Avaliação da Funcionalidade Multimodal das células T do Receptor de Antígeno Quimérico em Resolução de Célula Única por Análise Optofluídica

Summary

A terapia adotiva com células T usando células CAR-T mostra potencial no tratamento de cânceres sanguíneos, embora as respostas duradouras sejam inconsistentes. Células T polifuncionais correlacionam com a durabilidade à remissão, mas ensaios padrão obscurecem subpopulações chave. Apresentamos um fluxo de trabalho de célula única usando uma plataforma optofluídica para identificar e isolar células CAR-T altamente funcionais para estudos posteriores.

Abstract

A terapia adotiva com células T é um novo paradigma de tratamento no qual as células T autólogas são geneticamente modificadas para expressar um receptor quimérico de antígeno (CAR) que visa tumores antes da expansão ex vivo e reinfusão no paciente. Apesar das demonstrações notáveis de potência antitumoral em pacientes com malignidades hematológicas avançadas, respostas duradouras não se manifestam em uma fração substancial dos casos. Embora vários fatores idiossincráticos possam contribuir para a variabilidade nos desfechos clínicos, há evidências crescentes de que a porcentagem de células T polifuncionais no produto pré-infusão de células CAR-T está fortemente correlacionada com a durabilidade da remissão do câncer. Infelizmente, as avaliações padrão dos produtos de células CAR-T atualmente dependem de medições populacionais em massa ou ensaios terminais, limitando a capacidade de isolar e estudar subpopulações com propriedades funcionais aprimoradas. Aqui, demonstramos um fluxo de trabalho que utiliza uma plataforma optofluídica para avaliar tanto o perfil de secreção de citocinas quanto a ativação via expressão de CD137 de células CAR-T individuais, que podem ser opcionalmente combinadas com a avaliação da atividade citotóxica. Células que exibem o maior grau de funcionalidade multimodal podem ser isoladas para análises adicionais que informem o design de terapias de próxima geração com células CAR-T.

Introduction

Células T que expressam receptor de antígeno quimérico (CAR) demonstraram notável potência antitumoral em pacientes com malignidades hematológicas^{avançadas 1,2}. No entanto, frações substanciais dos pacientes tratados eventualmente recaem, destacando a necessidade de desenvolver produtos de células CAR-T com maior persistência^funcional 3,4,5,6. Embora muitos fatores idiossincráticos possam contribuir para a variabilidade nos desfechos clínicos, há evidências crescentes de que a porcentagem de células T polifuncionais no produto de células CAR-T pré-infusão está fortemente correlacionada com a durabilidade da remissão do câncer. Assim, estratégias para enriquecer ou modificar células CAR-T com maior polifuncionalidade podem resultar em produtos terapêuticos com potencial aumentado para mediar respostas clínicas ^{duradouras 6,7,8}. Infelizmente, os métodos atuais para caracterizar as funções das células CAR-T dependem em grande parte de medições populacionais em massa ou ensaios terminais. Essas limitações limitam a capacidade de isolar e estudar subpopulações específicas com propriedades multifuncionais aprimoradas. Por exemplo, a secreção de citocinas é tipicamente avaliada por supernadantes em massa ou por meio de coloração intracelular. A segunda requer fixação celular em troca de informações^{no nível 9} de célula única. De forma semelhante, o potencial citotóxico é mais comumente avaliado para populações massivas de células CAR-T quantificando a perda de viabilidade célula-alvo após a^co-cultura 10 de célula T/célula-alvo. A capacidade de avaliar a secreção, ativação e atividade citolítica de citocinas de células CAR-T viáveis em resolução de célula única pode impulsionar o desenvolvimento de produtos terapêuticos com eficácia antitumoral mais duradoura.

