Research Article
Em uma pequena coorte de doadoras, o envelhecimento reduziu a migração eletrotáxica dos hADSCs. O DCEF alterou a expressão gênica (747 para cima, 624 para baixo), enriquecendo os termos de transporte/canal GO de sódio e as vias PI3K-Akt KEGG, sugerindo envolvimento em eletrotaxia relacionada à idade, sem estabelecer causalidade.
As células-tronco humanas derivadas do adiposo (hADSCs) são fundamentais para a regeneração dos tecidos e cicatrização de feridas, e sua migração direcionada é um pré-requisito para exercer esses efeitos terapêuticos. Campos elétricos (EFs) são amplamente reconhecidos como pistas-chave que orientam a migração celular durante o reparo de feridas, mas o comportamento eletrotático dos hADSCs — especialmente como as características do doador (por exemplo, idade) regulam esse comportamento e seus mecanismos moleculares subjacentes — permanece pouco compreendido. Essa lacuna de conhecimento limita a aplicação otimizada dos hADSCs na medicina regenerativa. Neste estudo, validamos primeiro a existência de eletrotáxias em hADSCs e confirmamos sua dependência de tensão: sob campos elétricos de corrente contínua (DCEFs) de 100-200 mV/mm, os hADSCs migraram direcionalmente em direção ao ânodo, com intensidades de EF mais fortes aumentando tanto a direcionalidade quanto a velocidade de migração (em comparação com o controle de 0 mV/mm). Em seguida, comparamos hADSCs de doadoras jovens (27,00 ± 4,58 anos) e doadoras idosas (62,33 ± 4,04 anos) usando sequenciamento de RNA (RNA-seq) após estimulação DCEF de 200 mV/mm. A análise transcriptômica identificou 747 genes regulados para alta e 624 genes para baixo em hADSCs idosos, com genes diferencialmente expressos (DEGs) enriquecidos em processos/vias biológicas críticos para a eletrotáxia — incluindo transporte transmembrana de íons de sódio, atividade de canais de sódio dependente de voltagem (termos GO) e a via de sinalização PI3K-Akt (via KEGG). Funcionalmente, hADSCs idosos apresentaram migração anodal significativamente reduzida (diminuição da distância acumulada, distância euclidiana e da retealdade) em comparação com hADSCs jovens sob estimulação DCEF. Este estudo fornece a primeira evidência de eletrotaxia dependente da idade em hADSCs, demonstrando que a idade do doador está correlacionada com capacidade eletrotática comprometida. Além disso, revela que a atividade desregulada dos canais de sódio e a sinalização PI3K-Akt podem estar por trás desse declínio relacionado à idade. Essas descobertas apontam para os potenciais mecanismos regulatórios da eletrotaxia hADSC e oferecem novos insights para personalizar terapias baseadas em hADSC (por exemplo, selecionando doadores ideais ou direcionando vias de sódio/PI3K-Akt) para melhorar a regeneração dos tecidos e os resultados de cicatrização de feridas.
As células-tronco derivadas do adiposo (ADSC) possuem forte capacidade de autorrenovação e potencial regenerativo significativo. Sob condições adequadas de indução, podem se diferenciar em osteoblastos, condrócitos e adipócitos, entreoutros 1. Por meio da sinalização paracrina, a ADSC também pode apoiar a geração de vasos sanguíneos e vasoslinfáticos 2,3, inibir a formação decicatrizes 4 e apresentar efeitos reguladoresimunológicos 5. Portanto, a ADSC é considerada uma célula-semente ideal para terapias celulares em medicina regenerativa.
A função do ADSC é influenciada por várias características do doador, que podem afetar sua potencial eficácia em terapias celulares, incluindo idade do doador, índice de massa corporal, gênero eoutros 6. O ADSC derivado de doadores mais velhos apresenta características de envelhecimento mais pronunciadas, com potencial de diferenciação adipogênico reduzido, potencial de diferenciação osteogênico e capacidademigratória 7,8,9. Além disso, a capacidade de promover a proliferação de queratinócitos e estimular os mecanismos de autorreparo do corpo estádiminuída 10.
A migração dirigida por células é um mecanismo fisiológico chave na cicatrização de feridas e regeneração tecidicular, com campos elétricos (EFs) desempenhando um papel importante na orientação da migração celular e na promoção da reparaçãode feridas 11. Por exemplo, quando a barreira epitelial é danificada, campos elétricos endógenos são imediatamente gerados e persistem até que a ferida cicatrize e a função da barreira epitelial sejarestaurada 12,13,14. Como um dos sinais que orientam a migração celular dirigida, foi demonstrado que os sinais elétricos têm prioridade maior do que outros sinais coexistentes, como inibição de contato, forças mecânicas e fatores quimiotáticos15,16. Vários métodos foram desenvolvidos para promover a cicatrização de feridas e a regeneração dos tecidos, como por meio de medicamentos e dispositivos externos de estimulação elétrica que potencializam ou imitam os campos elétricos endógenos no corpohumano 17,18. A capacidade das células de migrar de acordo com um gradiente de campo elétrico é conhecida como eletrotaxia. Estudos in vitro mostraram que muitos tipos diferentes de células são capazes de migração direcionada em campos elétricos. Algumas células migram em direção ao ânodo, como as células da crista neural craniana de mamíferos, astrócitos humanos e células de câncer de mamahumano 19,20,21. Outras células migram em direção ao cátodo, como células epiteliais tubulares renais humanas, fibroblastos dérmicos humanos e neutrófiloshumanos 22,23,24. O ADSC pode ser guiado para migrar em direção ao ânodo em campos elétricos de corrente contínua (DC) e, sob condições prolongadas de cultivo, a corrente elétrica pulsada exógena demonstrou promover efetivamente a migração direcional do ADSC em direção ao ânodo, mantendo a viabilidade da célula25. Até o momento, estudos sobre as características da eletrotaxia das células-tronco humanas derivadas do adiposo ainda são escassos, e os mecanismos subjacentes que regulam seu comportamento eletrotático ainda não são totalmente compreendidos.
