Separação Automatizada de HPLC Usando LC-mate: um Autosampler Repetitivo Integrado e Coletor de Frações para Purificação em Microescala

Resumo

Um autosampler integrado e coletor de frações (LC-mate) foi desenvolvido para automatizar separações repetitivas de HPLC. Compatível com detectores HPLC que emitem sinais analógicos, o LC-mate melhora o desempenho de sistemas operados manualmente e acelera fluxos de trabalho de pesquisa que dependem da cromatografia líquida de alto desempenho.

Resumo

A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) desempenha um papel crucial na purificação de compostos de alto valor, atendendo às crescentes demandas das disciplinas de química e biologia tanto em ambientes acadêmicos quanto industriais. No entanto, a injeção manual repetida e a coleta de frações durante a purificação em microescala limitam significativamente a eficiência e a reprodutibilidade. Para superar esse gargalo, desenvolvemos um sistema integrado de autoamostragem e coletor de frações, temporariamente chamado LC-mate, que automatiza separações repetitivas respondendo diretamente a sinais analógicos do detector HPLC. O instrumento é construído em torno de uma válvula de comutação de seis portas de alta pressão para injeção de amostras e uma válvula seletora para coleta de frações, com parâmetros operacionais controlados por meio de uma interface intuitiva com tela sensível ao toque. O LC-mate é compatível com detectores comerciais HPLC capazes de saída analógica e também pode alcançar separação repetitiva do modo de elução de gradiente por meio de disparo síncrono de sinal. Experimentos de demonstração confirmaram operação estável e separações reprodutíveis para purificação de produtos naturais, mostrando uma clara redução no tempo de manuseio manual. O sistema oferece uma solução prática e acessível para aprimorar a automação nos fluxos de trabalho convencionais de HPLC, preenchendo a lacuna entre sistemas de purificação manuais e totalmente automatizados.

Introdução

A cromatografia, pioneira por M.S. Tswett no início do século XX, evoluiu para a moderna cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) na década de 1960, com avanços na ^{instrumentação 1,2,3}.

Hoje, o HPLC desempenha um papel fundamental na purificação de compostos de alto valor, atendendo às crescentes demandas das disciplinas de biomedicina, química e biologia tanto nos campos acadêmico quanto industrial. Na pesquisa acadêmica, a purificação em microescala de produtos naturais e a resolução de moléculas quirais dependem criticamente de técnicas semi-preparativas de^HPLC 4,5,6,7,8. Na maioria dos casos práticos, os pesquisadores injetam uma porção da solução amostral em uma coluna HPLC por vez, em vez de tudo, para evitar perdas imprevisíveis da amostra ou devido à limitação do tamanho da coluna, o que torna inevitável a injeção repetida de amostras e a coleta de frações. Apesar de sua excepcional capacidade de separação, o uso do HPLC para purificação de amostras permanece limitado por restrições inerentes à instrumentação e aos fluxos de trabalho atuais. Um grande gargalo está na forte dependência da intervenção manual, especialmente na injeção de amostras e na coleta de frações. Esses processos não são apenas demorados e trabalhosos, mas também suscetíveis a erros humanos, comprometendo assim a capacidade de produção, reprodutibilidade e eficiência operacional^{geral 9,10}.

Autoamostradores comerciais e coletores de frações de grandes fabricantes de HPLC, como Agilent, Shimadzu e Waters, fornecem automação confiável e precisa, mas geralmente estão restritos a ecossistemas proprietários de hardware e software. Por exemplo, o autosampler Agilent 1260 Infinity II e o coletor de frações G1364F são integrados perfeitamente aos sistemas HPLC da Agilent, oferecendo excelente reprodutibilidade, mas compatibilidade limitada entre plataformas. Da mesma forma, os autosamplers SIL-20A/40C e os coletores FRC-40/FRC-10A da Shimadzu oferecem alta taxa de transferência e excelente precisão mecânica, mas dependem das arquiteturas de controle LC-20 e Nexera da Shimadzu. Os módulos autosampler HPLC e coletor de frações III da Waters Alliance também oferecem desempenho robusto e formatos de coleta flexíveis (até 300 mL/min), mas permanecem adaptados aos ambientes proprietários UHPLC e LC-MS da Waters. Além disso, autoamostradores tradicionais que dependem de agulhas de injeção podem reduzir a recuperação da amostra, e coletores de frações baseados em tubos podem ser inconvenientes para lidar com grandes volumes eluentes. Para a maioria dos outros instrumentos HPLC, a separação semi-preparativa ainda depende de uma operação manual repetitiva e tediosa.

