Transformação Eficiente Baseada em Regeneração Mediada por Agrobactérias de uma Espécie Assexuada de Brassicáceas, Rorippa aquatica

Resumo

Apresentamos um protocolo eficiente e otimizado para a transformação mediada por Agrobacterium de uma espécie anfíbia assexuada de Brassicaceae, Rorippa aquatica, sem procedimentos intensivos em recursos de cultura de tecidos estéreis. Utilizando um marcador visual de transformação e um oleoduto de regeneração de brotos, geraram com sucesso transformantes quase clonais, avançando assim os estudos futuros sobre a adaptação das plantas ao ambiente subaquático.

Resumo

A transformação genética estável das plantas mediada pelo Agrobacterium tumefaciens tem sido uma ferramenta poderosa para pesquisas fundamentais em biologia vegetal, bem como para biotecnologias vegetais que impactam diretamente a melhoria das culturas. Pipelines simples e eficazes de transformação, como o método de mergulho floral para Arabidopsis, avançaram drasticamente as análises em larga escala da função gênica. No entanto, tal pipeline não pode ser aplicado a espécies de plantas que não passam por reprodução sexual. Rorippa aquatica é uma espécie modelo anfíbia emergente de Brassicaceae que apresenta heterofilia e mudanças drásticas na forma das folhas e das plantas em ambientes terrestres ou subaquáticos. R. aquatica se propaga exclusivamente vegetativamente. O pipeline otimizado apresentado aqui proporciona uma transformação eficiente e confiável mediada por Agrobacterium, com R. aquatica, que não requer cultura de tecidos estériles. Estacas foliares são brevemente imersas em Agrobacterium suspenso em um tampão de transformação contendo um vetor binário que expressa um marcador visual, RUBY, sob o promotor constitutivo. Subsequentemente, os inoculantes são cultivados em um papel filtrante embebido em água em uma câmara de crescimento. Em seguida, plantas regeneradoras com pigmentação vermelha RUBI são separadas e plantadas em vasos no solo. Esses regenerantes T1 iniciais (R1-T1) expressam setores vermelhos. Ao cortar o setor vermelho e repetir as etapas de regeneração, um grande número de irmãos transgênicos é produzido na próxima geração R2-T1, alguns dos quais são quase uniformemente vermelhos; indicativo da expressão RUBY. Esse pipeline simples de transformação pode ser adotado para R. aquatica e possivelmente outras espécies vegetativas de propagação para introduzir genes de interesse e investigar suas funções na adaptação ao terrestre vs. ambientes aquáticos.

Introdução

A transformação genética estável, ou seja, a introdução e expressão de genes de interesse para uma determinada espécie vegetal, é central para a ciência básica das plantas e para a biotecnologia vegetal. A transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens é, de longe, o meio mais amplamente utilizado de engenharia genética vegetal para sua geração confiável de transformantes^{estáveis 1}. O desenvolvimento de um sistema vetor binário, no qual o vetor clonador de T-DNA e o plasmídeo auxiliar de vir desarmado são separados em duas entidades, revolucionou a transformação mediada por Agrobacterium ^1,2. Para a planta-modelo Arabidopsis thaliana, um procedimento simples e econômico de transformação por imersão floral permitiu a geração de transformantes clonais (hemizigóticos) de alto rendimento para genética funcional e^{genômica 3,4}. No entanto, tal abordagem não é viável para espécies de plantas que se propagam predominantemente ou exclusivamente vegetativamente.

Plantas anfíbias exibem uma capacidade única de prosperar tanto em ambientes terrestres quanto aquáticos^{(subaquáticos) 5}. Rorippa aquatica é uma espécie anfíbia de Brassicaceae que apresenta heterofilia. Em ambiente terrestre, R. aquatica desenvolve folhas arredondadas com epiderme composta por células do pavimento e estomas. Em contraste, suas folhas aquáticas exibem morfologias bem adaptadas ao ambiente subaquático: folhas altamente dissecadas em forma de agulha, com epiderme desprovida de células cuticulares do pavimento ou estomas ^6,7. Filogeneticamente, R. aquatica é intimamente relacionada a Arabidopsis thaliana; ambos pertencem à mesma família,^{Brassicaceae 6}. Juntamente com a disponibilidade de dados de sequência genômica completa e a alta conservação de sequências de genes codificantes entre R. aquatica e A. thaliana, R. aquatica serve como uma planta modelo anfíbia emergente para estudar a base molecular da adaptação à terra e^{à água 8}. De fato, estudos fisiológicos e de expressão gênica recentes sugerem que a reprogramação das vias de sinalização da luz e dos hormônios é fundamental para a heterofilia de R. aquatica ^7,8.