Somos os primeiros a investigar sistematicamente as diferenças eletrotáticas dependentes da idade em hADSCs entre doadoras jovens versus mulheres idosas sob campos elétricos de corrente contínua gradiente (DCEF), e a descobrir ainda mais os mecanismos subjacentes (envolvendo a atividade dos canais de sódio e sinalização PI3K-Akt) por meio de análise transcriptômica. Neste estudo, examinamos os efeitos do DCEF nos hADSCs. Utilizando sequenciamento de RNA e análise diferencial de enriquecimento gênico, comparamos perfis de expressão gênica entre dois grupos hADSC — derivados de doadoras jovens e idosas — após estimulação DCEF para identificar diferenças transcricionais relacionadas à idade. Hipotetizamos que o envelhecimento do doador prejudica a resposta eletrotáctica dos hADSCs, e que esse declínio relacionado à idade está ligado à alteração da atividade dos canais de sódio e à sinalização PI3K-Akt.
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O consentimento informado foi obtido de todos os participantes antes da coleta de tecido. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica da China (Aprovação nº: [2018]2018-110-2). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da coleta de tecidos
Isolamento e cultura hADSC
Coleta de tecidos: Amostras de tecido adiposo abdominal humano foram obtidas durante procedimentos rotineiros de lipoaspiração eletiva realizados no Departamento de Cirurgia Plástica do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica da China. Todas as doadoras eram voluntárias saudáveis que passaram por lipoaspiração abdominal estética, e nenhuma intervenção cirúrgica adicional foi realizada para fins de pesquisa. As amostras de tecido foram coletadas pelo cirurgião operador em condições estéreis imediatamente após a aspiração e transferidas para o laboratório em recipientes estéreis sobre gelo em até 30 minutos.
Tamanho da amostra: Um total de 6 doadores foram incluídos neste estudo, consistindo em 3 doadores mais jovens (idade: 27,00 ± 4,58 anos) e 3 doadores mais velhos (idade: 62,33 ± 4,04 anos).
Processamento de tecidos: Transfira fragmentos de tecido adiposo para um tubo cônico de 50 mL, centrifuge a 1.800 x g por 3 minutos a 4 °C e aspire cuidadosamente a fase oleosa superior (para remover o excesso de lipídios). Adicione 0,2% de colagênase Tipo IV (volume final: 5-10 mL por 1 g de tecido adiposo) ao pellet de tecido, depois coloque o tubo em um banho-maria ou incubadora a 37 °C por 45 minutos. Agite suavemente o tubo a cada 10-15 minutos durante a digestão para garantir um contato uniforme entre a colagênase e o tecido. Após a digestão, encerre a reação adicionando DMEM de baixa glicemia suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina (razão de volume entre meio neutralizante e solução de colagênase = 1:1).
ATENÇÃO: Ao manipular colagênase, use luvas descartáveis, jaleco e óculos de proteção para evitar contato visual com pele, prepare e use o reagente em um armário de segurança biológica (BSC) para evitar contaminação por aerossóis e, em caso de vazamento, limpe imediatamente com etanol 75% e descarte os materiais contaminados como resíduos biológicos.
Isolamento celular: Centrifuge a mistura de digestão neutralizada a 1.200 x g por 10 minutos a 4 °C para pelletar as células. Descarte o sobrenadante, depois ressuspenda o pellet em um tampão de lise de eritrócitos (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA; pH 7,4; volume: 2-3 mL por pellet) e incube em temperatura ambiente (22-25 °C) por 5 minutos para lisar os glóbulos vermelhos residuais. Filtre a suspensão celular sequencialmente através de peneiras de 200 μm para remover detritos de tecido não digeridos e obter uma suspensão de célula única.
Contagem de células: Antes da semeadura, o número de células foi quantificado usando um hemocitômetro. Resumidamente, os hADSCs foram destacados com 0,25% de tripsina-EDTA, ressuspensos em meio de crescimento e misturados 1:1 com solução de 0,4% de azul de tripano. As células viáveis (não coradas) foram contadas manualmente usando um hemocitometro de Neubauer sob microscópio óptico, e o número total de células viáveis foi calculado como: número de células/mL = (média de células contadas x fator de diluição x 104).