Esses desafios destacam a necessidade de uma abordagem inovadora para automatizar a purificação de amostras nos fluxos de trabalho HPLC. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos o LC-mate, um instrumento compacto e versátil que integra módulos de autosampler e coleta de frações em uma única plataforma. O núcleo fluídico do LC-mate consiste em dois componentes principais: uma válvula de comutação de seis portas de alta pressão (SKVA-3130-S) construída em aço inoxidável SUS 316 com caminho de fluxo de 0,4 mm e suportando pressão operacional de até 45 MPa, com classificação para controle preciso de injeção de amostras, e uma válvula seletora multi-posição de 10 canais com volume morto mínimo (27,5 μL porta a porta, sulco de rotor de 5 μL) com diâmetro de canal de fluxo de 1,2 mm para coleta eficiente de frações. Essa configuração minimiza o volume morto e reduz o risco de contaminação cruzada. Para especificações detalhadas do instrumento, consulte a Tabela 1. O LC-mate pode receber saída analógica de detectores HPLC e acionar o instrumento HPLC via sinal síncrono, permitindo controle independente tanto da injeção de amostras quanto da coleta de frações.

Tabela 1: Parâmetros de instrumento relacionados ao LC-mate. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

O instrumento está equipado com software de controle amigável e uma interface intuitiva com tela sensível ao toque que permite visualização em tempo real dos sinais cromatográficos analógicos. O LC-mate suporta modos de separação isocrática e gradiente, permitindo que os usuários configurem parâmetros-chave — incluindo volume de injeção, número de tempos de repetição, intervalo de cada injeção e modo de coleta [baseado em limiar, baseado em tempo ou Collect All (coletar frações acima e abaixo do limiar)] e executar operações totalmente automatizadas com um único comando. Isso elimina a necessidade de intervenção manual repetitiva e melhora significativamente a eficiência da purificação do HPLC.

A Figura 1 ilustra a aparência geral, o princípio de funcionamento e a configuração do LC-mate integrado a um sistema HPLC.

Figura 1: Projeto e configuração do sistema LC-mate. (A) Layout esquemático. (B) Diagrama de instrumentos. (C) Foto prática de preparação. (D) Conexão da linha de transmissão de sinal entre o detector UV e o LC-mate. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Protocolo

1. Verificando a conexão

1. Verifique as conexões do solvente entre o HPLC, LC-mate e a coluna cromatográfica para garantir caminhos de fluxo adequados (Figura 1A).
2. Verifique a conexão da linha de transmissão de sinal entre o detector UV e o LC-mate, conforme mostrado na Figura 1D.
   1. Conecte o fio preto ao terminal vermelho e o fio branco ao terminal preto para igualar a polaridade da saída do sinal analógico.
   2. Observe a exibição LC-mate. Se a forma de onda do sinal analógico aparecer, a conexão está correta.
      NOTA: Se não houver forma de onda visível, inverta as conexões: conecte o fio preto ao terminal preto e o fio branco ao terminal vermelho.
3. Verifique a conexão do gatilho entre o detector UV e o LC-mate.
   1. Conecte a única extremidade do cabo de dados na porta de saída do detector UV.
   2. Conecte os fios preto e branco da outra extremidade aos terminais de gatilho azul e preto no LC-mate, respectivamente.
   3. Aperte o terminal e o gatilho para garantir uma conexão firme.

2. Inicialização do sistema integrado de separação

1. Garanta a correta partida do HPLC.
2. Garanta a inicialização correta do LC-mate.
   1. Ao iniciar o sistema LC-mate, clique no ícone LC-mate na interface para executar automaticamente o programa de autoteste do sistema e inicializar módulos-chave de hardware.
   2. Aguarde pelo breve tom do prompt Di (aproximadamente 0,5 s) e pelo desaparecimento do prompt "Auto-Teste" na tela após a conclusão do auto-teste, pois indicam que a inicialização foi concluída.