Para testar as funções moleculares dos genes e vias candidatos, a transformação genética é absolutamente essencial. R. aquatica se propaga vegetativamente na^{natureza 8,9}. Portanto, ao contrário de A. thaliana, a transformação de mergulho floral de Agrobacterium não pode ser aplicada à R. aquatica. Notavelmente, R. aquatica regenera facilmente plantas inteiras a partir de folhas descoladas sem suplementação exógena de fitohormônios^. Brevemente, poucos dias após o descolamento do segmento foliar, a proliferação celular torna-se ativa no tecido vascular na extremidade proximal da superfície cortada. Em uma semana, tanto as raízes quanto os brotos se regeneram, produzindo eventualmente jovens plantas (rosetas de roseta). Plantas individuais podem ser separadas e cultivadas até a^{maturidade 10}. Esse processo espontâneo de regeneração completa das plantas pode ser facilmente utilizado para uma transformação genética de R. aquatica.

O pipeline otimizado relatado aqui permite uma transformação eficiente e confiável mediada por Agrobacterium da R. aquatica, aproveitando sua capacidade de regeneração espontânea após o descolamento da folha. Para uma seleção fácil de transformantes, sem a necessidade de processos de cultura estéreis caros, foi adotado um marcador de seleção visual não invasivo, o RUBY, um vetor sintético com três genes que levou à biossíntese da^{betalaína 11}. Ao otimizar as condições de cultura bacteriana, as etapas de inoculação e os processos de incubação de estacas para regeneração, plantas transgênicas de R. aquatica foram produzidas até a maturidade de forma confiável. Quase todos os transformantes iniciais na geração R1-T1 exibem setores vermelhos, indicando que são mosaicos genéticos heterogêneos. Ao cortar os setores de folhas vermelhas RUBY+ e repetir os processos de regeneração, é possível gerar transformantes R. aquatica inteiramente vermelhos, portanto quase clonais, na geração subsequente R2-T1. Esse pipeline de transformação pode ser facilmente aplicado para introduzir/expressar genes estrangeiros de interesse em R. aquatica, acelerando assim os estudos genéticos moleculares da heterofilia e adaptação das plantas a ambientes extremos.

Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de materiais vegetais

1. Retirar e cortar folhas saudáveis, totalmente lobadas e saudáveis, em pedaços de 1-2 cm de plantas-mãe maduras de dois meses (Figura 1A).
2. Forre uma bandeja de propagação de plantas (Bandejas de Ninho Perma de 20 x 30 cm) com duas camadas de papel toalha dobradas autoclavadas. Enchumeça as toalhas de papel com água estéril, para que fique uma camada fina de água por cima.
3. Coloque as estacas com o lado adaxial para cima, com espaço ao redor de cada explante para evitar sobreposições (Figura 1A).
4. Borrife levemente os cortes e cubra bem a bandeja com filme plástico.
5. Coloque as bandejas na câmara de crescimento entre 25 °C-28 °C, com 16 horas de luz e 8 horas de período escuro sob condições úmidas e uma intensidade luminosa de 50 μmol/^{m 2}/s.
6. Inspecione e mantenha bandejas de propagação limpas e úmidas 2-3 vezes por semana.
   1. Adicione água estéril para manter uma camada fina de água sobre as toalhas de papel saturadas.
   2. Substitua o filme plástico que perdeu aderência e/ou apresenta sinais de contaminação (por exemplo, turbidez visível da água).
7. Utilizando microtesouras ou bisturis, extire cuidadosamente plantas individuais saudáveis e regeneradas que produzam tanto um broto quanto uma raiz entre 14 e 21 dias após o estabelecimento (Figura 1B).
   NOTA: É necessária uma excisão cuidadosa para obter uma única planta roseta com o broto e a raiz intactos. As plantas rosetas de Rorippa proliferam densamente ao longo da interseção da explantação da folha com a nervura central, dificultando a identificação de plantas individuais da roseta. O broto de uma planta roseta cresce de forma adaxial, enquanto raízes crescem sob a superfície da folha, dificultando a visibilidade de toda a planta roseta (Figura 1B).
8. Transplante plantas individuais de rosetas em vasos contendo um substrato úmido (proporção 2:1:1 de substrato para vasos: Vermilculita: Perlita) suplementado com um fertilizante de liberação lenta (Figura 1B).
9. Água com água da torneira emendada com 0,25 g/L de fertilizante NPK granulado e cubra com uma cúpula de umidade ou filme plástico para manter as condições úmidas.
10. Coloque as bandejas na câmara de crescimento sob condições prévias (25 °C-28 °C com 16 horas de luz e 8 horas de período escuro em condições úmidas e intensidade luminosa de 50 μmol/^{m 2}/s)
    NOTA: É fundamental preservar as condições úmidas do solo. Mantenha uma camada fina de água sob os transplantes em vasos.

