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Artigo de investigação

Regulação da Via AKT/Wnt/β-catenina e indução da cuproptose por curcumina em glioblastoma

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DOI:

10.3791/69663

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27 de janeiro de 2026

 , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Yangtze University

Neste artigo

Resumo

A curcumina (CUM) inibe a progressão do glioblastoma (GBM) ao induzir a cuproptose por meio da supressão do eixo AKT/Wnt/β-catenina. Este protocolo investiga o mecanismo molecular pelo qual o CUM impede a progressão maligna na GBM e descreve métodos para avaliar como o CUM induz a cuproptose modulando essa via.

Resumo

A curcumina (CUM) pode regular o comportamento maligno do glioblastoma (GBM). Este estudo investiga se o CUM suprime a progressão do GBM ao induzir a cuproptose via da via de sinalização AKT/Wnt/β-catenina. As concentrações ótimas de curcumina foram determinadas usando o ensaio MTT. As células A172 e U251 foram tratadas com CUM, inibidor de AKT MK-2206, inibidor de Wnt LGK974 e Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl2). Proliferação celular, migração, invasão e apoptose foram avaliadas usando coloração por aminoésteres de succinimidil carboxifluoresceína, ensaios scratch, ensaios Transwell e citometria de fluxo, respectivamente. Fluorescência MitoSOX, análise metabólica de cavalo-marinho, imunofluorescência, detecção de2+ e Western blot foram usados para avaliar o estresse oxidativo mitocondrial e a cuproptose. O eixo AKT/Wnt/β-catenina foi analisado usando um kit de repórter TCF/LEF1 e western bloting. Um modelo de xenoenxerto de GBM foi estabelecido, e o CUM foi administrado por gavage por cinco semanas. Os efeitos do CUM no crescimento tumoral, cuproptose e expressão da proteína das vias AKT/Wnt/β-catenina foram avaliados. As células foram tratadas com 10 μM e 20 μM de CUM in vitro. O tratamento com CUM reduziu a proliferação, migração e invasão, ao mesmo tempo em que promoveu o estresse oxidativo e a cuproptose. O CUM também suprimiu a atividade de sinalização Wnt/β-catenina. A inibição das vias aumentou os níveis de espécies reativas de oxigênio (3,7 vezes) e2+ (3,1 vezes), além de diminuir a expressão da acetiltransferase de dihidrolipoamida, restringindo assim o comportamento maligno. Em camundongos nus, o CUM reduziu significativamente o crescimento tumoral, promoveu a cuproptose e inibiu a ativação do eixo AKT/Wnt/β-catenina. Nossos resultados indicam que o CUM suprime a sinalização AKT/Wnt/β-catenina, promove a cuproptose e interfere na progressão do GBM.

Introdução

O glioma é o tumor maligno intracraniano primário mais prevalente no sistema nervoso central (SNC)1. Glioma grau 4 geralmente se refere a glioblastoma (GBM), comprognóstico 2 ruim. A GBM é um tumor cerebral altamente invasivo, responsável por quase 50% das malignidades do SNC, com uma sobrevivência mediana inferior a 1ano e 3. É conhecido por sua alta malignidade e alta taxa derecorrência 4,5. Atualmente, as estratégias de tratamento da GBM dependem principalmente da cirurgia, complementada por radioterapia, quimioterapia e outros métodos abrangentesde tratamento 6. Embora estratégias terapêuticas emergentes, como imunoterapia, bioterapia e nanomedicina, tenham alcançado resultados notáveis em estudospré-clínicos7,8, a taxa geral de sobrevivência a 5 anos permanece apenas 4,3%. O regime de quimioterapia mais comumente utilizado é o conhecido regime Stup; no entanto, para pacientes com GBM com MGM não metilada, a taxa geral de sobrevivência não é significativamenteprolongada 10. Portanto, explorar novas estratégias de tratamento é fundamental para prolongar o período de sobrevivência dos pacientes. Esta pesquisa levanta a hipótese de que o mecanismo anticâncer da curcumina (CUM) na GBM envolve a cuproptose.