Cultura celular: Semeie as células filtradas com densidade de 5 x 103 células/cm2 em meio de crescimento (DMEM de baixa glicemia + 10% FBS + 1% penicilina/estreptomicina) e incube a 37 °C com 5% deCO-2. Substitua o meio a cada 2-3 dias para remover células não aderentes e manter condições ideais de cultivo. Todos os hADSCs usados em experimentos subsequentes — incluindo caracterização celular (detecção de marcadores de superfície, ensaios de diferenciação trilineage), estimulação DCEF, análise de migração e morfologia, ensaios de senescência/proliferação e sequenciamento de RNA — estavam na passagem 3 para a passagem 5.
Caracterização hADSC
Expressão de marcadores da superfície celular: Cultive células até 70% de confluência, depois dissocie as células aderentes com 0,25% de tripsina-EDTA (incube a 37 °C por 3 minutos). Centrifuge a suspensão da célula a 300 x g por 5 min a 4 °C, descarte o sobrenadante e resuspenda a célula em 1x PBS (volume: 1-2 mL). Aliquota 1 x 105 células por amostra (resuspensa em 100 μL de 1x PBS) e adicione anticorpos conjugados fluorescentes nas diluições especificadas: anti-CD44 (1:50), anti-CD90 (1:100), anti-CD29 (1:50), anti-CD73 (1:50) e anti-CD105 (1:20)1,4,7. Incube a mistura de anticorpos e células a 4 °C por 30 minutos no escuro para evitar a têmpera com fluoróforo. Após a incubação, centrifuge a 1.000 x g por 5 minutos a 4 °C e aspire completamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 1-2 mL de 1x PBS, centrifuge novamente a 1.000 x g por 3 minutos a 4 °C, descarte o sobrenadante e repita esse processo de lavagem duas vezes para remover os anticorpos não ligados. Por fim, resuspenda o pellet celular em 200 μL de PBS 1x fresco, adquira dados de fluorescência usando um citômetro de fluxo e realize uma análise quantitativa com o software FlowJo (v10). O fluxo de trabalho de gate seguiu procedimentos padrão de fenotipagem MSC: porta FSC-SSC para excluir detritos e selecionar a população celular principal com base no tamanho e granularidade, seguida por exclusão dupla, usando gráficos FSC-A vs. FSC-H e SSC-A vs. SSC-H para garantir eventos de célula única. Em seguida, foi realizado o gating de células vivas para excluir células mortas tripan-azul-positivas ou PI-positivas. O gating de fluorescência foi feito para controles com uma única coração, e controles não corados foram usados para definir limiares para CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 (marcadores positivos) e CD34, CD45 (marcadores negativos). Parcelas representativas de portão foram exportadas e analisadas para confirmar a identidade dos hADSCs.
Potencial de diferenciação
Diferenciação adipogênica: Colhe hADSCs da geração P3 a 85% de confluência usando 0,25% de tripsina-EDTA, depois semeie-os em placas de 24 poços com densidade de 1 x 10⁵ células por poço (usando meio DMEM completo) e incube a 37 °C com 5% deCO2 até que as células atinjam novamente 85% de confluência. Para indução, use o kit de diferenciação de adipogênese, reconstituindo o componente A do kit (indutor adipogênico) e o componente B (mantenedor adipogênico) conforme o manual, e use o componente A pelos primeiros 3 dias antes de mudar para o componente B por 1 dia. Repita esse ciclo por 3 semanas. Para a coloração, aspire o meio de indução, lave suavemente as células com 3 mL de 1x PBS (evite perturbar as camadas celulares), fixe as células com paraformaldeído (PFA) a 4% em temperatura ambiente por 20 minutos e depois incube com solução de óleo vermelho O a 0,3% (preparada em 60% de isopropanol) em temperatura ambiente por 15 minutos. Lave as células 3x com 1x PBS para remover o excesso de mancha, depois observe gotas lipídicas usando um microscópio de luz invertida (20x).
Diferenciação osteogênica: Seme hADSCs em placas de 12 poços com uma densidade de 1 x 10⁵ células por poço, e quando as células atingem 85% de confluência, use o kit de diferenciação osteogênese para indução — reconstitua o componente A do kit (indutor osteogênico) e componente B (suplemento osteogênico) em DMEM de baixa glicose (concentrações finais: 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, 0,1 μM dexametasona, 10 mM β-glicerofosfato, 0,05 mM de ácido ascórbico-2-fosfato) e renove o meio a cada 3 dias por 3 semanas. Para coloração, fixe as células com 4% de PFA em temperatura ambiente por 15 minutos, lave 3x com 1x PBS e depois incube com solução de Alizarina Vermelha S a 2% (pH 4,2, preparada em água desionizada) em temperatura ambiente por 30 minutos. Lave as células 3x com 1x PBS para remover a mancha não ligada, depois imageie os nódulos depositados em cálcio sob um microscópio de contraste de fase (20x) e quantifique a mineralização medindo a área dos nódulos S-positivos em Alizarina Vermelha usando o software ImageJ.