2. Culturas agrobacterium para transformação

1. A cepa Streak A. tumefaciens GV3101 que abriga o Ti-plasmídeo pMP90 (pTiC58DT-DNA) que contém o vetor RUBI em uma placa de 30 mL LB contendo rifampicina (0,03 mg/mL), gentamicina (0,025 mg/mL) e espectromicina (0,05 mg/mL), e cresce a 28° C por 48-72 horas até que colônias individuais fiquem evidentes.
2. Selecione uma única colônia e inocule 5 mL de caldo MG/L emendado com biotina e antibióticos seletivos prévios (Tabela 1) e incube em um shaker rotativo de 28 °C a 200 rpm por 16 horas.
3. Transfira o inóculo para um frasco cônico com 250 MG/L de caldo e incube em um shaker rotativo de 28 °C a 200 rpm por 16 horas.
4. Certifique-se de que a cultura líquida tenha um OD mínimo de₆₀₀ de 1,2 usando um espectrofotômetro. Faça pellets sobre as bactérias por centrifugação a 3396 x g por 10 minutos em temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C). Altere o caldo do inóculo com 200 μM de Acetosiringona (AS).
   NOTA: Aliquotas de AS filtro-estéril são preparadas em DMSO a uma concentração de trabalho de 100 mM e armazenadas a -20 °C. O caldo de inóculo deve ser feito fresco. O AS é adicionado diretamente antes da etapa de centrifugação para minimizar a degradação. Descrições e componentes da mídia estão listados na Tabela 1.
5. Evitando a perturbação direta do pellet bacteriano, descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet no caldo do inoculo.
6. Gire o frasco manualmente para que a solução tenha um OD₆₀₀ de aproximadamente 0,8.
7. Incube o inoculo em um shaker a 90 rpm por 2,5 horas em temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C).
8. Registrar condições pertinentes (Cultura e Inóculo OD₆₀₀, concentração de AS e quantidade de surfactante, período de inoculação e número de unidades experimentais necessárias para eficiência de transformação.
   NOTA: Concentrações ótimas de bactérias e culturas em ressuspension são essenciais para maximizar a eficiência da transformação, minimizando o crescimento excessivo de bactérias. Antes da centrifugação, certifique-se de que a cultura bacteriana tenha um OD600 mínimo de 1,2; resuspender para um inóculo OD600 de 0,8. Emendas ao caldo de indução são otimizadas para melhorar a transformação sem comprometer a viabilidade do regenerante. As concentrações recomendadas são de 150-225 μM para AS e 0,005% para surfactante.
   ATENÇÃO: Descarte todas as bactérias e plantas transgênicas em recipientes designados para resíduos bio-perigosos.

3. Transformação das estacas de folhas de R. aquatica

1. Enquanto a cultura de resssolução do inóculo passa pela incubação, selecione várias plantas de 2 meses que exibam folhas saudáveis com margens inteiras.
2. Prepare uma bandeja de propagação de plantas (Bandejas de Ninho Perma de 20 x 30 cm) com 2 camadas de papel toalha autoclavada. Dobre toalhas de papel. Enchumeça as toalhas de papel com água estéril, para que fique uma camada fina de água por cima.
   NOTA: Estabeleça uma bandeja de controle negativo na qual explantações não inoculadas passam por condições ambientais idênticas.
3. Certifique-se de que a bancada de laboratório esteja equipada com recipientes estéreis de 100-500 mL_{ddH 2}O, adequados para o volume previsto de inóculo ressuspenso, uma micropipeta e ponteiras.
4. Antes do término da fase de incubação, remova rapidamente dez folhas na base do pecíolo das plantas selecionadas. Coloque explantações em uma placa de Petri com água estéril.
   NOTA: É fundamental usar tecido recém-excisado para inoculação foliar para evitar a dessecação foliar.
5. Após 2,5 horas, pipete 50 μL de surfactante em solução de ressuspensão de 1 L (concentração de 0,005% de surfactante) e gire suavemente o frasco para misturar (Figura 2A). Garantir o acesso de uma bandeja de propagação para colocar os explantios após a inoculação (Figura 2B).
6. Coloque o lado abaxial da folha para cima e corte perpendicularmente ao longo da nervura central em pedaços de 1 cm de comprimento com um bisturi (Figura 2C).
7. Imediatamente coloque folhas recém-cortadas em um tubo de 50 mL, adequado para o misturador rotativo de tubos, para servir como explantação de inoculação.
8. Despeje o inóculo no tubo explantante em volume para saturar todo o material e depois agite em um misturador rotativo por 10 minutos à temperatura ambiente para inoculação (Figura 2D,E).
9. Remova todas as folhas inoculadas da solução com pinças e coloque-as diretamente na bandeja de propagação preparada.
10. Separe e espalhe explantações encharcadas para que fiquem parcialmente, mas não totalmente, imersas na fina camada de água sobre as toalhas de papel saturadas (Figura 2F).
    ATENÇÃO: Mantenha condições assépticas e evite qualquer contato com superfícies ou ferramentas usadas durante os procedimentos do Agrobacterium antes da desinfecção.
11. Feche cada bandeja com filme plástico e incube no escuro à temperatura ambiente (22° C) por três dias.
12. Ao término do período escuro, certifique-se de que as bandejas estejam seladas com filme plástico transparente e ajuste as bandejas com ddH_2Opara manter o nível de umidade.
13. Mova as bandejas de inoculação para uma câmara de crescimento sob condições de propagação vegetativa.
    ATENÇÃO: Consolide os resíduos do inoculo em um recipiente de resíduos, trate-os com uma solução de água sanitária a 10% e descarte-os conforme as diretrizes de biossegurança.

