos para as localizações genômicas das proteínas associadas à cromatina, onde os fragmentos de DNA subjacentes são liberados da cromatina em massa após a ativação e clivagem da MNase. Essa digestão localizada gera pequenos fragmentos de DNA específicos do locus, adequados para sequenciamento.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para perfilar modificações de histonas H3K4me3 (associado a promotores ativos ou abertos) e H3K4me1 (associado a realçadores ativos), bem como o fator de transcrição E2F7, no SCLC. Este protocolo foi otimizado para modelos de linhagem celular neuroendócrina (NE) SCLC, que normalmente são caracterizados por núcleos grandes, citoplasma escasso e crescimento como agregados não aderentes em suspensão.

Introdução

As modificações pós-traducionais histonas (PTMs) e os fatores de transcrição (TFs) são reguladores centrais da expressão gênica. PTMs histonas, como acetilação, metilação, fosforilação e ubiquitinação, principalmente em suas caudas N-terminais, influenciam a estrutura da^{cromatina 1,2}. No câncer, as PTMs de histonas frequentemente estão desreguladas, levando à ativação aberrante dos oncogenes ou ao silenciamento dos genes supressores^{tumorais 3}. As TFs se ligam a sequências específicas de DNA em promotores ou potenciadores para ativar ou reprimir genes-alvo, frequentemente recrutando enzimas modificadoras das histonas que coordenam a remodelação da^{cromatina 4}. Enzimas que escrevem, apagam ou leem marcas de histonas, como acetiltransferases de histonas (HATs), desacetilases de histonas (HDACs) e metiltransferases (HMTs), são frequentemente mutadas ou desreguladas no câncer, tornando-as alvos terapêuticos^{atraentes 5}.

No SCLC, alterações epigenéticas e fatores de transcrição que definem linhagem (LDTFs) são fatores chave para a biologia^{tumoral 6}. Ao contrário das mutações genéticas, alterações epigenéticas, incluindo metilação do DNA e modificações de histonas, regulam a expressão gênica sem alterar a sequência subjacente do DNA. Essas modificações podem silenciar genes supressores tumorais ou ativar oncogenes, alimentando o comportamento agressivo do SCLC. Por exemplo, a metiltransferase de histona KMT2D é frequentemente mutada com frequência de alteração de 12,9% em uma grande coorte real de pacientes com^{SCLC 7} e é responsável pela monometilação da lisina 4 da histona H3 (H3K4me1), uma marca associada a regiões ativas de realçador no genoma. A SCLC é uma doença molecularmente heterogênea. Os SCLC são classificados em subtipos moleculares com base na expressão diferencial de quatro LDTFs: homólogo de aquete-escudo 1 (ASCL1), fator de diferenciação neurogênico 1 (NEUROD1), proteína associada sim 1 (YAP1) e homeobox classe 2 POU 3 (POU2F3). Os subtipos neuroendócrinos (NE), incluindo ASCL1 e NEUROD1, representam aproximadamente 70-80% dos casos de^{SCLC 8}. Portanto, investigar a distribuição e os perfis de diferentes PTMs de histonas e sítios de ligação TF nos diversos subtipos de SCLC pode elucidar programas gênicos específicos de subtipo vulneráveis a intervenção terapêutica.

O método tradicional para identificar as PTMs de histonas e os sítios de ligação de proteínas reguladoras específicas de sequência em nível genômico é o sequenciamento por imunoprecipitação de cromatina (ChIP-seq⁾⁹. No entanto, o ChIP-seq requer um grande número de células de entrada e frequentemente gera alto nível de fundo em todo o genoma. Como resultado, o ChIP-seq requer um alto nível de enriquecimento da proteína-alvo para distinguir o sinal verdadeiro do ruído e necessita de sequenciamento profundo para uma análise eficaz dos dados. Além disso, a reticulação de formaldeído usada no ChIP-seq pode mascarar epítopos e gerar sítios de ligação^{falsos positivos 10}. Clivagem sob alvos e liberação usando nuclease, seguida de sequenciamento de próxima geração (CUT&RUN-SEQ), é uma alternativa de alta resolução para mapear PTMs de histonas e sítios de ligação TF in situ dentro de células intactas. Neste método, células permeabilizadas são incubadas com um anticorpo direcionado à proteína associada à cromatina de interesse, seguidas pela ligação de uma proteína de fusão da Proteína A(G)-micrococcal nuclease (MNase). A digestão direcionada de DNA ao lado da proteína de interesse é então induzida sob condições de alto teor de cálcio e baixo teor de sal, liberando fragmentos específicos de DNA para purificação. Os fragmentos de DNA purificados são usados para construir bibliotecas de sequenciamento com código de barras, que podem ser agrupadas para sequenciamento de alto^rendimento 11,12,13,14. Comparado ao ChIP-seq, o CUT&RUN requer significativamente menos células como entrada, produz menor ruído de fundo, evita artefatos de reticulação cruzada e requer menos leituras de sequenciamento – tornando-o particularmente adequado para estudar estados dinâmicos da cromatina em câncer de forma econômica.