Diferenciação condrogênica: Centrifugar 250.000 hADSCs a 500 x g por 5 minutos a 4 °C em um tubo cônico de 15 mL para formar um pellet celular, adicionar 500 μL de meio DMEM completo ao tubo e incubar durante a noite a 37 °C com 5% deCO2 para estabilizar o pellet. No dia seguinte, use o kit de diferenciação de condrogênese para indução — reconstitua o componente A do kit (indutor condrogênico) em meio independente deCO2 (concentrações finais: 1% penicilina/estreptomicina, 10 ng/mL TGF-β3, 50 μg/mL ácido-2-fosfato ascórbico, 100 μg/mL piruvato de sódio) e refresce suavemente o meio a cada 3 dias (evitar perturbar o pellet). Após 3 semanas de indução, fixe o pellet celular com 4% de PFA em temperatura ambiente por 30 minutos, aspire o fixador, incube com solução de Azul de Toluidina Blue O a 0,1% (p/v) (preparada em 0,1 M de acetato de sódio, pH 4,0) em temperatura ambiente por 15 minutos, aspire a mancha, enxágue o pellet 3 vezes com água desionizada para remover o excesso de corante, depois, imageie sob um microscópio de campo claro (20x) e quantifique o acúmulo de proteoglicanos sulfados medindo a densidade óptica média (OD) da coloração com azul O de Toluidina usando o software ImageJ.
ATENÇÃO: Ao manusear 4% de PFA (um reagente tóxico e corrosivo), trabalhe exclusivamente em uma exaustão usando luvas descartáveis, jaleco e óculos de proteção para evitar inalação de vapor ou contato com pele e olhos — se ocorrer contato, enxágue imediatamente com água corrente por 15 minutos e procure atendimento médico. Para o descarte de resíduos perigosos, reúna materiais usados contaminados com PFA e PFA (por exemplo, pontas de pipeta, placas) em um recipiente dedicado para resíduos químicos rotulado como Resíduos PFA e descarte utilizando protocolos institucionais de resíduos perigosos, garantindo que não se misture com resíduos biológicos.
Montagem da câmara de eletrotáxia: Furar dois furos (0,75 cm de diâmetro) em extremidades opostas da linha central sobre uma tampa de placa de Petri de 10 cm, posicionada a 1 cm da borda do prato (para acomodar pontes de ágar-sal). Aplique uma fina camada de graxa a vácuo (≤ 2 cm de comprimento ≤ 1 cm de largura) na base da placa de Petri ao longo da linha central, a 4 cm de cada borda (Figura 1A). Usando pinças finas estériles, coloque uma capa de vidro estéril de 1 cm x 2 cm em cada remendo de gordura e pressione suavemente para garantir uma vedação estranha (evitar quebra da cobertura de cobertura; Figuras 1B-C). Aplique outra camada fina de graxa a vácuo sobre cada cobertura acoplada, depois coloque uma segunda camada de vidro estéril de 1 cm x 2 cm diretamente sobre a graxa para formar uma pilha de coberturas duplas. Pressione suavemente para garantir uma vedação estanqueada entre as duas coberturas (evitar vazamentos médios; Figura 1D). Ao longo da linha diagonal que conecta o canto superior esquerdo de uma pilha de cobertura à borda de antena mais próxima, e o canto inferior direito da pilha oposta à borda mais próxima, aplique graxa a vácuo para formar uma parede de barreira contínua. A parede deve estar firmemente colada ao fundo da travessa (sem folgas) e medir aproximadamente 2 cm de altura e 0,5 cm de largura (Figura 1E). Esterilize a câmara montada sob luz UV por 20 minutos (para eliminar contaminação microbiana), depois armazene em temperatura ambiente sob condições estéreis até o uso (Figura 1F).
Estimulação DCEF: Coloque lâminas de vidro estéreis (para semeadura celular) em uma placa de Petri de 10 cm e incube durante a noite a 37 °C com 5% deCO2 para pré-condicionar as lâminas (promover a adesão celular). Prepare a solução de Steinberg diluindo 10 mL de solução original 10x em 90 mL de ddH2O (estéril; concentrações finais: 58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca(NO3)24H2O, 0,83 mM MgSO47H2O, 10 mM HEPES; pH 7,4). Adicione 0,3 g de ágar a 20 mL da solução preparada de Steinberg, cozinhe no micro-ondas por 20 s até o ágar estar totalmente dissolvido e a solução transparente, depois imediatamente encha pontes de sal de vidro personalizadas com a mistura quente de ágar-Steinberg e deixe solidificar em temperatura ambiente. Após a solidificação, esterilize as pontes salinas sob luz UV por 15 minutos e esterilize dois béqueres (cada um contendo 30 mL de solução de Steinberg) sob luz UV por 15 minutos. Sementes hADCs da geração P3 nas lâminas estéreis pré-condicionadas a uma densidade de 2 x 10⁴ células/cm², incubam a 37 °C com 5% deCO2 por 24 horas para permitir a adesão celular, Em seguida, transferir as lâminas com semeadura de célula para a pista da câmara de eletrotáxia montada e fixá-las com lâminas laterais estéreis (para evitar movimento). Sele a pista colocando uma cobertura de vidro de 3 cm x 2 cm sobre a graxa a vácuo, pressionando suavemente para garantir uma vedação estanque, e aplicando graxa adicional ao longo das bordas da cobertura superior para formar uma barreira (evitar a evaporação média). Preencha os reservatórios da câmara com meio independente deCO2 (suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina; volume: 5-8 mL por reservatório), insira as pontes esterilizadas de sal de ágar pelos furos da tampa da placa de Petri (com uma extremidade imersa no reservatório de meio da câmara e a outra extremidade nos béqueres preenchidos com solução de Steinberg) e conecte os béqueres a uma fonte de alimentação por eletrodos de Ag/AgCl (para fornecer corrente contínua estável). Aplique um campo elétrico DC (DCEF) de 2 V/cm por 4 horas, monitore a tensão a cada 15 minutos usando um multímetro digital (ajuste se necessário para manter a intensidade constante do campo) e capture imagens em time-lapse da migração das células a cada 5 minutos em 4 campos aleatórios usando o software (modo objetivo 5x, campo claro).
