Validação do Sistema de Pressão Hiperbárica com Anestesia Xenônica para Drosophila melanogaster

Resumo

Gases que parecem inofensivos à pressão atmosférica podem induzir comportamentos como narcose sob condições hiperbáricas. Câmaras de pressão hiperbáricas convencionais são caras e demandam muito trabalho. Este estudo apresenta um método simples e de baixo custo para examinar os efeitos do xenônio sobre Drosophila melanogaster em pressões moderadas abaixo de 4 atm.

Resumo

Sob condições hiperbáricas, as concentrações elevadas dos gases ambientes podem provocar uma variedade de respostas comportamentais em vários animais. Uma parte substancial desses comportamentos representa mudanças em estados cognitivos que ainda são pouco compreendidos. Um exemplo notável é a anestesia geral. O efeito comportamental de vários gases sob condições hiperbáricas na anestesia geral, ou narcose, tem sido uma investigação científica duradoura, apesar do uso extremamente frequente desses medicamentos na medicina. O xenônim, classificado como gás nobre e agente anestésico, é considerado uma das opções mais seguras para anestesia geral em humanos. No entanto, não anestesia moscas em condições normobárias. Aqui, estabelecemos um sistema experimental simples que aumenta a pressão ambiente até ~3 atm e permite o estudo da anestesia com xenônio em um dos organismos modelo mais populares, Drosophila melanogaster. Esse sistema experimental facilita ainda mais o estudo de outros gases e seus efeitos sob condições hiperbáricas.

Introdução

Os dois extremos extremos dos efeitos comportamentais observados em animais sob condições hiperbáricas são a convulsão por oxigênio e a narcose por^{nitrogênio 1,2}. Curiosamente, comprometidos cognitivos como alucinações e perda de memória foram relatados com nitrogênio e hidrogênio em valores de pressão anteriores ao nível de inconsciência ^3,4. Anestesia induzida por xenônio, criptônio e óxido nitroso em condições hiperbáricas foi relatada antes^{do 5,6}.

A anestesia geral é tanto um pilar da medicina quanto um fenômeno de considerável interesse científico. Apesar de seu uso longo e generalizado, nosso entendimento permanece limitado sobre como exatamente alguns compostos químicos induzem a ausência temporária de movimento, memória, dor e^{consciência 7}. Xenon, sendo um gás nobre, poderia ser designado como o membro mais peculiar entre os agentes anestésicos. É considerada uma opção segura para anestesia, oferecendo indução e recuperação rápidas, distúrbios fisiológicos mínimos e apenas efeitos colaterais leves, como náusea^{pós-operatória 8,9}.

Dada a importância médica da anestesia e as propriedades químicas incomuns do xenônio, este estudo tem como objetivo investigar a anestesia induzida pelo xenônio utilizando o modelo animal simples Drosophila melanogaster. Diversos estudos de pesquisa foram realizados usando moscas-das-frutas para estudar anestesia geral, com muitos métodos propostos e o uso de diversos anestésicos^voláteis 10,11,12,13. No entanto, não houve relatos de anestesia com xenônio em Drosophila. Em condições normobárias, o xenônio não induz anestesia em Drosophila melanogaster, comumente conhecida como moscas-das-frutas. Para enfrentar essa limitação, este estudo oferece um sistema hiperbárico que permite a manipulação controlada da pressão ambiente entre 1 atm e aproximadamente 4 atm. Houve vários estudos usando câmaras hiperbáricas para responder a curiosidades^{semelhantes 14,15}. No entanto, a maioria das câmaras hiperbáricas comerciais se beneficia de materiais resistentes e à prova de vazamentos, mas possuem um volume elevado (~3 L) e são sistematicamente complicadas de operar e caras. Em vez disso, o método descrito neste artigo é simples e barato, permitindo a exploração dos efeitos de vários gases e suas combinações. Ele oferece um ambiente adequado para modelos animais pequenos como D. melanogaster e C. elegans.

Protocolo

1. Preparação de Drosophila melanogaster

1. Colete 20 fêmeas e 20 machos de 1 a 3 dias para cada experimento usando CO₂.
2. Descanse as moscas selecionadas em um frasco com alimento por pelo menos 24 horas antes do experimento, a uma temperatura de ~22 °C.

2. Administração anestésica

1. Transfira os gases dos cilindros de gás dos recipientes para os sacos de gás à prova de vazamentos para uso experimental. Para a transferência direta de gás do recipiente para os sacos, use tubos de silicone.
2. Anexe um tubo de silicone de 25 mm (3,4 mm de diâmetro) à seringa de polipropileno. Depois, conecte a seringa de polipropileno aos sacos de gás e à torneira de três vias. Para maior clareza, a seringa de polipropileno será chamada de seringa #1 no restante do texto.