A tecnologia CUT&RUN foi desenvolvida para investigar as localizações genômicas das proteínas interagentes com cromatina, incluindo modificações de histonas, sítios de ligação TF e complexos associados à cromatina, revelando assim paisagens regulatórias^{epigenéticas 11,12}. Essa técnica possibilitou análises detalhadas da arquitetura enhancer-promotor, regulação da rede transcricional e dinâmica do estado da cromatina durante o desenvolvimento e progressão da^{doença 15}. Na pesquisa do câncer, o CUT&RUN permite o mapeamento preciso das marcas de^{histonas 16,17} e da ocupação do fator de transcrição oncogênico, ajudando a identificar programas regulatórios específicos de linhagem e potenciais alvos terapêuticos^15,16. Além disso, o CUT&RUN pode ser realizado in situ em células, incluindo a célula T^{CD8+ 17}, bem como em amostras de tecido^18,19.

Para detectar a localização genômica dos PTMs e dos sítios de ligação do fator de transcrição E2F7 em subtipos de SCLC, aplicamos CUT&RUN-seq a quatro modelos de linhas celulares SCLC NE: H146 e DMS79 (subtipo ASCL1), bem como H446 e H82 (subtipo NEUROD1), com ou sem mutações KMT2D. Perfilamos a marca de histonas H3K4me1, uma modificação associada a potenciadores principalmente catalisada por KMT2D, e E2F7, que foi demonstrado ser um cofator de^{ASCL1 20}. A marca de histonas H3K4me3, associada a promotores ativos, serviu como controle positivo, enquanto IgG serviu como controle negativo.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado CUT&RUN-seq para linhas celulares SCLC NE, baseado no seguinte: um kit CUT&RUN comercialmente disponível (veja Tabela de Materiais), o trabalho original de Skene e Henikoff 11,12,13 e nossas próprias otimizações laboratoriais.

Protocolo

NOTA: Este protocolo (Figura 1) fornece instruções passo a passo para realizar CUT&RUN-seq em linhas celulares SCLC NE, que normalmente crescem como agregados não aderentes ou clusters flutuantes.

1. Cultura Celular

1. Mantenha linhagens celulares DMS79 (subtipo ASCL1), H146 (subtipo ASCL1), H82 (subtipo NEUROD1) e H446 (subtipo NEUROD1) em 13 mL de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (ver Tabela de Materiais) em frascos de 75 mL. Cultive as células em uma incubadora a 37 °C com 5% de_CO2.
   NOTA: Todas as células usadas neste estudo foram adquiridas da ATCC e autenticadas com perfilamento de repetições em tandem curto.

2. Permeabilização celular

NOTA: A permeabilização celular adequada é essencial para permitir que anticorpos, pAG-MNase e fragmentos de proteína de DNA digeridos difundam livremente dentro e fora das células. Antes de iniciar o protocolo CUT&RUN em uma nova linhagem celular, otimizações devem ser realizadas para determinar a concentração ideal de digitonina para permeabilização eficaz. A menor concentração para alcançar mais de 95% de permeabilização (95% das células "mortas") deve ser usada para o protocolo CUT&RUN.