NOTA: Ao usar equipamentos elétricos, certifique-se de que a fonte de alimentação e os eletrodos estejam secos e colocados sobre uma superfície não condutiva para evitar choques elétricos. Use luvas isolantes ao conectar ou desconectar eletrodos, desligue a energia antes de ajustar o sistema e, em caso de vazamento de meio em componentes elétricos, desligue a energia imediatamente e limpe com papel absorvente embebido em 75% de etanol. Neste estudo, ao minimizar a espessura da câmara de eletroforese e mantê-la em aproximadamente 1 mm, além de realizar medições de tensão multiponto em ambas as extremidades da câmara, a variação na intensidade do campo foi controlada dentro de 10%. Nessas condições, considera-se que a distribuição do campo elétrico dentro da área de cultivo é essencialmente uniformede 26.
Análise de migração e morfologia
Imagem ao vivo: Para hADSCs sob estimulação DCEF, importe as sequências de imagens em time-lapse (intervalos de 5 minutos) para o software ImageJ, acompanhe manualmente 100 células em 4 campos independentes do início (t=0) até o fim da estimulação (t=4 h) usando o plugin Manual Tracking, e calcule a velocidade média de migração (μm/min) e a direcionalidade (razão D/T, onde D = distância em linha reta do início ao fim, T = comprimento total do caminho) usando o plugin Chemotaxis Tool (ImageJ).
Rastreamento: Calcule os seguintes parâmetros de migração para quantificar o comportamento eletrotático: Direcionamento (Σcosθi/n, onde θi é o ângulo entre o vetor de deslocamento da célula e a direção do campo elétrico (EF), e n é o número total de células rastreadas, variando de -1 a 1 com valores mais próximos de 1 indicando uma migração mais forte direcionada ao ânodo), Distância Acumulada (comprimento total do caminho percorrido por cada célula durante o período de estimulação, em μm), Velocidade de Trilha (distância acumulada dividida pelo tempo de estimulação, em μm/h) e Distância Euclidiana (deslocamento em linha reta de cada célula de início a ponta, em μm, refletindo migração líquida).
Morphometria: Após a estimulação DCEF, fixe as células com 4% de PFA em temperatura ambiente por 20 minutos, lave 3x com 1x PBS, tinga o citoesqueleto com Phalloidin-TRITC (diluição 1:500 em 1x PBS; volume: 200 μL por poço para placas de 24 poços) em temperatura ambiente por 30 min (para marcar F-actina) e contra-colorir núcleos com DAPI (1 μg/mL em 1x PBS; volume: 100 μL por poço) por 5 minutos. As células foram fotografadas usando um microscópio de fluorescência com ampliação de 20x (com imagens representativas de alta resolução capturadas a 40x). A Phalloidin-TRITC foi visualizada usando um comprimento de onda de excitação de 540-555 nm e um comprimento de onda de emissão de 565-580 nm, enquanto o DAPI foi visualizado usando um comprimento de onda de excitação de 358-405 nm e um comprimento de onda de emissão de 420-480 nm. Em seguida, meça os seguintes parâmetros morfológicos na ImageJ: Eixo Longo (diâmetro máximo de Feret, a maior distância entre quaisquer dois pontos no perímetro da célula), Comprimento Vertical (largura da célula perpendicular ao eixo longo) e Verticalidade (sinα, onde α é o ângulo entre o eixo longo da célula e a direção da EF, com valores mais altos indicando maior alinhamento com a EF).