4. Regeneração das plantas rosetas e estabelecimento da geração R1-T1

1. Inspecione as bandejas de inoculação 2-3 vezes por semana para garantir condições limpas e úmidas.
   1. Adicione_{ddH 2}O usando uma garrafa de espremer. Se disponível, borrife os explanadores usando um borrifador antes de fechar novamente as bandejas.
   2. Mantenha alta umidade substituindo o filme plástico que perdeu aderência ou apresenta sinais de contaminação (por exemplo, turbidez visível da água).
2. Inspecionar visualmente as plantas de roseta regeneradas para identificar as características de adequação ao transplante. Regenerantes ideais exibirão um rebento intacto com múltiplas folhas e raízes de pelo menos 2-3 mm de comprimento (Figura 2G).
   NOTA: As plantas de roseta transgênicas normalmente regeneram mais lentamente, geralmente atingindo a adequação para transplante entre 21 e 28 dias após serem colocadas na câmara de crescimento.
3. Excisar e transplantar plantas rosetas transgênicas intactas sob as mesmas condições dos regenerantes clonais WT.
4. (Opcional) Registre o número de transformadores regenerados e correlacione com suas condições de transformação para avaliar a eficiência.
   NOTA: Tenha cuidado extra durante a seleção. Regenerantes transgênicos costumam ser pequenos e facilmente negligenciados. Inspecione cuidadosamente as superfícies das folhas adaxiales e abaxiais usando pinças para maximizar o rendimento e minimizar os danos.
5. Retire a planta roseta do consumo, evitando tocar em folhas transgênicas. Pode qualquer folhagem excedente imediatamente ao redor da folha transgênica. Transplante uma planta por vaso.
6. Fertilize, rege e borrife rapidamente cada planta e coloque-a sob uma cúpula plástica para reter a umidade (Figuras 2G,H).
7. Rotule e registre cada muda transgênica.
8. Devolva explantes que contenham transformantes sem brotos, raízes ou que pareçam pequenos demais para transplantar para a bandeja de propagação para continuidade da triagem. Transplante transformantes adicionais quando o crescimento for suficiente.
9. Transplantes de névoa e água diariamente na primeira semana. Certifique-se de que sempre haja água na bandeja.
10. Remova e descarte quaisquer transplantes que tenham senescido ou não apresentem mais expressão de pigmento RUBI.
    ATENÇÃO: Descarte todos os materiais transgênicos conforme as regulamentações institucionais de biossegurança.

5. Regeneração subsequente e estabelecimento da geração quase clonal R2-T1

1. Uma vez que as plantas rosetas se tornam grandes e saudáveis (2 meses), excise folhas expandidas que expressam RUBI a partir de uma única muda (Figura 2H).
   NOTA: Embora as folhas que expressam o RUBI possam parecer uniformemente vermelhas, elas são mais comumente quiméricas. Ambos os fenótipos são adequados para propagação. Prossiga com os métodos padrão de propagação vegetativa nas etapas seguintes.
2. Divida as folhas transformadas e coloque-as em uma bandeja de propagação. Rotule claramente cada bandeja de propagação com o correspondente ID doador de mudas.
   ATENÇÃO: Não misture folhas de várias mudas na mesma bandeja. Cada muda representa um evento transgênico único e deve ser acompanhada como uma geração separada.
3. O transplante regenerou plantas R2-T1 (14-28 dias após a propagação). Atribua a cada planta um novo identificador que reflita seu segundo status. Continue o tratamento padrão após o transplante, conforme descrito anteriormente (Figura 2I,J).