1. Coloque o estoque de digitonina a 5%, o inibidor de protease e a espermidina sobre gelo e deixe que descongelem completamente.
2. Prepare o Buffer de Lavagem conforme a Tabela 1 e mantenha o buffer no gelo.
3. Prepare uma solução de trabalho de digitonina com 0,05% misturando 10 μL do material de 5% com 990 μL de tampão de lavagem. Misture bem por meio de vórtice e mantenha no gelo.
4. Gerar uma série de diluição de digitonina (0,05%, 0,01%, 0,001% e 0,0001%)" diluindo sequencialmente a solução anterior para um volume final de 1 mL de cada tubo. Faça vórtice em cada diluição antes de prosseguir para a próxima. Ao mesmo tempo, prepare um controle de 0,05% de Dimetil Sulfóxido (DMSO) em Wash Buffer (100 μL total; veja a Tabela 2).
   NOTA: Digitonina e DMSO são produtos químicos perigosos. Manuseie com cautela e descarte todos os resíduos em um recipiente de resíduos perigosos devidamente rotulado e com tampas seguras.
5. Mantenha todas as soluções de diluição de digitonina e o controle DMSO em gelo até que sejam usadas.
6. Determine o número de células necessárias multiplicando o número de condições de permeabilização pelo número de células necessárias por teste. Inclua mais 20% para compensar a variação da pipeteação (por exemplo, para cinco condições em 5×10⁵ células cada, prepare aproximadamente 1,2 x 5 x 5 x 10⁵ células).
7. Colete o número necessário de células cultivadas por centrifugação a 600 × g por 3 minutos em temperatura ambiente (RT). Resuspenda o pellet em 600 μL de 1× PBS (100 μL por condição mais 20% extra).
8. Aliquota 100 μL das células ressuspensas por PBS em cinco tubos microcentrífugas de 1,5 mL — um tubo para cada concentração de digitonina e um para o controle DMSO.
9. Centrifuge os tubos a 600 × g por 3 minutos em RT.
10. Remova cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda cada pelote em 50 μL do correspondente buffer de controle de digitonina ou DMSO.
11. Incube as amostras em tempo de descanso por 10 minutos.
12. Misture 10 μL das células tratadas com 10 μL de azul de tripano e carregue 10 μL da mistura em uma lâmina de contagem celular.
13. Use um contador de células para quantificar células viáveis (não coradas) e células positivas permeabilizadas não viáveis (coloridas de azul).
14. Identifique a menor concentração de digitonina que produz a maior proporção de células positivas para o azul de tripano. Use essa concentração para o experimento CUT&RUN a jusante. Confirme que o controle DMSO mantém a viabilidade típica de uma cultura celular saudável normal.

3. SEQ DE CORTE E CORRIDA

NOTA: Os reagentes deste protocolo são dimensionados para 5 reações, com adicionação extra para compensar a perda de pipeteamento. Para uma lista de materiais e equipamentos, consulte a Tabela de Materiais. Pelo menos duas réplicas biológicas independentes são recomendadas para cada experimento CUT&RUN.