Metabolismo anormal do cobre ou danos celulares induzidos pelo cobre podem levar a uma série de doenças11. Em condições redox convencionais, o+ reduzido pode ser oxidado a2+. Tsvetkov et al. encontraram um mecanismo previamente desconhecido de morte celular induzida pelo cobre, chamado cuproptose. Íons2+ se ligam a compostos acilados e, em seguida, a expressão das proteínas cluster Fe-S é reduzida, causando morte celular12,13. Pesquisas extensas confirmaram que a cuproptose está intimamente associada ao processo fisiopatológico dostumores 14,15. RNAs e genes relacionados à cuproptose representam potenciais biomarcadores para o prognóstico e tratamento doGBM 16. A BCMD pode liberar2+, induzir cuproptose e desencadear a morte celular imunogênica para tratar oGBM 17. Portanto, acreditamos que a cuproptose pode ser usada como um novo alvo na terapia com GBM. No entanto, a maioria dos esquemas existentes depende de transportadores sintéticos como Elesclomol-ou da indução direta de íons de cobre de alta concentração. Embora essa intervenção drástica exógena possa provar o conceito de cuproptose, suas perspectivas de transformação clínica são limitadas devido à falta de correlação fisiológica e direcionamento. Portanto, a busca por compostos naturais ou de pequenas moléculas que possam regular endógenamente e com precisão a cuproptose do GBM e elucidar seu mecanismo de sinalização a montante tornou-se uma ponte fundamental entre esse mecanismo inovador e o tratamento clínico.

A medicina chinesa tem sido amplamente considerada um recurso valioso para a pesquisa de medicamentos antitumorais. CUM é uma substância polifenólica extraída da cúrcuma da medicina tradicional chinesa. A farmacologia moderna confirmou que ele possui funções antioxidantes, anti-inflamatórias e antitumorais. O CUM tem muitas atividades antitumorais. Pode reduzir a atividade das células GBM promovendo apoptose, perturbação das vias multimoleculares e outrosmecanismos 18. Experimentos in vitro mostraram que baixas doses de CUM combinadas com irradiação podem aumentar sinergicamente a proliferação deantiGBM 19. Além disso, o CUM pode regular vias centrais relacionadas ao GBM, incluindo o MAPK20. Comparado à quimioterapia tradicional com temozolomida (TMZ), a CUM apresenta vantagens terapêuticas únicas. A eficácia da temozolomida é frequentemente limitada pelos poderosos mecanismos de reparo do DNA no GBM, resultando em resistência a medicamentos; o mecanismo pelo qual o CUM induz a cuproptose ao direcionar o metabolismo mitocondrial21,22 é independente da TMZ. A CUM pode não apenas regular os processos metabólicos relacionados à cuproptose, mas também interferir simultaneamente em múltiplas vias principais de sinalização relacionadas à progressão da GBM, oferecendo potenciais caminhos para superar as limitações de terapias únicas e desenvolver estratégias de tratamento combinadas. A faixa de concentração de CUM utilizada neste estudo (10-20 μM) é consistente com as concentrações efetivas relatadas em estudos de tratamentopré-clínico 23. Embora a baixa biodisponibilidade oral inerente do CUM e sua eficiência de entrega através da barreira hematoencefálica sejam desafios chave em aplicações práticas, sistemas emergentes de nano-entrega e estratégias de modificação direcionada têm fornecido soluções promissoras para superar essegargalo 24.

Embora os efeitos proapoptóticos, antiproliferativos e inibidores de migração do CUM no GBM tenham sido relatados por muitos estudos25,26, a maioria das pesquisas existentes tem se concentrado em seus efeitos sobre vias tradicionais de apoptose ou autofagia. Este estudo tem como objetivo esclarecer se o CUM inibe a progressão maligna da GBM ao regular a cuproptose. Investigamos se o CUM pode induzir cuproptose em parte por meio da supressão do eixo AKT/Wnt/β-catenina, suprimindo assim a GBM. Com base nisso, este estudo fornece bases experimentais para a CUM melhorar o tratamento da GBM e para o desenvolvimento de novos alvos na terapia com GBM.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados em conformidade com os padrões institucionais estabelecidos para o cuidado e uso humanitário de animais de laboratório e foram formalmente aprovados pelo Comitê de Ética Animal da instituição. Medidas foram tomadas para reduzir o desconforto e o sofrimento dos animais sempre que possível.