Resultados

Os parâmetros da transformação de A. tumefaciens foram otimizados para produzir com sucesso plantas transgênicas de R. aquatica que expressam RUBY, contornando as limitações baseadas na esterilidade e aproveitando sua rápida taxa de regeneração assexuada (Figura 1 e Figura 2). Após a inoculação dos explantes de pedaços foliares e expostos a um tratamento escuro de 72 horas, as plantas regeneradas começaram a crescer em até 2 semanas nas condições descritas. Plantas regeneradas que exibiam setores quiméricos de RUBI grandes o suficiente para transplante foram encontradas entre 3 e 5 semanas após a inoculação (Figura 3) e eram um pouco menores do que aquelas plantas rosetas não expressivas. Nenhuma planta regenerada com RUBI foi encontrada nas bandejas controle, do tipo selvagem, confirmando que esse fenômeno era diferente da fisiologia da R. aquatica. O tipo de caldo de cultura bacteriana, o tipo de caldo de inóculo em ressistência, o método de infiltração e o período de inoculação não diferiram significativamente em sua capacidade ou taxa de geração de transformantes (Tabela 2 e Tabela 3). Fatores de tratamento que afetaram positivamente a eficiência da transformação incluíram aumento da concentração de AS e tratamento de exposição à auxina antes da inoculação com explant foliar. Um aumento na concentração de surfactante afetou negativamente o rendimento e foi considerado inadequado.

A versão R 4.4.2 12,13,14,15 foi usada para realizar a análise do Modelo Linear Misto Geral de Poisson (Poisson GLMM) de dados de contagem de plantas em rosetas. No entanto, no Experimento D (Tabela 2D), onde regenerantes expressos em RUBI foram examinados para uma inoculação de 15 minutos alterada com 150 μM AS ou 225 μM AS, o modelo violou as suposições devido à subdispersão, e um GLMM Binomial Negativo foi aplicado em seu lugar.

Os efeitos de diferentes condições de caldo bacteriano e cultura na eficiência da transformação foram cuidadosamente examinados. Entre os cinco réplicas experimentais, o uso do caldo LB de Miller ou caldo MG/L específico para transformação resultou em transformantes expressando RUBY sob parâmetros quase idênticos e não diferiram significativamente em seus efeitos (Tabela 2A). Os meios de RUBY expressos em plantas roseta regeneradas a partir de pedaços individuais de folhas, consistindo de 15 a 60 explantações por tratamento, variaram de 1,61 ± 0,71 regenerantes produzidos em experimentos que utilizaram caldo de resuspensão em cultura LB e não baseado em MS (Caldo de Indução de Controle, Tabela 1) e 3,23 ± 1,13 regenerantes desses experimentos com MG/L e o Caldo de Indução Otimizado. Apesar da ausência de diferença significativa, devido a observações subjetivas, a cultura MG/L e o Caldo de Indução Otimizado (Tabela 1) foram selecionados para futuros experimentos de otimização.

Em seguida, testamos fatores que afetam a carga bacteriana e a capacidade de acessar tecido meristático da planta. Entre oito réplicas (Tabela 2B), explantações inoculadas com concentração aumentada de surfactante de 0,01% apresentaram estresse extremo um mês depois, resultando em regenerantes pequenos e em grande parte inviáveis. Não parecia haver transformantes regenerados entre esses réplicas, embora o fenótipo do regenerante estressado dos explantes fosse pigmentação vinho, marrom e amarela, então pode ter havido transformantes potenciais. De qualquer forma, a não viabilidade dos regenerantes validou a manutenção de uma concentração de surfactante de 0,005%.

Duas técnicas mecanicistas, agitação ou infiltração a vácuo, foram comparadas em seu efeito para introduzir o DNA desejado na planta hospedeira. O método de infiltração controle, no qual os explantantes eram submersos em 50 mL de inóculo ressuspenso e rotacionados em um misturador tubular, foi bem-sucedido na produção de regenerantes expressos por RUBI nos tratamentos listados. A infiltração a vácuo aplicada também produziu regenerantes expressos em RUBY, mas não diferiu em sua eficiência de transformação em comparação com o método de controle (p = 0,478, Tabela 2D). Foram observados aproximadamente 2 a 5 regenerantes expressos por RUBI por bandeja de propagação, seja inoculados por infiltração a vácuo ou agitação física.

A concentração alterada de Acetosiringona (AS) no inóculo bacteriano diferia claramente em seu efeito sobre a eficiência da transformação. O aumento da concentração de AS de 150 μM para 225 μM melhorou significativamente a produção de explantas transgênicas expressas por RUBY (p = 0,000309, 0,000458; Tabela 3C,D). Entre os quatro experimentos, cada tratamento consistiu em uma bandeja com 40 explantações inoculadas tratadas de forma idêntica. Aqueles inoculados na maior concentração tiveram em média quase 5 regenerantes expressos por RUBY , em comparação com 1 transformante por bandeja de AS controle (Tabela 3C). Além disso, o efeito da EA pareceu ser separado dos períodos de duração da inoculação.