1. Dia 1
   1. PREPARAÇÃO DE TAMPÃO DE CORTE E CORRIDA
      1. Prepare o tampão de lavagem combinando o Tampão Pré-Lavagem, o inibidor de protease 25x e 1 M de Espermidina conforme descrito na Tabela 3.
      2. Prepare o Buffer de Permeabilização Celular adicionando 5% de Digitonina ao Wash Buffer conforme a Tabela 3.
      3. Prepare o Tampão de Anticorpos adicionando 0,4 μL de EDTA a 100 μL de Tampão de Permeabilização Celular com a concentração apropriada de digitonina, conforme descrito na Tabela 3. Coloque o buffer preparado no gelo.
      4. Armazene o restante do Cell Permeabilization Buffer a 4 °C para uso no segundo dia.
   2. Ativação das contas de concanavalina A ()
      1. Resuspenda suavemente a suspensão das contas para garantir sua distribuição uniforme.
      2. Transfira 55 μL da suspensão das esferas (11 μL por amostra) para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
      3. Coloque o tubo em um suporte magnético de 1,5 mL até que as esferas estejam totalmente separadas, depois faça uma pipete para remover o sobrenadante.
      4. Lave imediatamente as esferas duas vezes com 500 μL de tampão de ativação de esferas gelado (100 μL por amostra). Resspense as contas pipetando suavemente a cada lavagem e use o suporte magnético para descartar o sobrenadante entre as lavagens.
      5. Após a lavagem final, remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente as esferas ativadas em 55 μL (11 μL por amostra) de tampão de ativação de esferas geladas.
      6. Aliquota 10 μL das esferas suspende em cada tubo de um conjunto de tubos de 8 tiras e mantenha os tubos no gelo.
   3. Colhe células e liga células a esferas ativadas
      NOTA: A viabilidade celular é importante para a relação sinal/fundo. No entanto, a viabilidade das linhas celulares NE do SCLC pode variar (70%-90%) devido à alta taxa inerente de renovação celular e à preferência por crescer como agregados médios a grandes em suspensão.
      1. Retire as células da incubadora de 37 °C e examine-as ao microscópio para garantir a qualidade.
      2. Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 50 mL e centrifuge a 1.000-1.200 × g por 5 minutos em RT.
      3. Aspire o meio do tubo cônico e enxágue o pellet celular com 20 mL de 1× PBS.
      4. Centrifuge novamente, aspire o PBS e digera o pellet com Accutase por 3-5 minutos a 37°C, dependendo do tamanho do pellet.
      5. Termine a digestão adicionando 5 mL de PBS + 10% de FBS. Obtenha a suspensão de célula única pipetando suavemente para cima e para baixo com uma pipeta sorológica.
      6. Centrifuge as células a 1.000-1.200 × g por 5 minutos, descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet da célula em 5 mL de PBS.
      7. Conte as células iniciais, confirme a viabilidade e integridade das células.
      8. Calcule o número total de células necessárias multiplicando o número de reações pelo número de células por reação (5×10⁵). Adicione 20% de excesso para compensar erros de pipetagem (por exemplo, 1,2 × 6 × 5 × 10⁵ para 6 reações). Transfira as suspensões de células calculadas para tubos de 1,5 mL. Centrífuga a 600 x g, 3 min em RT.
         NOTA: Prepare pelo menos uma reação adicional como backup.
      9. Resuspenda as células no RT Wash Buffer a uma densidade de 5×^{10 5} células por reação (seis reações no total), usando 100 μL por reação, pipetando suavemente, porém minuciosamente, para garantir uma suspensão uniforme. Centrifuge a 600 x g por 3 minutos em RT. Pipete para remover o sobrenadante.
      10. Repita a etapa de lavagem (Passo 9) mais uma vez.