Trabalhos envolvendo compostos químicos, corantes e amostras biológicas seguiram práticas estabelecidas de biossegurança para mitigar riscos potenciais. Substâncias potencialmente perigosas — incluindo paraformaldeído, reagentes à base de cobre e DHE — foram manuseadas com equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo luvas, máscaras faciais e óculos de proteção. Todos os materiais residuais, como reagentes usados e itens descartáveis contaminados, foram segregados em recipientes designados para riscos biológicos e posteriormente tratados por serviços autorizados de gestão de resíduos perigosos, em conformidade com as regulamentações institucionais e de segurança ambiental. O desenho experimental geral está delineado na Figura 1.

Figura 1
Figura 1: O fluxo de trabalho deste estudo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Cultura celular e agrupamento
Astrócitos cerebrais humanos normais (NHA) e linhagens celulares de glioblastoma A172, U251, LN229 e SHG-44 (veja Tabela de Materiais) foram cultivados em meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e mantidos em incubadora a 3 °C com 5% de CO₂. O meio era trocado dia sim, dia não, e as células eram transportadas quando atingiam aproximadamente 80% de confluência. A dose e o tempo de exposição adequados para CUM foram determinados usando o ensaio MTT. Células NHA, A172, U251, LN229 e SHG-44 foram tratadas com diferentes concentrações (0, 2,5, 5, 10, 20 e 4 μM) de CUM por 24, 48 e 7 horas, respectivamente23. Depois, 2 μL de solução de MTT foram adicionados. Após o h, 15 μL de dimetil sulfóxido foram adicionados a cada poço e misturados suavemente. A densidade óptica (OD) em 45 nm foi medida usando um leitor de microplaca. Células não tratadas (grupo controle) foram usadas como controles negativos em todos os experimentos.

As células A172 e U251 foram semeadas e divididas em grupos: Controle Central, CUM de baixa dose (1 μM), CUM de alta dose (2 μM), inibidor de AKT (MK-2206), inibidor de AKT + inibidor de Wnt (MK-2206 + LGK974) e Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl₂), com base nas condições de tratamento. As células dos grupos CUM foram tratadas com 10 ou 2 μM de CUM por 4 horas. As células do grupo MK-2206 receberam 1 μM de MK-2206 por 2 horas. Células do grupo MK-2206 + LGK974 foram tratadas com μM LGK974 para h após exposição ao MK-2206. Células do grupo Elsm-foram tratadas com 100 nM de Elesclomol e μM CuCl₂ por 4horas e 14 horas.

Citometria de fluxo
Células A172 e U251 cultivadas em cada grupo foram incubadas com PBS contendo 1 μg/mL de solução de coloração PI por 1 minuto. As células foram então tratadas com 0,25% de tripsina e coletadas por centrifugação (20 × g, min, temperatura ambiente). Células PI-positivas foram detectadas usando um citômetro de fluxo com canal PE (excitação a 488 nm), e a taxa de mortalidade celular foicalculada em 27.

Ensaio de aminoéster succinimidil (CFSE) de carboxifluoresceína
Células A172 e U251 foram incubadas com o corante CFSE μmol/L CellTrace a 3 °C por 1 minuto no escuro. O meio foi então neutralizado, e as células foram centrifugadas a 20 × g por mínimo em temperatura ambiente. Após a coleta, as células foram cultivadas e tratadas de acordo com seus agrupamentos. A intensidade da fluorescência CFSE foi analisada usando citometria de fluxo (excitação em 488 nm)27.

Ensaio de formação de clones celulares
Células cultivadas de A172 e U251 foram digeridas, ressuspensas e contadas. Foram adicionados dois mililitros da suspensão da célula preparada. Após uma mistura suave, as células foram incubadas por aproximadamente 14 dias. As células foram então fixadas com paraformaldeído a 4% por 3 minutos, e o fixador foi descartado. Após tingir com 0,1% de violeta cristalino. Imagens da colônia foram capturadas, e a taxa de formação de clones foi calculadaem 14.