Aqui, apresentamos um método para perfilar simultaneamente células CAR-T individuais para funcionalidade multimodal via uma plataforma optofluídica de célula única (Figura 1). O sistema utiliza posicionamento optoelétrico (OEP) para mover esferas de captura de citocinas e células individuais para cercas espacialmente segregadas, permitindo avaliações funcionais de células CAR-T individuais (Figura 2A). Neste protocolo, demonstramos um fluxo de trabalho para gerar células CAR-T via transferência gênica não viral e avaliamos a secreção e ativação de citocinas via CD137 de células CAR-T individuais durante a co-cultura com células-alvo expressoras e negativas para antígenos (Figuras 3 e Figura 4)¹¹. O potencial para diferenciar perfis de citocinas e ativação entre produtos celulares modificados é exemplificado comparando as células CAR-T padrão com as células c-Jun que^{sobreexpressam as 6}. A atividade citotóxica contra células-alvo único também pode ser avaliada usando leituras baseadas em caspase ou fluorescência na plataforma optofluídica (Figura 2B). No entanto, é necessária análise de time-lapse para determinar a cinética de interação, que pode variar significativamente para cada construção e experimento CAR. Da mesma forma, ensaios de matar repetitivo que imitam estimulação crônica exigem um fluxo de trabalho alternativo. Portanto, neste artigo, descrevemos o procedimento básico para realizar a avaliação de citotoxicidade, mas não discutimos suas aplicações detalhadas.

Com base na avaliação escolhida e nas características do alvo, células CAR-T vivas que exibem o maior grau de funcionalidade multimodal podem ser descarregadas do instrumento e transferidas para poços individuais em placas de 96 poços para estudo adicional (Figura 2C).

Protocol

NOTA: O buffer e a preparação para a mídia são fornecidos na Tabela 1.

1. Isolamento de células T CD8 a partir de cones do sistema de redução de leucócitos

NOTA: Realize todas as etapas com técnica estéril e asséptica em um gabinete de biossegurança em cultura de tecidos. Todos os meios para diluições, lavagens e ressuspensões devem ser mantidos a 4 °C durante todo o procedimento.

1. Adicione 15 mL de meio de separação celular (densidade 1,077 g/mL) a cada um dos dois tubos cônicos de 50 mL (tubo de separação).
2. Segure um cone do sistema de redução de leucócitos (LRS) (lado cônico para baixo) sobre um tubo cônico de 50 mL sem tampo. Usando tesoura esterilizada, corte o tubo plástico que se estende abaixo do cone LRS. Apoie o cone LRS em cima do tubo cônico aberto de 50 mL e corte o tubo plástico acima. Colete aproximadamente 8-10 mL de sangue no tubo cônico de 50 mL.
3. Encha o tubo cônico de 50 mL até 50 mL com PBS + EDTA (preparado conforme indicado na lista de meios e tampões) e pipete para misturar o sangue diluído. Divida o sangue diluído igualmente entre os dois tubos de separação.
4. Centrifuge os tubos de separação com sangue diluído a 750 x g por 15 minutos em temperatura ambiente (RT), com 9 como aceleração e 2 como desaceleração.
5. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, colete cuidadosamente e transfira a camada buffy de cada tubo de separação para um tubo cônico novo de 50 mL.
6. Preencha cada tubo cônico de 50 mL até 40 mL com PBS + EDTA e ressuspenda para obter suspensões de célula única. Centrifuge as suspensões de célula única a 300 x g por 10 minutos a 4 °C. Aspire o sobrenadante.
7. Resuspenda e combine os pellets celulares em 40 mL de PBS + EDTA. Centrifuge a suspensão de célula única a 300 x g por 10 minutos a 4 °C. Aspire o sobrenadante.
8. Ressuspenda o pellet celular em PBS + EDTA e determine a densidade celular viável da suspensão de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por meio da coloração com Trippan Blue.
   NOTA: O Trippan Blue é um corante impermeável a células vivas que tinge o DNA. Assim, tanto PBMCs vivos quanto células não nucleadas (ou seja, glóbulos vermelhos) permanecerão sem coração. É importante excluir pequenas células (por exemplo, glóbulos vermelhos) ao determinar a densidade viável de PBMC.
9. Transfira o número desejado de PBMCs para um tubo cônico novo de 50 mL para enriquecimento magnético das células T CD8⁺ . Estime-se 10 vezes o número desejado de células CD8⁺ T como a quantidade inicial de PBMCs necessária para o enriquecimento magnético. Mantenha os reagentes frios durante o procedimento.
10. Centrifuge a suspensão da célula PBMC a 300 x g por 10 minutos a 4 °C. Aspire o sobrenadante. Resuspenda o pellet celular em 40 μL de MACS Buffer (preparado conforme indicado na lista de meios e buffers) por 1 x 10⁷ células.
11. Adicione 10 μL de Cocktail Biotina-Ab CD8⁺ T cell por 1 x 10⁷ células. Misture pipetando e incube por 5 minutos a 4 °C.
12. Adicione 30 μL de buffer MACS por 1 x 10⁷ células. Adicione 20 μL de microesferas CD8⁺ células T por 1 x 10⁷ células. Misture pipetando e incube por 10 minutos a 4 °C.
13. Coloque colunas LS pré-resfriadas em um ímã. Coloque um tubo cônico de 15 mL embaixo para coletar o fluxo de líquido. Equilibre cada coluna LS com 3 mL de Buffer MACS.
14. Usando o mesmo tubo cônico de 15 mL do tubo coletor, aplique a suspensão da célula à coluna LS equilibrada. Lave a coluna 3 vezes com 1 mL de MACS Buffer. Deixe cada lavagem de 1 mL passar completamente pela coluna LS antes de aplicar a próxima lavagem.
15. Suspenda cuidadosamente as células coletadas e determine a densidade celular viável da suspensão enriquecida de células CD8⁺ T por meio da coloração com Trippan Blue.