      11. Aliquota 100 μL de células lavadas para cada tubo do conjunto de 8 tiras contendo 10 μL de esferas de CoA ativadas. Pipete suavemente para misturar e gire rapidamente em uma mini centrífuga para coletar a polpa (as contas não devem se depositar).
      12. Incube a pasta das células das contas por 10 minutos em RT para permitir que as células se liguem às esferas.
      13. Coloque os tubos em um suporte de ímãs de 0,2 mL, deixe a pasta se dissipar e faça uma pipete para remover o sobrenadante. Economize 10 μL de sobrenadante para confirmar que as células estão ligadas às contas. Descarte o supernadante restante e avance rapidamente para a próxima etapa.
      14. Remova os tubos do ímã. Adicione imediatamente 50 μL de tampão de anticorpos gelado a cada reação e pipete suavemente para ressuspender as contas.
      15. Misture 10 μL tanto do sobrenadante quanto 10 μL da suspensão célula/esfera (ressuspensa em buffer de anticorpos) com 10 μL de azul de tripano e coloque a mistura sobre a lâmina de contra-cápsula celular.
      16. Analise com um contador de células. Confirme que o sobrenadante contém quase nenhuma esferas ou células, e a mistura de contas/células contém células permeabilizadas cercadas por contas.
          NOTA: É importante verificar a compatibilidade da ligação das contas de CoA das células.
   4. Permeabilização e ligação de anticorpos
      NOTA: O sucesso do CUT&RUN depende criticamente da afinidade do anticorpo com seu alvo e de sua especificidade sob condições experimentais específicas. Recomendamos o seguinte: 1. Use anticorpos comerciais que tenham sido validados para CUT&RUN quando disponíveis. 2. Para alvos sem anticorpos validados por CUT&RUN, considere aqueles validados para Imunofluorescência (FI), pois os anticorpos IF reconhecem epítopos em seu contexto celular nativo, semelhante à ligação in situ do anticorpo ao alvo dentro de células permeabilizadas em CUT&RUN. 3. Teste de 3 a 5 anticorpos em paralelo para identificar o mais eficaz para sua aplicação específica.
      1. Gire rapidamente o painel K-MetStat e a pipete para resuspensão. Adicione 2 μL de painel K-MetStat às reações designadas para anticorpos controle positivos H3K4me3 e negativos para IgG. Pipeta para misturar e tubos de giro rápido (opcional).
      2. Adicione 0,5 μg de cada um dos anticorpos H3K4me3, H3K4me1 e IgG, e 0,6 μg de anticorpos policlonais E2F7 de diferentes fontes para cada reação (Tabela 4). Rotule os tubos de 8 tiras.
      3. Pipete suavemente para misturar corretamente cada tubo de reação. Incube durante a noite a 4 °C em um nutator com as tampas dos tubos elevadas. Não gire nem inverta os ^tubos.
2. Dia 2
   1. Ligação da pAG-MNase ao anticorpo
      NOTA: Contas que assentam durante a noite é normal e não afeta os resultados. Se as contas ficarem grumosas ou pegajosas após a incubação durante a noite, ressuspenda-as com pipeteamento suave. Para melhorar a consistência e o throughput, recomenda-se a pipeteação multicanal. Ao usar tubos de 8 tiras, remova e volte a colocar os tampões uma tira de cada vez para evitar que as esferas de sequem.
      1. Coloque o suporte magnético no gelo.
      2. Remova os tubos de 8 tiras da incubação a 4 °C e faça uma rotação rápida para coletar o líquido.
      3. Coloque tubos no suporte magnético até a polpa se dissipar. Pipete cuidadosamente e remova o sobrenadante.
      4. Mantenha os tubos no suporte magnético. Lave os tubos duas vezes com 200 μL de tampão de permeabilização celular fria. Pipeta para remover o sobrenadante.
      5. Remova os tubos do suporte magnético e adicione imediatamente 50 μL de Permeabilização Celular Fria a cada reação. Pipetando suavemente para ressuspender células/esferas.
      6. Adicione 2,5 μL de pAG-MNase a cada reação e misture bem pipetando suavemente.