3. Montagem da configuração hiperbárica (Figura 1)

1. Posicione a mesa de luz LED em orientação paisagem sobre a mesa (borda longa horizontal em relação à superfície da mesa).
2. Coloque a bomba de injeção ao lado de um dos lados curtos da mesa de LED, garantindo que a orientação da bomba permita que a seringa experimental se estenda acima da luz de fundo.
3. Localize a câmera acima do sistema para cobrir a região onde a seringa experimental está localizada.
4. Corte um tubo de silício de 75 mm de comprimento (3,4 mm de diâmetro). Conecte a torneira de três vias ao manômetro usando o tubo de silicone do bico central.
5. Use grampos de mola de mangueira no bico do lado do manômetro e da torneira de três direções para garantir que o tubo esteja apertado.
6. Usando o botão marcado por uma seta dupla na unidade de controle da bomba de injeção, ajuste a velocidade para 80 mm/m e a duração para 38 s para a compressão ou descompressão automática do êmbolo.

4. Procedimento para anestesia com xenônio

1. Limite a luz ambiente na sala de experimentos, ligue a mesa de luz de LED e ajuste o brilho no nível 3. Isso ajuda a aumentar o contraste no vídeo.
2. Remova o êmbolo da seringa de policarbonato. Insira uma pequena quantidade de algodão no bico da seringa para evitar que moscas escapem. Para maior clareza, a seringa de policarbonato será chamada de seringa #2 no restante do texto.
3. Para transferir 40 moscas do frasco para a seringa #2, primeiro retire a tampa do frasco e coloque o barril da seringa verticalmente sobre o frasco. A flange do cano deve se fundir com o topo do frasco para permitir que as moscas entrem no cano da seringa. Gire a estrutura 180° e bata com um toque. Isso coloca as moscas no fundo do cano da seringa. Coloque o desentupidor de volta. Coloque a seringa com as moscas dentro da bomba de injeção.
4. Oriente as marcas do cano da seringa na lateral para uma melhor visão das moscas do ponto de vista da câmera.
5. Fixe a seringa do cano e da cabeça do êmbolo à bomba de injeção usando parafusos ajustáveis.
6. Remova o algodão da ponta da seringa #2 e conecte-a com a torneira de três vias.
7. Comece a gravação do vídeo. Ligue o manômetro. Gire a torneira para conectar o manômetro à seringa #2 e confirme pressão de 0 kPa na seringa usando o manômetro.
8. Vire a derivação de três vias para a posição lateral para permitir a troca de ar com a seringa antes do experimento.
9. Mova o êmbolo da marca de 20 para 2 mL pela opção de controle manual da bomba de injeção, que foi projetada para facilitar a opção mais rápida.
10. Aspire 18 mL do gás anestésico do saco de gás para a seringa #1. Conecte a seringa #1 com a saída de três vias da porta lateral de trava do luer. Para avaliar o volume correto, 18 mL de gás anestésico em uma quantidade total de 20 mL de mistura forneceriam 90% da porcentagem de gás. Isso pode ser alterado de acordo com a porcentagem final de gás desejada.
11. Mova o êmbolo de volta para a linha de 20 mL pela opção manual da bomba de injeção.
12. Gire a torneira para conectar o manômetro à seringa #2. Normalmente, o manômetro mostra pressão de ~-3 kPa após o enchimento do anestésico.
13. Mova o êmbolo automaticamente, com as configurações de velocidade e tempo definidas para 80 mm/s e 38 s. Espera-se que a bomba atinja 5 mL de barra do cano em 38 s. Quando o êmbolo para, a pressão máxima deve ser de ~200 kPa.
14. Deixe o êmbolo na posição de 5 mL por 20 segundos. Note a pressão máxima.
15. Bata na seringa para desalojar quaisquer moscas que estejam presas ao êmbolo, fazendo-as repousar imóveis no fundo.
16. Inicie a descompressão automática ao final de 20 segundos. Encerre o experimento quando o êmbolo voltar para a barra de 20 mL. Note a pressão final para o controle de vazamento.

5. Análise de dados

NOTA: Neste experimento, a emergência anestésica foi usada como ponto final. Os movimentos da mosca foram quantificados desde o início da descompressão do êmbolo. Dois métodos de análise diferentes foram desenvolvidos: análise de pixels e rastreamento de moscas. Cada método de análise tinha suas desvanências, que são comunicadas na discussão.