3. Otimização de condição

1. Configure a condição de separação do HPLC e inicie a elução para alcançar o equilíbrio da coluna.
2. Clique no ícone de Teste no lado esquerdo da tela do LC-mate, e a interface seguinte será exibida na tela (Figura 2A). Parâmetros de Volume de Injeção de Entrada, Tempo de Elução e Tempo de Repetição , e pressione o ícone Start ; será iniciada a execução do autosampler, do coletor de frações e do HPLC. Nesse caso, o eluente só sai pela porta 10 da válvula seletora, podendo ser coletado manualmente ou descartado.
3. Identifique as condições viáveis de separação, incluindo resolução, tempo de execução, tempo de retenção, volume de injeção e comprimento de onda UV, etc., para facilitar a separação subsequente e a coleta de frações sob modos adequados.

4. Funcionamento automático

NOTA: Com base no cromatograma das condições viáveis de separação, pode-se selecionar uma forma adequada de coleta de frações a partir das opções Limiar, Coleta de Tempo e Coletar Todos no lado esquerdo da interface.

1. Coleta de frações baseada no valor limiar
   1. Selecione o módulo de função Limiar no lado esquerdo da interface, e o sistema exibirá a interface de configuração de parâmetros conforme mostrado na Figura 2B.
   2. Insira o Volume de Injeção, Tempos de Repetição, Limiar e Tempo de Elução, e pressione Start; o HPLC e o LC-mate funcionam automaticamente. Frações com picos cromatográficos acima do limite serão coletadas em diferentes frascos de coleta.
   3. Monitore os indicadores de status dispostos verticalmente no display: Observe a Injeção em Progresso para confirmar que a introdução da amostra foi iniciada. Verifique a Separação em Progresso para verificar se a separação cromatográfica está acontecendo. Note "Seringa Esvaziando" para identificar quando a seringa está purgando líquido residual. Fique atento ao destaque azul do texto correspondente para confirmar qual estado operacional está ativo no momento.
      NOTA: Durante o processo de separação, pressionar o ícone "Cromatograma" exibirá o cromatograma e a linha de limiar em uma nova interface, e o cromatograma é idêntico ao mostrado na tela do computador que controla o HPLC.
2. Coleta de frações baseada no período de tempo
   1. Selecione o módulo Coleção de Temporização no lado esquerdo da interface para abrir o menu de configuração de parâmetros (Figura 2C).
   2. Insira os parâmetros necessários: Volume de Injeção, Tempos de Repetição, Tempo de Elução e uma série de Tempos de Coleta necessários.
   3. Pressione o botão Start para iniciar a sequência automatizada, então o sistema HPLC e o LC-mate serão executados repetidamente de acordo com os parâmetros definidos.
3. Coleta de frações com o modo "Collect All"
   1. Selecione o módulo de função Coletar Tudo no lado esquerdo da interface, o sistema exibirá a interface de definição de parâmetros conforme mostrado na Figura 2D.
   2. Defina um valor de limiar de coleta, e os picos cromatográficos acima ou abaixo do limiar serão coletados separadamente, o que pode garantir que nenhum composto em uma mistura seja perdido.
      NOTA: O acetonitrilo é um solvente inflamável e tóxico. Todos os procedimentos envolvendo acetonitrilo ou outros solventes orgânicos devem ser realizados em um laboratório bem ventilado. O pessoal deve usar equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo óculos químicos contra respingos e luvas resistentes a solventes, o tempo todo. Acetonitrila e outros solventes orgânicos devem ser coletados em recipientes designados e devidamente rotulados para resíduos químicos perigosos. Esses fluxos de resíduos foram tratados de acordo com o protocolo de saúde e segurança ambiental da nossa instituição por um serviço licenciado de descarte.

5. Limpeza de tubulações

NOTA: A limpeza do pipeline garante que nenhuma amostra permaneça no pipeline quando o autosampler for usado na próxima vez.