      7. Incubar reações por 10 minutos no tempo de descanso.
      8. Gire rapidamente os tubos, coloque-os de volta no suporte magnético até a polpa se dissipar. Pipeta para remover o sobrenadante.
      9. Mantendo os tubos em suporte de ímã, lave os tubos duas vezes com 200 μL de tampão de permeabilização de célula fria. Pipeta para remover o sobrenadante.
      10. Remova os tubos do suporte do ímã, resuspenda suavemente em 50 μL de Buffer de Permeabilização Celular Fria. Coloque os tubos no gelo.
   2. Digestão e liberação direcionadas de cromatina
      NOTA: Realize digestão dependente de Ca²⁺ a 0 °C para minimizar a clivagem não intencional da MNase do DNA¹² acessível. Inclua DNA spike-in, como Escherichia coli (E. coli), de modo que represente aproximadamente 0,5-5% (idealmente ~1%) do total de sequenciamento¹³. O DNA spike-in é usado para normalizar a profundidade de sequenciamento e é particularmente importante ao comparar amostras em uma série, por exemplo, ao avaliar as mudanças globais de modificação de histonas após inibição ou deleção genética de enzimas modificadoras de histonas.
      1. Adicione 1 μL de 100 mM de Cloreto de Cálcio a cada reação na tira de 8 tubos (do passo 3.2.1.10) enquanto estiver no gelo. Pipete suavemente para resuspender completamente as contas e garantir uma digestão eficiente.
      2. Incube os tubos em um nutator a 4 °C por 2 horas, com as extremidades com a tampa elevadas.
      3. Em um novo tubo de 1,5 mL, prepare a Mistura de Buffer de Parada. Para cada reação, combine 33 μL de Stop Buffer com 1 μL de DNA spike-in de E. coli (0,5 ng). Leve suavemente o vórtice para misturar.
      4. Adicione 33 μL de buffer de parada a cada reação ao final da incubação de 2 horas. Misture pipetando suavemente.
      5. Incube as reações em um termociclador a 37 °C por 10 minutos.
      6. Centrifuge rapidamente tubos para coletar o conteúdo no fundo e depois coloque-os em um suporte magnético até que a solução fique clara.
      7. Transfira cuidadosamente aproximadamente 84 μL de sobrenadante, que contém o DNA liberado por CUT&RUN, para tubos frescos de 1,5 mL.
   3. Purificação de DNA usando o Kit de Purificação de DNA (veja a Tabela de Materiais)
      NOTA: Antes do primeiro uso, adicione 6,9 mL de isopropanol ao Buffer de Ligação ao DNA e adicione 20 mL ≥ etanol 95% ao DNA Wash Buffer.
      1. Adicione 420 μL de Buffer de Ligação ao DNA a cada supernadante coletado. Vórtice brevemente para misturar completamente.
      2. Coloque uma coluna de limpeza de DNA em seus tubos de coleta.
      3. Carregue cada amostra na coluna correspondente.
      4. Centrifugar a 16.000 × g por 30 s em RT. Descarte o fluxo e retorne a coluna ao tubo coletor.
      5. Adicione 200 μL de buffer de lavagem de DNA a cada coluna e centrifuge a 16.000 x g por 30 s em RT. Descarte o fluxo e coloque a coluna no tubo de coleta.
      6. Repita a etapa de lavagem uma vez.
      7. Centrifuge novamente a 16.000 x g por 30 s em RT para remover totalmente o tampão residual de lavagem.
      8. Transferir colunas para tubos rotulados de 1,5 mL.
      9. Aplique 12 μL de Elution Buffer diretamente na membrana no centro da coluna.
      10. Incube por 5 minutos em RT e depois centrifuge a 16.000 × g por 1 minuto em RT para eluir o DNA.
          NOTA: Este é um ponto seguro de parada. Armazene o DNA eluido a -20 °C para processamento futuro.
   4. Quantificação de DNA CUT&RUN e análise de distribuição do tamanho dos fragmentos
      NOTA: Quantifique o DNA usando um fluorômetro com o kit de ensaio de alta sensibilidade dsDNA, que fornece medições mais precisas do DNA em fita dupla do que métodos baseados em absorção.