1. Análise de pixels
   1. Use o ScreenFlow para editar os vídeos. Recorte cada vídeo para a região de interesse (ROI), ou seja, os primeiros 5 mL do cano da seringa.
   2. Corte o vídeo para os primeiros 20 segundos após a descompressão da seringa. Exporte os vídeos editados como GIFs. Duplique o GIF.
   3. Usando Fiji, remova o primeiro quadro de um duplicado e remova o último quadro do outro duplicado. Para isso, selecione Edição de Imagem > Vídeo > Excluir Quadros.
   4. Faça cada GIF binário em Fiji para que as moscas apareçam brancas sobre um fundo preto. Para isso, selecione Processo > Binário > Tornar binário.
   5. Abra ambos os GIFs em Fiji. Calcule a diferença de pixels entre os GIFs. Para isso, selecione Processar > Calculadora de Imagem. Essa operação criará um GIF com diferença de pixels.
   6. Salve o GIF da diferença de pixels. Analise a partícula nos diferentes GIFs. Para isso, selecione Analisar > Analisar partículas em Fiji. Ajuste os limiares de tamanho dos pixels para aumentar a relação sinal-ruído.
   7. Após analisar partículas, Fiji gera um CSV com diferenças de pixel por quadro. Guarde o CSV. Dados CSV podem ser usados para plotar o movimento por quadro. Use o movimento cumulativo através dos quadros para atribuir diferenças estatísticas entre os experimentos.
2. Rastreamento de moscas
   NOTA: Para o método de rastreamento de moscas, a tecnologia de IA foi utilizada para detectar e rastrear o centro de massa de cada mosca nos vídeos do experimento. Dois modelos foram combinados para isso: YOLO (You Only Look Once) para detecção e MASA (Matching Anything by Segmenting Anything) para rastreamento. Os modelos foram executados no Google Colab usando uma GPU Tesla T4.
   1. Instale a biblioteca Ultralytics YOLO no Colab e depois carregue o modelo yolo11n.pt. Use o CVAT (Computer Vision Annotation Tool) para anotar moscas em quadros extraídos dos vídeos, depois exporte o conjunto de dados no formato YOLO para treinamento. Procedimentos detalhados de instalação e treinamento são descritos no repositório online.
   2. Instale o repositório MASA no Google Colab e incorpore um filtro de Kalman para realizar o rastreamento de objetos entre quadros consecutivos. Integre o modelo treinado de detecção YOLO com o framework de rastreamento MASA.
   3. Use o FixTrack para revisar manualmente os tracklets gerados pelo pipeline combinado MASA+YOLO. Identifique e junte trilhos fragmentados incorretamente ou corrija descompassos de identidade para obter trajetórias contínuas para moscas individuais. Procedimentos detalhados de instalação e treinamento são descritos no repositório FixTrack.

Resultados

O método descrito neste artigo permite o monitoramento tanto do tempo quanto da extensão da atividade locomotora em moscas sob condições hiperbáricas. Essa configuração permite que gases como xenônio e óxido nitroso, que não possuem propriedades anestésicas em condições normais, produzam anestesia em Drosophila melanogaster. Para demonstrar isso, experimentamos diferentes concentrações de xenônio e ar. Começamos a estabelecer o processo com 90% xenônio e 10% ar. Depois, demonstr...

Discussão

Essa configuração simples e de baixo custo torna os ensaios comportamentais hiperbáricos em Drosophila amplamente acessíveis, possibilitando experimentos rápidos e reproduzíveis sem vasos de pressão especializados. No entanto, apresenta algumas limitações. Um dos seus compromissos importantes é a pressão máxima mais baixa em relação aos sistemas existentes. A pressão máxima que podemos induzir com esse sistema é ~4 atm, enquanto vasos de pressão usados para Drosophila c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sacos herméticos de gás (0,5 L)	Techinstro	7440440
Câmera	Maçã	iPhone 15
Braçadeiras de mangueira de mola com fio duplo	Mapa de Fontes	a24120200ux2109
Mistura alimentar para Drosophila	Manejo Avançado	DM900
Drosophila melanogaster	Darwin Biological	LZ-210
Tubo de injeção	Aitoserlea	B09M8G5BQ8
Mesa de luz LED	Lairi	M1-3878368
Manômetro	Dwyeromega	477AV-8
Torneira de parada metálica de três vias com porca de compressão	Sigma Aldrich & nbsp;	Z182184
Seringa de policarbonato (20 mL)	DMC Medical	FD-1031NS
Seringa de polipropileno (20 mL)	BD	301031
Tubo de silicone
Gás Xenônio	Gases Industriais Chengdu Taiyu