Ensaios de senescência e proliferação
Coloração SA-β-Gal: Use um kit de detecção de senescência para identificar células senescentes (células tingidas de azul) sob um microscópio de campo claro (objetivo 20x). Semente hADCs da geração P3 em placas de 6 poços com densidade de 2 x 105 células por poço, cultive até 80% de confluência, aspire o meio, lave suavemente as células 3x com 1x PBS, adicione 1 mL de Solução Fixativa (fornecida no kit) por poço e incube em temperatura ambiente por 15 minutos, lave as células 3x com 1x PBS para remover o fixador residual após a fixação, adicionar 0,5 mL de Solução de Trabalho de Coloração SA-β-gal (preparada misturando 50 μL de substrato SA-β-gal com 450 μL de tampão de coloração conforme o manual do kit) por poço, selar a placa com película transparente (para evitar evaporação), incubar durante a noite (16-18 h) a 37 °C (evitar exposição aoCO2 , pois altera o pH e inibe a atividade enzimática), capture imagens em campo claro de ≥10 campos aleatórios por poço (objetivo 10x) no dia seguinte, conte o número de células coloridas de azul (SA-β-gal+) e o total de células, e calcule a porcentagem de células senescentes como (Número de células SA-β-gal+ / Número total de células) x 100.
Imunocoloração Ki67
Após a coloração SA-β-gal, aspire a solução de coloração, lave as células 2x com 1x PBS, permeabilize as membranas celulares com 0,1% de Triton X-100 (preparado em 1x PBS; 1 mL por poço) em temperatura ambiente por 10 min, e bloqueie a ligação de anticorpos inespecíficos com 5% de BSA (em 1x PBS; 1 mL por poço) em temperatura ambiente por 1 hora. As células foram então incubadas com anticorpo primário Anti-Ki67 (diluição 1:200 em 1% de BSA/PBS; 500 μL por poço) a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, as células foram lavadas 3 vezes com 1x PBS (5 min cada), removendo o anticorpo primário não ligado e incubadas com anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 488 (diluição 1:500 em 1% BSA/PBS; 500 μL por poço) em temperatura ambiente por 1 hora no escuro. As células foram lavadas novamente 3x com 1x PBS e contra-coloridas com DAPI (1 μg/mL em 1x PBS; 200 μL por poço) por 5 minutos. Imagens de fluorescência foram capturadas usando um microscópio de fluorescência com ampliação de 20x (com imagens representativas de alta resolução adquiridas a 40x). Células Ki67+ marcadas com Alexa Fluor 488 foram visualizadas usando um comprimento de onda de excitação de 485-495 nm e um comprimento de onda de emissão de 515-545 nm, enquanto núcleos coloridos com DAPI foram fotografados usando um comprimento de onda de excitação de 358-405 nm e um comprimento de onda de emissão de 420-480 nm. A porcentagem de células proliferativas foi calculada como:(Número de células Ki67+ / Número de núcleos DAPI+ ) x 100.
NOTA: Ao manusear anticorpos primários e secundários, trabalhe em um BSC para evitar contaminação, aliquota os anticorpos em volumes descartáveis para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento e descongelamento, e colete materiais contaminados por anticorpos (por exemplo, pontas de pipeta, placas) em um saco dedicado autoclavável para resíduos biológicos para esterilização por autoclaving antes do descarte.
Análise de eletrotáxia dependente da idade dos hADSCs: Use uma fonte de alimentação de pulso DC para gerar DCEF de três intensidades: 0 mV/mm (controle), 100 mV/mm e 200 mV/mm, empregue uma estação de trabalho de célula viva para observar e registrar a migração celular em tempo real e, para cada intensidade de EF, compare quantitativamente a capacidade de migração anodal dos hADSCs de doadoras jovens e idosas medindo a Distância Acumulada, Distância Euclidiana, Velocidade de Trilha e Direcionamento, com três réplicas biológicas independentes por grupo para garantir a confiabilidade dos resultados. Os parâmetros de migração eletrotáctica foram quantificados usando os plugins Manual Tracking e Chemotaxis Tool no ImageJ (NIH). Células individuais foram acompanhadas manualmente durante todo o período de estimulação de 4 horas, e os seguintes parâmetros foram calculados de acordo com métodos padrão: Distância Acumulada: o comprimento total do caminho percorrido por cada célula durante o período de gravação. Distância Euclidiana: a distância em linha reta entre as posições inicial e final da célula. Velocidade da Trilha: distância acumulada dividida pelo tempo total de rastreamento (μm/h). Direcionamento: calculado como o cosseno médio do ângulo (θ) entre cada vetor de deslocamento e o vetor do campo elétrico (valores variam de -1 a 1; valores próximos de 1 indicam forte migração anodal).