      1. Use 1 μL de cada amostra para determinar a concentração de DNA de CUT & RUN usando o Kit de Ensaio de Alta Sensibilidade dsDNA (veja a Tabela de Materiais).
      2. Use 1 μL adicional de DNA para avaliar a presença e a distribuição de tamanho dos fragmentos cortados. Realize a análise de fragmentos usando o Kit de DNA de Alta Sensibilidade (veja Tabela de Materiais) seguindo as diretrizes do fabricante (opcional).
         NOTA: Proteínas de ligação altamente abundantes, como modificações pós-traducionais de histonas (PTMs), podem ser facilmente detectadas nessa etapa. No entanto, fatores de transcrição de baixa abundância podem ser mais difíceis de detectar.
   5. Construção de bibliotecas, análise de fragmentos e sequenciamento
      NOTA: ≤5 ng de DNA total CUT&RUN, conforme determinado pela quantificação do Kit de Ensaio de Alta Sensibilidade dsDNA, foi usado para a construção das bibliotecas de sequenciamento de próxima geração (NGS) CUT&RUN. Para minimizar os dímeros do adaptador, reduza o adaptador do Illumina para 1 μL para a ligação do adaptador. O número de ciclos de PCR durante a construção da biblioteca pode ser ajustado com base na quantidade de entrada, rendimento da biblioteca e taxa de duplicação. Diferentes estratégias de seleção de tamanho das Esferas Magnéticas (ver Tabela de Materiais) podem ser usadas dependendo dos PTMs ou fatores de transcrição do alvo-histona.
      1. A construção da biblioteca foi feita usando o kit de preparação da biblioteca CUT&RUN (veja Tabela de Materiais) conforme as instruções do fabricante do kit, com pequenas modificações. Em resumo, 5 ng de CUT&RUN DNA foram usados como entrada recomendada para a preparação da biblioteca. Para DNA com menos de 5 ng, use o máximo possível para preparação para a biblioteca. Primers duplos de índice i5 e i7 foram usados para cada amostra para garantir o sucesso do sequenciamento multiplexado.
         NOTA: Este é um ponto seguro de parada. O DNA pode ser armazenado a -20°C para processamento posterior.
      2. Meça a concentração da biblioteca CUT&RUN com um fluorômetro e o kit de ensaio de alta sensibilidade dsDNA. A distribuição de tamanho das bibliotecas NGS do CUT&RUN foi determinada usando o Kit de DNA de Alta Sensibilidade (veja Tabela de Materiais) com base no Guia do Kit de DNA de Alta Sensibilidade ou em um instrumento de eletroforese capilar comparável, o TapeStation (veja Tabela de Materiais).
         NOTA: Dilua a biblioteca CUT&RUN para trazer a concentração dentro da faixa de detecção do Kit de Ensaio de Alta Sensibilidade dsDNA e do Kit de DNA de Alta Sensibilidade.
      3. Bibliotecas de pool (40-46) baseadas em índices moleculares e únicos iguais. Após a purificação de DNA Seleção do tamanho das Esferas Magnéticas, o sequenciamento de extremidades pareadas (comprimento de leitura de 100 bp) para as bibliotecas agrupadas foi realizado em um sistema Illumina NovaSeq 6000 para metade do S-Prime (SP) com uma profundidade de leitura estimada de 10 milhões de leituras por biblioteca.
   6. Análise de dados CUT&RUN
      1. Analise dados CUT&RUN usando um pipeline personalizado (Figura 5A). Avalie a qualidade da leitura com o FastQC. Remova sequências de adaptadores do início das leituras usando o Cutadapt. Alinhe leituras de extremidade pareada ao genoma humano (hg38) e ao genoma de referência de E. coli com Bowtie2. Use o Samtools para remover leituras não mapeadas. Remova leituras duplicadas com Picard e gere arquivos bedGraph usando o Bedtools. Crie arquivos bigWig (bw) com o DeepTools. Visualize os dados usando IGV e DeepTools. Normalize o total de leituras para o spike-in de leituras de E. coli . Realize chamadas de pico usando SEACR (Análise de Enriquecimento Esparso para CUT&RUN⁾¹⁹.