Entre os três experimentos com durações de inoculação de 15 minutos, incluindo explantações alteradas com 225 μM AS, foi encontrada uma média de 7,28 ± 4,13 regenerantes expressos em RUBY, claramente maior que os tratamentos de 150 μM, onde 2,03 ± 1,32 taxa de regeneração (Tabela 3D). Não houve efeito claro no intervalo de tempo entre os tratamentos controle de 150 μM (p = 0,676), para os quais a taxa média de inoculação em 10 minutos foi de 1,48 ± 0,954, comparada a 1,84 ± 1,230 regenerantes em vacinas de 15 minutos (Tabela 3B). De forma semelhante, inoculantes tratados em 10 minutos e 225 μM regeneraram cerca de 5 plantas rosetas expressas por RUBI por tratamento, o que não foi claramente diferente dos tratamentos inoculantes de 15 minutos, onde 6-7 regenerantes para a bandeja de tratamento foram indicados (Tabela 3A).

Além disso, foi testado o hormônio vegetal auxina, que auxilia a regeneração das plantas em geral. A exposição de pedaços de folha recém-excisados a um tratamento com auxina por pulso antes da inoculação teve um efeito positivo claro no aumento da regeneração de RUBI em comparação com os do ddH_2O(p = 0,00969, Tabela 2C). Quando colocados em_{ddH 2}0 emendado com ácido indol-3-acético (IAA) de 285 μM, os explantes apresentaram uma taxa média de transformantes de 6,67 ± 1,490 por tratamento, em comparação com o tratamento sem auxina, que teve uma taxa média de regeneração de 2,00 ± 0,816.

A linha transgênica imediatamente regenerada foi designada como geração R1-T1 (Figura 2), com regenerantes individuais como linhas. Todas as plantas iniciais da roseta R1-T1 apresentaram expressão de RUBI na forma de folhas quiméricas, com uma variedade de padrões quiméricos. Mais comumente, 1 a 3 folhas de planta expressavam quimeras distintas, onde tecidos expressos e não expressos por RUBI divergiam na nervura central. A maioria das mudas R1-T1 de um mês manteve expressão quimérica (Figura 3A), mas foi encontrada uma pequena quantidade de mudas totalmente expressas por RUBY.

Setores quiméricos pigmentados com RUBY propagados assexuadamente a partir de pedaços de folhas de mudas R1-T1 (Figura 3B) regeneraram plantas rosetas R1-T1 totalmente RUBI ou quiméricas dentro de 2 a 4 semanas após a excisão (Figura 3C). Após um mês, a maioria das mudas R2-T1 exibiu predominantemente folhas de rubi, com algumas apresentando pequenas regiões quiméricas não expressas (Figuras 3D,E).

Figura 1: Protocolo e cronograma de propagação vegetativa. Imagens representativas ilustram o pipeline de produção usado para regenerar plantas rosetas assexuadas. (A) Retirar folhas adultas, saudáveis e lobadas inteiras das plantas-mãe estabelecidas e cortá-las em 2-3 pedaços. (B) Colocar explantações em uma bandeja de propagação e mantê-las sob condições especificadas. Após 3 semanas, as plantas rosetas foram retiradas dos explantes e transplantadas para o meio do solo. Abaixo está uma foto real das rosetas regeneradas ainda presas (setas rosas) ao corte da folha-mãe. Essas plantas estão no estágio ideal para transplante. Barra de escala: 10 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Transformação de estacas de folhas de R. aquatica e regeneração de transformantes que expressam transcritos de RUBY . Visão geral gráfica do procedimento de transformação e da produção de regenerantes transformados. (A) Obtenção do inoculo bacteriano. (B) Preparar uma bandeja de propagação com papel filtro estéril e água. (C) Retirar folhas em pedaços de explantação. (D) Imersão dos explantações no inóculo. (E) Agitação em um batedeiro rotativo por 20r/1 min durante 10 min. (F) Espalhamento dos explantos saturados na bandeja, cobertura com uma cúpula plástica e incubação em condições escuras por 72 horas. (G,H) Após 1 mês, excisando regenerantes transformados intactos dos explantes expostos a Agrobacterium e transplantando para estabelecer plantas maduras. (I,J) Repetindo a etapa de propagação (G,H) para produzir uma geração quase clonal de R2-T1. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Gerações propagadas assexuadamente de uma linha transgênica RUBY . (A) Muda madura de R1-T1 exibindo folhas quiméricas com expressão de rubi . Barra de escamas: 1 cm. (B) Dois dos vinte explantios recém-colocados em uma bandeja de propagação a partir da muda de 3 meses mostrada em (A). Os explantes exibem um padrão quimérico de RUBI, separados na nervura central. Barra de escamas: 1 cm. (C) Plantlets de roseta R2-T1 regenerados com diferentes graus de expressão quimérica de RUBI , um mês após a excisão, antes do transplante. Raízes RUBY positivas regeneradas (seta marron). Barra de escamas: 2 cm (D) muda R2-T1 mostrada 1 mês após o transplante, apresentando expressão de RUBY . Barra de escamas: 2 cm (E) Muda madura R2-T1 3 meses após o transplante, apresentando pequenos setores (setas verdes). Barra de escala: 2 cm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Fluxograma do pipeline otimizado. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1: Formulações de Mídia Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Efeito de quatro parâmetros de otimização na eficiência de transformação de R. aquatica. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3: Efeito da concentração de acetosiringona no inoculo na eficiência de transformação deR. aquatica. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