Teste de arranhão celular
Células A172 e U251 (1 × 106 células/poço) foram cultivadas até atingirem 90% de confluência. A monocamada celular foi riscada uma vez usando uma ponta estéril de 2 μL para criar uma ferida e depois tratada com diferentes concentrações de CUM para h e 48 horas. As imagens foram capturadas usando um microscópio. A taxa de cicatrização dos arranhões foi avaliada usando o software ImageJ. As imagens foram convertidas para o formato de 8 bits, um limiar unificado foi estabelecido para distinguir a área de risco da área da célula, e as áreas de risco em 0 h e 48 h foram calculadas usando a função Analisar Partículas . Taxa de cura por arranhão (%) = (distância de 0 h − distância de 48 h) / distância de 0 h × 100%23.

Experimento Transwell
As células A172 e U251 foram expostas aos tratamentos especificados, depois destacadas enzimaticamente e centrifugadas a 200 × g por 5 minutos em temperatura ambiente. As células foram ressuspensas em meio sem soro. Matrigel foi diluído em proporção 1:8 em meio sem soro, completamente misturado, e 5 μL foram aplicados na câmara superior de um inserto Transwell, seguido por uma incubação de 4 horas. Um total de 5 × 10células de 4 por poço foram adicionadas à câmara superior, enquanto 60 μL de meio suplementado com 20% de FBS foram colocados na câmara inferior. Após 48 horas de incubação, as células foram fixadas usando paraformaldeído e coradas com violeta cristalino. Cinco campos visuais foram selecionados do centro e da periferia de cada poço. As células foram observadas e analisadas ao microscópio. Células invasoras foram calculadas usando o ImageJ. Imagens foram convertidas para o formato de 8 bits, limiares foram aplicados para distinguir células coloridas do fundo, e a função Analisar Partículas contou células que migraram pelamembrana 23.

Detecção de potencial de membrana mitocondrial (MMP)
Células A172 e U251 cultivadas em cada grupo foram incubadas com mL da solução de trabalho de JC-1 por 30 minutos no escuro. As células foram lavadas suavemente com buffer JC-1 pré-resfriado, observadas e fotografadas usando um microscópio de fluorescência. Usando excitação de 488 nm, sinais de polímero e monômero JC-1 foram coletados usando filtros de emissão de 590 nm e 530 nm, respectivamente. A razão de fluorescência vermelho/verde (agregados JC-1 para monômeros) foi analisada usando o software ImageJ para avaliar as alteraçõesMMP 28. Imagens dos canais vermelho e verde foram extraídas separadamente, e a intensidade média de fluorescência na mesma região foi quantificada.

Detecção da taxa de consumo de oxigênio (OCR)
Células cultivadas de A172 e U251 foram semeadas. A placa foi colocada em um analisador pré-aquecido a 3 °C para adaptação. Uma vez adaptado, o meio de determinação foi adicionado. Após a calibração automática, a placa foi equilibrada por 15-2 minutos a 3 °C semCO2. O TOC no início foi medido e o programa de ensaio foi configurado para registrar o OCR mitocondrial em intervalos definidos. Os dados foram exportados para análisesubsequente 28.

Detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) por sonda fluorescente MitoSOX
As células A172 e U251 foram ajustadas para uma densidade de 1 × 104 células/mL, e 1 mL por poço foi semeado em uma placa confocal, e então a intervenção medicamentosa foi realizada. O sobrenadante da célula foi descartado, e 1 mL de sonda MitoSOX diluída (1:1.000) foi adicionado. As células foram incubadas no escuro a 3 °C por 1 minuto. O sinal de fluorescência foi capturado usando um microscópio de fluorescência (excitação/emissão: 510/580 nm) para avaliar os níveis de ROSmitocondrial 29.