Resultados

Linhas celulares típicas ou "clássicas" do SCLC NE são caracterizadas por núcleos grandes, citoplasma escasso e crescimento como agregados não aderentes ou esferoides compactos em suspensão. Linhas celulares de alto nível ASCL1, como NCI-H146 e DMS79, e linhagens celulares NEUROD1-altas, como NCI-H82 e H446, exibem esse fenótipo clássico do SCLC: células de pequeno a médio porte com citoplasma escasso, cromatina finamente granular e tendência a crescer predominantemente como agregados nã...

Discussão

A desregulação epigenética e os LDTFs são fatores principais que impulsionam a biologia tumoral^{do SCLC 6}. Determinar a distribuição genômica de modificações específicas de histonas e proteínas de ligação ao DNA no SCLC pode revelar mecanismos potenciais de resistência terapêutica adquirida e plasticidade fenotípica. O CUT&RUN-SEQ é um método poderoso para mapear interações entre histonas e não histonas proteína-DNA em alta^{resolução 14} de cé...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente
RPMI-1640 media	Gibco ThermoFisher Scientific	11875093	Meio de cultura celular
Soro Bovino Fetal (FBS)	Neurômica	FBS002-HI	Componente do meio de cultura celular
1% Penicilina-Estreptomicina	Gibco ThermoFisher Scientific	15140122	Antibióticos, para prevenir a contaminação bacteriana de culturas celulares
Solução Trippan Blue, 0,4%	Gibco ThermoFisher Scientific	15250061	A coloração com azul de tripano foi usada para avaliar a permeabilidade com um contador celular automatizado.
Roche cOmplete, Coquetel Proease Inibidor de Proease sem EDTA	Roche	11873580001	Inibidor de protease. Componentes do amortecedor de lavagem
5% Digitonin	EpiCypher	21-1004	Componentes de buffer  e a receita de Buffer pode ser encontrada na folha de Buffer
Buffer de ativação das contas	EpiCypher	21-1001	Componentes de buffer  e a receita de Buffer pode ser encontrada na folha de Buffer
Contas Concanavalin A ()	EpiCypher	21-1401	Microesferas paramagnéticas conjugadas com são esferas magnéticas revestidas de lectina que permitem a ligação da membrana lipídica
CUT& RUN Kit	EpiCifra do ChIC de CUTANA	14-1048	Reagentes para CUT & Geração de DNA RUN
Kit de Purificação de DNA	CUTANA  EpiCypher	14-0050	Extraia o DNA dos fragmentos de DNA alvo liberados no supernantante na reação
CUT& Kit de Preparação para a Biblioteca RUN	EpiCifra CUTANA	14-001	Gerar o CUT& RODAR BIBLIOTECAS DE SEQUENCIAMENTO DE PRÓXIMA GERAÇÃO (NGS)
Purificação de DNA Esferas Magnéticas	Agencourt AMPure XP Beckman Coulter	A63880	Limpeza do produto por PCR e seleção de tamanho (ou seja, remoção do dímero e primer do adaptador)
DNA de spik-in da E. coli	EpiCypher	18-1401	Usado como um spike-in exógeno para calibrar leituras de sequenciamento em uma série de amostras— por exemplo, condições tratadas versus não tratadas
pAG-MNase	EpiCypher	15-1016	Ao se ligar ao anticorpo primário, a enzima cliva o fragmento de DNA alvo em ambos os lados da proteína ligada quando ativada pelo cálcio
PBS PH7.4 1x	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10010-049	Lavagem das células
Amortecedor de Pré-Lavagem	EpiCypher	21-1002	Componentes de buffer  e a receita de Buffer pode ser encontrada na folha de Buffer
Alta Sensibilidade de dsDNA   Kit de Ensaio	QubitTM Thermo Fisher Scientific	Q32854	CUT& Quantificação do DNA RUN
Buffer de Parada	EpiCypher	21-1003	Componentes de buffer  e a receita de Buffer pode ser encontrada na folha de Buffer
Kit de DNA de Alta Sensibilidade	Tecnologias Agilent	5067-4626	CUT& Análise de quantificação e distribuição de tamanho de fragmentos em bibliotecas de DNA e NGS RUN
Material
Tubos PCR de 8 tiras de 0,2 mL	EpiCypher	10-0009k	Tubos para CUT& REAÇÕES RUN, compatíveis com os tubos de 0,2 ml Magnetic Separation Rack
Slides LUNA de 8 canais	Logos BioSystems INC	L72001	Slides para contagem de células,  Verificação de viabilidade e integridade das células
Reservatório de reagentes multicanal	Fisher Scientific	14-387-072	Recipiente de lavagem do tampão
DynaMagTM-2 (Rack de separação magnética), tubos de 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	12321D	As esferas foram isoladas de seu buffer de armazenamento por um rack de separação magnética e subsequentemente ativadas por ressedição em buffer de ativação em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
Rack de Separação Magnética, tubos de 0,2 mL	EpiCypher	10-0008	Fique para separar  células de ligação de esferas, anticorpos, pAG/MNase de reação e lavagem de tampões
Pesquisa Eppendor mais Pipeta de 8 Canais, 0,5-10 uL	Eppendorf	3125000010	Amostras dos tubos de aspiração de 8 tiras   Para acelerar o fluxo de trabalho, pipettor multicanal comparável
Pipeta Eppendorf Refrence 2 de 8 canais, 30-300 uL	Eppendorf	4926000050	Etapas de aspiração e lavagem para acelerar o fluxo de trabalho, pipettor multicanal comparável
Equipamento
Misturador Vortex-Genie 2 da Scientific Industries, velocidade variável, 120V	Fisher Scientific	50-728-002	Min-centrífuga e spin
LUNA FX7 contador automático de células	Logos BioSystems INC	L70001	Contador de Células
Misturador de nutação	VWR	82007-202	Etapas de incubação das esferas (incubação noturna de anticorpos, reação de digestão por pAG-MNase).
Eppendorf 6331 Nexus Gradient MasterCycler Thermal Cycler	Eppendorf	6331	CUT& Construção de biblioteca de próxima geração RUN
Fluorômetro Qubit 4	Thermo Fisher Scientific	Q33226	Quantificação de DNA.
Bioanalisador Agilent 2100	Tecnologias Agilent	G2939A	Tamanho do fragmento, análise de concentração para CUT & CORRA DNA E CORTE& RODAR BIBLIOTECAS,   instrumento de eletroforese capilar comparável (por exemplo, Agilent TapeStation)
Agilent TapeStation	Tecnologias Agilent	G2992AA	Tamanho do fragmento, análise de concentração para CUT & CORRA DNA E CORTE& Bibliotecas RUN
Sistema Illumina NovaSeq 6000	Illumina, San Diego, CA, EUA		Sequenciando o CUT & Pool agrupado RUN: BIBLIOTECAS & NBSP;