Sequenciamento de RNA
Extração e preparação de RNA: Esterilize um recipiente cheio de gelo sob luz UV por 15 minutos (para manter a estabilidade do RNA) e realize todas as etapas seguintes no gelo. Transfira lâminas de vidro com semeadura de hADSC (1 cm x 2 cm) da câmara eletrotáxica para uma placa de Petri estéril, lave as células 3x com 3 mL de PBS gelado (adicione PBS suavemente, agite levemente e aspire completamente para remover o meio residual), depois adicione 1 mL de reagente TRIzol a cada lâmina e incube em temperatura ambiente por 20 minutos para lisar completamente as células (certifique-se de que o lisado cubra toda a camada celular). Transfira o lisado para um tubo centrífugo de 1,5 mL livre de RNase, adicione 0,2 mL de clorofórmio, faça vórtice vigorosamente por 15 s para induzir a separação de fases, incube o tubo no gelo por 15 minutos e depois centrifuge a 12.000 x g por 15 minutos a 4 °C. Isso separa o lisado em três camadas: fase aquosa superior contendo RNA, camada proteica intermediária e fase orgânica inferior. Transfira cuidadosamente a fase aquosa superior (≈ 0,5 mL) para um novo tubo livre de RNase (evite tocar a camada média), adicione 0,5 mL de isopropanol, faça um vórtice suave para precipitar RNA, incube no gelo por 10 minutos e depois centrifuge a 12.000 x g por 10 minutos a 4 °C; O RNA forma um pellet branco na parte inferior do tubo. Descarte o sobrenadante, repita a precipitação de isopropanol uma vez para melhorar a pureza do RNA, aspire completamente o sobrenadante, seco ao ar o pellet de RNA em um BSC em temperatura ambiente por 5-10 minutos (não seque demais, pois isso reduz a solubilidade), ressuspenda o pellet de RNA em 30 μL de água tratada com DEPC, incube a 55 °C por 10 minutos para auxiliar na dissolução, quantificar a pureza do RNA medindo a razão A260/A280 (alvo: 1,8-2,0) usando um espectrofotômetro, avaliar a integridade do RNA usando um nanochip de RNA; alvo: Número de Integridade do RNA [RIN] > 8,0, e armazenar amostras de RNA qualificadas a -80 °C até o sequenciamento.
ATENÇÃO: O Trizol e o clorofórmio são tóxicos, voláteis e cancerígenos, então manuse-os exclusivamente em exaustão enquanto use luvas de nitril, jaleco e óculos de segurança — evite inalar vapores, limpe com papel toalha e enxágue com sabão e água por 10 minutos se derramarem na pele, e não misture com água sanitária ou outros agentes oxidantes (pois isso pode produzir gases tóxicos). Para descarte de resíduos perigosos relacionados à extração de RNA, colete misturas, supernadantes de isopropanol e tubos contaminados em um recipiente selado e quimicamente resistente rotulado com resíduos de RNA (não misture com resíduos aquosos ou biológicos) e descarte seguindo os protocolos institucionais de resíduos perigosos, garantindo que não se despeje pelos drenos.
Pré-processamento de dados e controle de qualidade: Prepare bibliotecas de sequenciamento usando o Kit de Preparação da Biblioteca VAHTS mRNA-seq seguindo o protocolo do fabricante — enriquecer mRNA usando esferas magnéticas oligo(dT), fragmentar mRNA em fragmentos de 200-300 bp usando cátions divalentes, sintetizar cDNA de primeira fita usando hexameros aleatórios seguidos por cDNA de segunda fita, realizar reparo de extremidade, adicionar caudas A, ligar adaptadores de sequenciamento, amplificar bibliotecas por PCR e purificar usando esferas. Sequenciar as bibliotecas em uma plataforma de sequenciamento (leituras emparelhadas de 150 bp), gerando aproximadamente 50 milhões de leituras brutas por amostra, depois usar um software para cortar leituras de baixa qualidade (remover leituras com >50% de bases com pontuação de qualidade Phred <20) e sequências adaptadoras, mantendo aproximadamente 48 milhões de leituras limpas por amostra (Q30 > 90%) para análise a jusante após o corte.
Análise de bioinformática: Alinhar as leituras limpas ao genoma de referência humano (GRCh38/hg38) usando o software Hisat2 v2.2.1 e salvar os resultados do alinhamento como arquivos BAM, usar o software htseq-count v0.13.5 para contar o número de leituras mapeadas para cada gene (com base nas anotações do gene Ensembl), normalizar os dados de contagem de genes usando a função estimateSizeFactors do pacote DESeq (2012) R para eliminar efeitos de lote e diferenças na profundidade do sequenciamento, e realizar análise de expressão diferencial usando a função nbinomTest (pacote DESeq), selecionando genes diferencialmente expressos (DEGs) usando limiares de mudança de dobra (FC) > 2 e o valor p ajustado (padj) < 0,05. Realizar análises de enriquecimento por Ontologia Gênica (GO) (processo biológico, função molecular, componente celular) e análise de enriquecimento de vias da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) em DEGs usando o pacote clusterProfiler v4.0 R, focando em enriquecimentos relacionados à migração celular (por exemplo, adesão celular, migração celular), transporte de íons (por exemplo, transporte transmembranar de íons de sódio) e vias de sinal (por exemplo, via de sinalização PI3K-Akt). Realize agrupamento hierárquico não supervisionado em DEGs usando o pacote pheatmap v1.0.12 R e visualize padrões de expressão gênica entre amostras com um mapa de calor (escores z em escala de linhas).
Análise estatística: Todos os dados experimentais são apresentados como Erro Médio ± Padrão da Média (Média ± SEM), com pelo menos 3 réplicas biológicas independentes por grupo (n ≥ 3). Use o teste t de Student para comparar diferenças entre dois grupos (por exemplo, doadores jovens vs. idosos) e a Análise de Variância unidirecional (ANOVA), seguida pelo teste pós-hoc de Tukey para comparar diferenças entre três ou mais grupos (por exemplo, diferentes intensidades de EF), realizando análises estatísticas usando o software SPSS 23.0 e definindo significância estatística da seguinte forma: *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001.