Imunofluorescência
As coberturas foram lavadas uma vez com meio de cultura DMEM. Depois, foram colocados em placas de seis poços para semeadura celular e intervenção com medicamentos. Após 24 horas, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% e posteriormente bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA) a 5% por 30 minutos. A solução bloqueante foi removida, e anticorpos primários diluídos direcionados à dihidrolipoamida acetiltransferase (DLAT) e β-catenina foram aplicados, seguidos por incubação durante a noite a °C 30. Anticorpos secundários marcados fluorescentemente foram então introduzidos e incubados a 3 °C por 30 minutos. Núcleos celulares foram contra-coloridos com DAPI, e lâminas foram montadas usando um reagente antifade. Imagens de fluorescência foram capturadas usando um microscópio de fluorescência, e a intensidade do sinal foi quantificada com o software ImageJ. As imagens eram convertidas para o formato de 8 bits, e um limiar consistente era aplicado para distinguir os sinais-alvo do ruído de fundo. A ferramenta Rectangle foi usada para selecionar as regiões celulares desejadas, e a intensidade média de fluorescência foi medidaem 27. Para visualizar as mitocôndrias, as células foram tratadas com 20 nM MitoTracker Red CMXRos por 30 minutos e depois fixadas com paraformaldeído30.

Kit de repórter de luciferase TCF/LEF1
A ativação Wnt/β-catenina nas células A172 e U251 foi avaliada usando um kit de repórter de luciferase TCF/LEF1. O vetor repórter TCF/LEF contém uma caixa TATA e elementos de resposta do fator de células T/fator de amplificação linfoide (TCF/LEF), permitindo a detecção indireta da atividade transcricional da β-catenina via expressão de proteína fluorescente verde (GFP). Células A172 e U251 cultivadas foram transfectadas reversamente com vetor repórter TCF/LEF de 5 ng. Dezesseis horas após a transfecção, a intensidade da fluorescência foi registrada usando um leitor de microplacas com configurações de excitação e emissão de 488 e 51 nm, respectivamente31.

Camundongos portadores de tumores
Dez camundongos nus machos BALB/c (7 semanas, 2 ± 2 g) foram mantidos sob condições específicas livres de patógenos (2 °C, 65% de umidade) com acesso irrestrito a comida e água padrão. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Revisão de Ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade do Yangtzé (No 2023092; data de aprovação: 18.10.2023).

Para estabelecer um modelo de xenoenxerto GBM, células A172 (4 × 106 células/mL) foram suspensas em meio sem soro, e 0,1 mL foram injetados subcutaneamente no flanco direito de cada camundongo. Os animais foram aleatoriamente designados para um grupo controle ou para um grupo de tratamento com CUM (n = 5 por grupo). O grupo CUM recebeu 60 mg/kg de curcumina diariamente via gávage oral, enquanto o grupo controle recebeu volume igual de soro fisiológico. Os diâmetros tumorais eram registrados a cada 7 dias usando um calibre vernier, e o volume tumoral era calculado usando a fórmula 1/2 × comprimento ×largura 2 (mm3). Após 5 semanas, camundongos foram eutanasiados por luxação cervical, e tumores foram colhidos em condições estéreis para mediçãode peso 32.

Ensaio TUNEL
Os tecidos tumorais foram fixados em paraformaldeído a 4% por 24 horas, desidratados em etanol, embutidos em parafina e seccionados em μm de espessura. As seções foram desceradas e reidratadas, enxaguadas com PBS, tratadas com proteinase K por 50 minutos para a coleta de antígeno e incubadas com peróxido de hidrogênio a 3%. A mistura de reação TUNEL foi aplicada por 1 hora, seguida pela montagem com um reagente antifade. Imagens de fluorescência foram adquiridas por microscopia, e células TUNEL-positivas por campo foram quantificadas usando o software ImageJ.

Imunohistoquímica
Seções tumorais embutidas em parafina foram assadas a 6 °C, desenceradas em xileno e reidratadas por meio de uma série graduada de etanol. A recuperação de antígenos foi realizada usando tampão EDTA aquecido, seguida pela extinção da atividade endógena da peroxidase. As lâminas foram incubadas com anticorpo primário anti-Ki-67 durante a noite a °C. Após a incubação com um anticorpo secundário por 20 minutos, as seções foram coradas com diaminobenzidina (DAB) por 5 minutos e contra-coloridas com hematoxilina. Após a desidratação e montagem com resina neutra, as lâminas eram fotografadas ao microscópio. A coloração positiva foi identificada por precipitado amarelo-marrom, e células Ki-67-positivas foram quantificadas usando ImageJ27.