1. Prepare um pequeno frasco de solvente limpo e insira o pipeline de injeção do autoamostrador no solvente.
2. Selecione o módulo de Purificação na interface do lado esquerdo para abrir o menu de configuração de parâmetros (Figura 2E).
3. Limpeza do pipeline do injetor
   1. Ajuste o Volume de Injeção entre 0 e 1000 e defina os Tempos de Repetição (sem limites).
   2. Clique na Limpeza abaixo de "Limpeza Concluída" para iniciar a limpeza do pipeline do injetor.
   3. Monitore a contagem de "Ciclos" para acompanhar o número de ciclos de lavagem concluídos.
4. Limpeza do pipeline de coleta
   1. Defina o tempo de purificação (sem limites).
   2. Clique na Limpeza abaixo do "Pipeline Atual" para iniciar a limpeza do pipeline de coleta.
   3. Monitore a tela do Pipeline Atual para confirmar qual pipeline está sendo limpo, enquanto o sistema processa sequencialmente do pipeline 0 ao pipeline 10.

Figura 2: Interface de tela sensível ao toque LC-mate para operação do método. (A) Tela de otimização. (B) Modo limiar. (C) Modo de temporização. (D) Modo coletar tudo. (E) Limpeza do duto. (F) Cenários. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Instruções de salvamento de dados

1. Ative o salvamento automático. O sistema salva automaticamente o cromatograma após a conclusão de cada ciclo de elução.
2. Realize o salvamento manual. Clique no botão Salvar após a conclusão da elução. Insira os metadados necessários na caixa de diálogo para salvar o arquivo.
3. Selecione o local de armazenamento. Escolha salvar arquivos no armazenamento local do dispositivo, em um cartão SD ou em um drive USB externo.
   NOTA: Use um drive USB externo para todo o armazenamento de dados para evitar limitações de capacidade e garantir fácil acesso aos dados.

Resultados

Purificação do hiperosídeo 2"-O-galloyl-hyperoside
O 2"-O-Galloyl-hiperosídeo (2-GH) é um componente principal solúvel em água da Euphorbia helioscopia L., uma medicina tradicional chinesa com longa história de uso para resolver catarro e^{umidade 11}. Sua estrutura química é mostrada na Figura 3. Recentemente, foi descoberto que o 2-GH possui efeito anti-fi...

Discussão

Esses resultados demonstram que o sistema LC-mate pode realizar de forma autônoma a injeção contínua de amostras e coleta de frações seguindo os parâmetros estabelecidos, minimizando significativamente a intervenção manual e aumentando a eficiência da separação. O sistema apresenta uma interface amigável, exigindo apenas a configuração inicial do hardware seguida de uma operação intuitiva na tela sensível ao toque.

Para garantir o sucesso experimental, três as...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cromatógrafo líquido de alto desempenho-EasySep-1050	Shanghai Tongwei Analysis Technology Co., Ltd.. Página do instrumento EasySep®-1050 https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100522/C140238.htm	1009992	Um sistema HPLC preparativo modular utilizado no protocolo. Inclui uma bomba de entrega de solvente, um detector UV/VIS e uma válvula de injeção manual. Esse sistema forma a unidade de separação central que o LC-mate automatiza.
(Coluna cromatográfica líquida) Sharpsil-U C18 150 mm (L) e tempos; 30 mm (I.D.) S-10 & micro; m, 100A	Shanghai Xuanmei Industrial Development Co., Ltd.	U180110-300150	Coluna cromatográfica C18 de fase invertida com tamanho de partícula de 10 e mu; m e um tamanho de poros de 100 Å. Ele foi projetado para a separação de pequenas moléculas (como medicamentos, compostos orgânicos) e possui boa reprodutibilidade e estabilidade. As dimensões da coluna (150 mm de comprimento, 30 mm de diâmetro interno) a tornam adequada para cromatografia preparativa ou semi-preparativa.
LC-mate	Shanghai Betterren Medical Technology Co., Ltd. Para qualquer dúvida em  o instrumento LC-mate, por favor entre em contato com o autor correspondente por e-mail: wmzhao@simm.ac.cn	GD202200337	Equipamentos auxiliares para sistemas de cromatografia líquida, provavelmente usados para injeção de amostras, gerenciamento de fase móvel ou aquisição de dados. Pode ser integrado a sistemas HPLC para melhorar a automação e a eficiência dos processos experimentais