2. Ativação baseada em esferas das células T CD8⁺

1. Calcule o número de esferas humanas CD3/CD28 necessárias para uma proporção 1:1 de células T:contas. A coronha de contas de ativação contém 1 x 10,⁶ contas por 25 μL.
2. Levemente vórtice as esferas de ativação por pelo menos 30 s antes de transferir o volume calculado da suspensão das esferas para um tubo cônico de 15 mL. Adicione um volume igual de substrato para lavar as esferas e o vórtice por pelo menos 5 segundos.
3. Coloque o tubo cônico de 15 mL no respectivo ímã por 1 minuto para coletar as esferas nas laterais do tubo. Aspire e descarte o sobrenadante.
4. Calcule o volume do meio necessário para uma concentração final de células T de 1 x 10⁶ células T/mL. Remova o tubo cônico de 15 mL do ímã e resuspenda no volume calculado do meio de cultura. Adicione IL-2 humano recombinante a uma concentração final de 50 U/mL.
5. Transfira o meio totalmente suplementado para o tubo contendo as células T e resuspenda-o. Semeie a suspensão celular em um formato apropriado de cultura celular (por exemplo, 1 mL em placas de 48 poços, 2 mL em placas de 24 poços) e incube por 40 horas.

3. Geração de células CAR-T por transferência gênica não viral via nucleofecção

NOTA: O pré-aquecimento do meio (37 °C), reagentes (RT) e da centrífuga (RT) é fundamental para proporcionar alta eficiência de transferência gênica.