Neste estudo, estabelecemos uma transformação estável simples e direta baseada em regeneração de R. aquatica, uma planta anfíbia da Brassicaceae que se propaga apenas^{assexuadamente.} Um pipeline completo de transformação de plantas anfíbias propagadas vegetativamente não foi estabelecido, nem a transformabilidade prática da R. aquatica foi utilizada com um marcador visual. Notavelmente, esse pipeline não requer um processo laborioso e estéril de cultura de tecidos vegetais nem incubadoras especializadas para crescimento de plantas. Assim, esse protocolo pode ser amplamente adotado em diversos ambientes experimentais, desde laboratórios de pesquisa científica até sala de aula.

Entre as diferentes condições de inoculação e incubação testadas, alguns fatores apresentaram uma melhoria significativa na eficiência da transformação. Notavelmente, uma concentração ligeiramente maior de acetosiringona (AS), assim como a de ácido indol-3-acético (IAA), afetaram positivamente a eficiência da transformação (Tabela 1 e Tabela 2). A AS é um composto fenólico que atrai Agrobacterium, e foi demonstrado que melhora a eficiência da transformação de plantas em^{Arabidopsis 17}. O fitohormônio auxina é central para a reprogramação das células vegetais. Um rápido aumento da expressão gênica relacionada à auxina foi observado durante a regeneração induzida pela^{ferida 10}. Por essa razão, pode-se presumir que a auxina (IAA) aplicada exogenamente durante a inoculação por explantio aumenta a eficiência da regeneração. No entanto, diferenças no número observado de plantas regeneradas em três ensaios não foram observadas (57, 7,55 vs. 59,67, 5,51 para controle vs. tratamento). Portanto, o tratamento com auxina provavelmente pode ajudar no processo de transformação, e não na regeneração em si.

Um surfactante não jônico, o trisilano alcoxilado (conhecido como Silwet L-77), aumenta muito a eficiência de transformação da Arabidopsis por meio do método de imersão^{floral 3}, e, por isso, é amplamente utilizado entre a comunidade de biologia vegetal. Foi observado estresse vegetal mínimo entre os explantes emendados com Silwet L-77 a 0,005% (a concentração recomendada para mergulho floral). Quando essa dose foi dobrada (0,01%), as estacas de folhas de R. aquatica foram severamente danificadas, resultando na recuperação de quase nenhum transformante (Tabela 2B). Durante o mergulho floral com Arabidopsis, o uso de surfactantes reduz a tensão superficial dos inoculantes e melhora o acesso aos botões florais. Em contraste, como espécie anfíbia, R. aquatica desenvolve folhas lisas, sem tricomas ou cutículas^{espessas 5}. O aumento do surfactante causou danos no tecido foliar, indicando que fatores além do surfactante devem ser priorizados para a eficiência da transformação em tecidos foliares não pubescentes. O surfactante é mais relevante para o fenótipo pubescente, onde facilita a penetração dos tecidos. Após integrar todos os parâmetros testados, um pipeline com as condições mais ótimas é fornecido como um fluxograma (Figura 4).