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A aplicação de campos elétricos orienta a migração direcional dos hADSCs e aumenta sua capacidade migratória
Os hADSCs extraídos apresentaram marcadores típicos de superfície de células-tronco mesenquimatosas (por exemplo, CD29, CD44, CD90, CD73, CD105) e possuíam potencial de diferenciação trilineagem (adipogênico, osteogênico, condrogênico; Figura 2A), atendendo aos critérios padrão para identificação do hADSC. Aplicamos campos elétricos de corrente contínua (DCEFs) em ...
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No início do processo de reparação e regeneração de lesões teciduais, os campos elétricos surgem como um dos primeiros sinais físicos estabelecidos no microambiente. Suas propriedades direcionais estão correlacionadas espaço-temporalmente com o recrutamento de células para o localde lesão 27. Campos elétricos endógenos originam-se do potencial transepitelial gerado pelo transporte de íons polarizados nos tecidos epiteliais. Quando a barreira epitelial é interrompi...
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Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.
Agradecemos sinceramente ao Departamento de Cirurgia Plástica do Primeiro Hospital Afiliado da China Medical University (Shenyang, China) e ao Instituto de Curas Regenerativas da Universidade da Califórnia, Davis (CA, EUA) pelo fornecimento de infraestrutura experimental crítica e recursos compartilhados de pesquisa que possibilitaram este estudo. Também agradecemos à Shanghai OE Biotech Co., Ltd. pelo suporte técnico em sequenciamento de RNA e análise bioinformática.
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 4° C/-20° C/-80° C Geladeira | Haier, China | HYC-390/DW-25L262/DW-86L728J | |
| Agar | HUSHI, China | 10000561 | |
| Bioanalisador Agilent 2100 | Agilent Technologies, Estados Unidos | G2939BA | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, Estados Unidos | A5533 | |
| Gabinete de Biossegurança & nbsp; | Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos | 1300 A2 1,5 m | |
| CaNO3· 4H2O | HUSHI, China | 10013960 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos | X4R Pro & nbsp; | |
| Incubadora CO2 | Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos | Forma Steri-Cycle 3307 | |
| Colanase Tipo IV | Biosharp, China & nbsp; | BS076 | |
| Microscópio Confocal | ZEISS, Alemanha | LSM 900 | |
| Fonte de Alimentação por Pulso DC | Daedo Powertronics, Coreia | DDP-500 | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich, Estados Unidos | D4902 | |
| Multímetro Digital | Fluke, Estados Unidos | FLUKE-175 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, Estados Unidos | D2650 | |
| Balanço Eletrônico | Sartorius, Alemanha & nbsp; | BSA224S-CW | |
| FBS | Gibco, Estados Unidos | 10270-106 | |
| Citômetro de Fluxo | Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos | A24858 | |
| IBMX (1-Metil-3-isobutilxantina) | Sigma-Aldrich, Estados Unidos | I7018 | |
| Indometacina | Sigma-Aldrich, Estados Unidos | I7378 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich, Estados Unidos | I5500 | |
| Microscópio Invertido | ZEISS, Alemanha | Axio Observer 7 / ACR | |
| ITS-G | Sigma-Aldrich, Estados Unidos | I3146 | |
| KCl | HUSHI, China | 10019318 | |
| KH2PO4 | HUSHI, China | 10019320 | |
| Ácido Linoleico | Sigma-Aldrich, Estados Unidos | L1376 | |
| Estação de Celular ao Vivo | Live Cell Instrument, Coreia | Chamlide TC | |
| DMEM de baixa glicose | Gibco, Estados Unidos | 11885084 | |
| MgSO4· 7H2O | HUSHI, China | 10019322 | |
| Na2HPO4· 12H2O | HUSHI, China | 10019324 | |
| NaCl | HUSHI, China | 10019318 | |
| Espectrofotômetro NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos | ND-2000 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich, Estados Unidos | O0625 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco, Estados Unidos | 15140122 | |
| Pipetas | Eppendorf, Alemanha & nbsp; | 4920000061 | |
| SYBR Premix EX Taq | Takara, China & nbsp; | RR420A | |
| Toluidina Blue O | Sigma-Aldrich, Estados Unidos | T3260 | |
| Tris | HUSHI, China | 10019326 | |
| Trizol | Beyotime, China | R0016 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco, Estados Unidos | 25200056 | |
| Microscópio Vertical | ZEISS, Alemanha | 415200-0000-000 | |
| Graxa a vácuo | DOW CORNING, Estados Unidos | 1597418 | |
| Vitamina C & nbsp; | Sigma-Aldrich, Estados Unidos | A4544 | |
| Sistema de Purificação de Água | Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos | GenPure xCAD Plus UF-TOC | |
| β-Glicerofosfato | Sigma-Aldrich, Estados Unidos | G9422 |
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