Coloração por fluorescência com dihidroétidio (DHE)
Os níveis de ROS foram avaliados usando coloração por fluorescência de DHE. As seções de tecido tumoral congelado foram enxaguadas com PBS. A fluorescência de fundo foi extinta e μM DHE foi adicionado a cada seção por 3 minutos. Após a lavagem PBS, as seções foram seladas no escuro. A fluorescência foi observada usando um microscópio (excitação/emissão: 518/605 nm), e cinco imagens aleatórias foram coletadas por grupo. O ImageJ foi usado para quantificar os níveis de ROS.

Detecção de conteúdo2+
A concentração de2+ nas células GBM e tecidos tumorais foi avaliada usando um kit de detecção colorimétrica. As células A172 e U251, após o tratamento, foram colhidas e centrifugadas a 1.500 × g por 10 minutos a °C. Os pellets celulares foram ressuspensos em 0. mL de água destilada, sonicada sobre gelo, e centrifugada novamente. Os tecidos tumorais foram homogeneizados em água destilada e centrifugados de forma semelhante a 4 °C por 10 minutos. Os supernadantes (1 μL) foram transferidos para uma placa de 96 poços, misturados com 23 μL de reagente cromogênico, selados e incubados por 5 minutos. A densidade óptica (OD) foi medida em 58 nm usando um leitor de microplaca, e os níveis de2+ foramcalculados em 14.

Western Blot (WB)
Proteínas foram isoladas de células cultivadas e tecidos tumorais. Os supernadantes foram obtidos por centrifugação a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C, e as concentrações de proteína foram quantificadas usando um ensaio BCA. Após a desnaturação, as amostras foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para membranas PVDF e bloqueadas com leite desnatado a 5% por 1 hora. As membranas foram lavadas em TBST e incubadas durante a noite em °C com anticorpos primários contra FDX1, LIAS, DLAT, DLD, AKT, p-AKT, Wnt3a, GSK-3β, p-GSK-3β, β-catenina, p-β-catenina e β-actina (ver a Tabela de Materiais)14,33. Após lavagens adicionais de TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP por 1 hora, desenvolvidas usando reagente ECL e visualizadas por quimioluminescência. O software ImageJ foi usado para quantificar a intensidade do sinal usando a ferramenta de seleção de retângulos e a função de análise de gel. A expressão relativa de proteínas foi calculada como a razão entre o valor cinza da banda-alvo e o controle interno (GAPDH). Extratos nucleares de células A172 e U251 foram preparados usando um kit de extração de proteínas nucleares. A expressão da β-catenina e da Lamin B1 foi avaliada, com a Lamin B1 servindo como controle de carganuclear 34.

Análise estatística
Os resultados quantitativos refletem a média de três réplicas independentes. Todos os dados foram avaliados quanto à distribuição normal e homogeneidade da variância. A ANOVA unidirecional, seguida pelo teste post hoc de Tukey, foi usada para comparações entre múltiplos grupos. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DS). Um valor P inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Esses procedimentos foram usados para garantir a robustez dos dados e apoiar a confiabilidade das conclusões.

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Resultados

Inibição da viabilidade celular GBM e morte celular induzida
Primeiramente, não houve mudança significativa na viabilidade das células NHA após 2 horas, 48 horas e 72 horas de intervenção com CUM (Figura 2A), indicando que as concentrações de CUM usadas não tiveram efeito tóxico sobre as células normais. Em contraste, a viabilidade das linhas celulares de GBM (A172, U251, LN229 e SHG-44) foi significativamente reduzida em concentrações de CUM ≥ 1 μM (P < 0,05-0,001) (<...