A utilização de um marcador visual, RUBY, é fundamental para esse pipeline de transformação. RUBY é um repórter sintético que codifica três genes codificantes (CYP76AD1, DODA e Glucosyltransferase) que sintetizam um pigmento vermelho brilhante, a betalaina¹¹. Quando a expressão de RUBI foi observada em regenerantes R1-T1, ela apresentou expressão como setores vermelhos, indicando que eles provavelmente são quiméricos (Figura 2 e Figura 3). Um estudo anterior revelou que a regeneração da R. aquatica se origina de um câmbio vascular de^{uma seção} 10 da folha cortada. Notavelmente, os regenerantes R1-T1 ocasionalmente exibem um limite quimérico ao longo da veia central, com metade da lâmina da folha vermelha e a outra metade verde (Figura 3A,B). A regeneração a partir de setores RUBI ocasionalmente resultou em plantas totalmente vermelhas com raízes vermelhas (Figura 3C, seta bordô), que então foram cultivadas em plantas uniformemente vermelhas R2-T1 (Figura 3D). Não foram observados efeitos adversos da superexpressão de RUBY no crescimento e desenvolvimento da R. aquatica (Figura 3). Em apoio, não foram observadas diferenças perceptíveis no tamanho e formato das folhas da roseta R1-T1 com setores RUBY (por exemplo, Figura 3B). É possível que qualquer transgene forte, constitutivo e impulsionado por promotores, possa interferir no crescimento normal das plantas e na resposta fisiológica.

Em algumas ocasiões, essas plantas de rubi 'quase clonais' desenvolveram setores verdes (Figura 3E, setas verdes), sugerindo reversão ou silenciamento do transgene. Isso indica que possuir um marcador visível como RUBY é indispensável para a expressão ectópica ou silenciamento (por exemplo, RNAi) de um gene de interesse para futuros estudos moleculares e mecanicistas. Pode-se introduzir um transgene de interesse na fita RUBY e observar os fenótipos nos setores vermelho, RUBY . Em conclusão, aproveitando a reprogramação direta induzida pelo corte das folhas e um marcador visível não invasivo, um pipeline de transformação simples e eficiente é otimizado para R. aquatica, uma Brassicaceae que se propaga vegetativamente. Embora esteja fora do escopo desse protocolo, o entendimento futuro da origem exata da regeneração da R. aquatica transformada pode fornecer insights sobre a reprogramação celular em plantas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1000 & micro; Ponteiras de pipeta L LTS com filtro L	Rainin	30389213
Acetosiringona	Sigma-Aldrich	D134406-1G
Extrato de Levedura Bacto, Técnico	Fisher Scientific	DF0886-17-0
BD Bacto Agar	Fisher Scientific	214030
BD Difco LB Broth, Miller	Midland Scientific	DIFCO 244610
BD Bacto Triptona Desidratada	Fisher Scientific	DF0123-17-3
Pó liofilizado com biotina	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Cúpulas transparentes para bandejas PermaNest	Solução para o Produtor	GD221
Filme plástico transparente	Thomas Scientific	22-305654
Vermiculita grosseira	Bectine
Di-potássio hidrogênio fosfato anidro	Sigma-Aldrich	105109
Placas de Petri descartáveis 100 x 15 mm	VWR International	25384-342
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Etanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-720
Tubos de centrífuga cônica Falcon 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Papel toalha dobrado 9,3" x 10,5"	Kimberly-Clark	2920
Espectrofotômetro Visível GENESYS 30	Termo Científica	840-277000
Solução de gentamicina	Sigma-Aldrich	G1272-100ML
Ácido L-glutâmico sal monossódico hidrato	Sigma-Aldrich	G1626-100G
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Sulfato de magnésio, Heptahidratado	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Shaker Incubador MaxQ 6000	Termo Científica	SHKE6000
Hidratação MES	Sigma-Aldrich	M8250-100G
Mistura de Sal Basal Murashige e Skoog (MS), em pó	Sigma-Aldrich	M5524-50L
MX-RL-pro: Rotador de Tubo Rotisserie	Scilogex	824222019999
mio-inositol	Sigma-Aldrich	I7508-100G
Câmara de Crescimento Percival	Percival	AR36L3
Aditivo para Solos de Perlita	Indústrias PVP	PVP105408
Bandejas de Plantas Perma-Nest 8''x12''	VWR International	470150-476
Medidor de pH Sete Compacto 5220	Mettler Toledo	30019028
Bisturi Protegido	Fisher Scientific	02-688-79
Rifampicina	Sigma-Aldrich	R3501-5G
Fertilizante de Liberação Inteligente para Plantas	Osmocote	B0071CZTBA
Cloreto de sódio	Fisher Scientific	S271-3
Espectromicina diidrocloreto pentahidratado	Sigma-Aldrich	S4014-5G
Frascos de spray com vaporizador de bomba	Thomas Scientific	1141V43
Potenciômetros quadrados de 3,5" GAGE	Growers Nursery Supply Inc.	03GA-0350S
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389-5KG
Sol Profissional para Cultivo #4	Horticultura Sun GRO	1341CFL0028P S
Tensioativo - Silwet L-77	Fisher Scientific	NC1791615
Dessecador a vácuo	O Depósito de Laboratórios	55207
Alimento Vegetal Universal Soluble em Água	Miracle-Gro	160101