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Discussão

A taxa de recorrência da GBM está associada às suas características biológicasmalignas 36. O CUM exerce efeitos anti-GBM ao regular o estresse oxidativo, apoptose, autofagia, metástase, invasão e alvosmoleculares-chave 37. Neste estudo, experimentos em nível celular demonstraram que a CUM aumentou significativamente a mortalidade celular da GBM e inibiu a proliferação, formação de colônias, migração e invasão — resultados consistentes com r...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de coloração de violeta cristalina a 0,1%ServicebioG1014Células de marcação
4% de paraformaldeídoBeyotimeP0099Consertar células ou tecidos
Inibidor de AKT (MK-2206)Selleck.cn, Xangai, ChinaS1078Inibidor específico de AKT
Anticorpos (primários e secundários)ABclonal Technology, Wuhan, China / abcam, Cambridge, Reino Unido / Servicebio, Wuhan, China / Beyotime, Xangai, China / Cell Signaling, Danvers, MA, EUAA8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025Detecção dos níveis de expressão proteica
Kit de detecção de apoptose celularServicebio, Wuhan, ChinaG1021Detecção de apoptose
Corante Cell Trace CFSEInvitrogen, Carlsbad, CA, EUAC34570Detecção de proliferação celular
Sistema de imagem por quimioluminescênciaBio-Rad, Hercules, CA, EUAChemi Doc XRS+Detecção de ultra-alta sensibilidade de proteínas
Kit de ensaio colorimétrico2+Elabscience, Wuhan, ChinaE-BC-K300-MDetecção do conteúdo de2+ em tecidos tumorais e células GBM
CuCl2Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha751944Indutor de cuproptose
Curcumina (CUM)Folha fonte de Xangai, Xangai, ChinaS19245Composto polifenólico
Kit de detecção DHEBeyotime, Xangai, ChinaS0063Detecção dos níveis ROS
Dimetil sulfóxido (DMSO)ServicebioG4101-2Solvente para ensaio MTT
Desenvolvedor ECLServicebioG2161Usado para Western blot
ElesclomolSelleck.cnS1052Indutor de cuproptose
Citometria de fluxoBD em Biociências, Nova Jersey, EUABD FACSria IIIUsado para ensaios de morte celular e CFSE
Microscópio de fluorescênciaOLYMPUS, Tóquio, JapãoIX73Usado para ensaios de Imunofluorescência, ROS, TUNEL, DHE e MMP
Linhagens celulares de glioblastoma A172 (RRID: CVCL_0131), U251 (RRID: CVCL_0021), LN229 (RRID: CVCL_0393) e SHG-44 (RRID: CVCL_6902)Punosai Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, ChinaCL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207Linhagens celulares de glioblastoma humano
Software GraphPad Prism 9.0GraphPad Software, LLCVersão 9.0Análise estatística
Software ImageJ 1.53kInstituto Nacional de Saúde MentalVersão 1.53kCálculo estatístico
Solução funcional JC-1Solarbio, Pequim, ChinaM8650Detecção de MMP
Ratos NUS machos BALB/cSlack Kingda Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, ChinaExperimento com camundongos
Leitor de microplacasBio-Tek, Vermont, EUAELX-800Para medição de valores OD450 nm
MicroscópioOLYMPUSBX53Usado para teste de arranhão celular, experimento Transwell e ensaios de imunohistoquímica
Sonda MitoSOXThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUAM36008Usado para detecção ROS
Mitotracker Red CMXRosThermo Fisher ScientificM7512Marcagem específica de mitocôndrias em células vivas
Kit de detecção de MTTServicebioG4101-1Detecção da viabilidade celular
Células normais de astrócitos do cérebro humano (RRID:CVCL_B0DK)Huatuo Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, ChinaHTX2408Linha celular para experimentos de controle
Kit de extração de proteína nuclearBeyotimeP0027Extração de proteínas nucleares
Analisador de metabolismo de energia das células de cavalo-marinhoAgilent,   Pequim, ChinaSeahorse XFUsado para detecção de OCR
Kit de repórter de luciferase TCF/LEF1Biolab Technology Co., Ltd, Pequim, ChinaDetecção da atividade da via de sinalização Wnt/β-catenina
Kit de detecção TUNELBeyotimeC1088Detecção de apoptose em tecidos tumorais
Inibidor de Wnt (LGK974)Selleck.cnS7143Inibidor específico de Wnt

Referências

  1. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  2. Liang, R., Xiang, Y., Hu, C., Tang, X. Expression and clinical significance of RBBP4 gene in lower-grade glioma: an integrative analysis. Biochem Biophys Rep. 35, 101533(2023).
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