1. Prepare e rotule uma placa de 48 poços com 1 mL de meio de cultura celular para cada condição de nucleofecção. Incube a placa por pelo menos 30 minutos para fornecer um meio quente e ajustado ao CO₂, com pH fisiológico.
2. Ligue o Nucleofector e selecione as posições a serem nucleofetadas dentro da faixa de 16 poços. Selecione o programa apropriado (por exemplo, FI-115 para favorecer alta eficiência ou EO-115 para maior viabilidade).
3. Retire a placa de cultura celular com células T da incubadora e use um microscópio para verificar a aparência visual das células, para obter uma primeira impressão de se a ativação foi bem-sucedida. Células T ativadas com sucesso devem apresentar agrupamento uniforme e formato celular aumentado. Uma cor média que difere de um substrato fresco para um tom levemente alaranjado indica que a ativação resultou em um estado metabólico mais ativo e é considerada um bom sinal. Neste ponto, uma análise citométrica de fluxo dos marcadores de ativação precoces CD25 e CD69 pode validar a ativação.
4. Resuspenda, colhe e conte células T ativadas. Calcule o número de células T necessárias considerando de 1,2 a 2 x 10^{células T de 6} por condição. Transfira o volume calculado para um tubo cônico novo de 15 mL e centrifuge a 200 x g por 10 minutos em RT.
5. Aspire e descarte o sobrenadante e lave as células T com 10 mL de PBS morno. Centrifuge a 200 x g por 10 min em RT. Use o tempo de centrifugação para descongelar os plasmídeos codificadores de CAR, normalmente com uma concentração de 1 μg/μL de DNA. Monte plasmídeo codificante de transposase (SB100x) (1,0 μg) ou minicírculo (0,5 μg) junto com plasmídeo codificante CAR (1,0 μg) ou minicírculo (0,6 μg) em um tubo de microcentrifugação individual livre de DNA de 1,5 mL por condição de nucleofecção.
6. Prepare uma quantidade suficiente de Solução Nucleofectora P3 com suplemento adicional (por condição: 16,4 μL de Solução Nucleofectora + 3,6 μL de Suplemento).
7. Retire o tubo cônico de 15 mL contendo as células T da centrífuga, aspire o sobrenadante e centrifuge por 1 minuto a 200 x g para coletar o fluido residual no fundo. Pegue uma pipeta de 200 μL para remover cuidadosamente o máximo de tampão possível sem tocar no pellet celular.
8. Continue imediatamente com a resuspensão do pellet da célula T em 20 μL de tampão P3 (conforme indicado na lista de materiais) por condição. Transfira 20 μL de suspensão celular em buffer P3 para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo as respectivas construções, misture suavemente sem introduzir ar e transfira a suspensão celular para a tira nucleofeccional de 16 poços. Bata suavemente para remover qualquer ar do fundo do poço.
9. Coloque a tira de 16 poços no Sistema Nucleofector 4D e inicie o procedimento de nucleofecção. Após a nucleofecção bem-sucedida, uma cruz verde deve ser visível na tela para cada poço escolhido.
10. Adicione imediatamente 100 μL de meio pré-aquecido da placa preparada de 48 poços antes de incubar a tira de 16 poços por 10 minutos na incubadora.
11. Resuspenda cuidadosamente 2x a 3x, transfira a suspensão celular para a placa preparada de 48 poços e coloque de volta na incubadora.
12. Após 4-5 horas, remova cuidadosamente 500 μL de cada poço e adicione cuidadosamente 500 μL de meio de cultivo fresco e pré-aquecido, suplementado com 50 U/mL de IL-2 humano recombinante.
13. Realize trocas regulares de meio dia sim, dia não, para expandir as células, mantendo uma densidade celular entre 0,5 e 2 x 10⁶ células T/mL.
14. No dia 6, remova as contas de ativação CD3/CD28. Colhe células T resuspendendo suavemente 10 vezes e transferindo a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL. Coloque o tubo cônico de 15 mL no respectivo ímã por 1 minuto.
15. Aspire a suspensão celular, transfira para uma placa de cultura fresca e alimente as células com meio de cultivo celular fresco suplementado com IL-2 até uma concentração final de 50 U/mL. As esferas devem permanecer visíveis nas laterais do tubo cônico de 15 mL que permanece no ímã.
16. Analise a eficiência de transferência gênica no dia 7 por meio de análise citométrica de fluxo da expressão de marcadores CAR ou substitutos antes de prosseguir para a separação magnética das células T CAR-positivas para transgenes no dia 8 (Estratégia de Gating na Figura Suplementar 1).

4. Enriquecimento magnético de células T positivas para transgenes

NOTA: Realize todas as etapas com técnica estéril e asséptica em um gabinete de biossegurança em cultura de tecidos. Todos os meios para diluições, lavagens e ressuspensões devem ser mantidos a 4 °C durante todo o procedimento.

1. Colhe células T resuspendendo-as suavemente e transferindo-as para tubos cônicos de 15 mL. Conte as células T, pegue o número de células a serem enriquecidas magneticamente e centrifuge por 10 minutos a 300 x g.
2. Aspire e descarte o sobrenadante e lave resuspendendo 10 mL de buffer MACS. Centrifuge por 10 minutos a 300 x g. Aspire e descarte o sobrenadante.
3. Calcule a quantidade de anticorpo biotinilado direcionado contra o marcador substituto (por exemplo, tEGFR) necessário. Normalmente, o anticorpo deve ser ajustado para 1 μL por 1 x 10⁶ células.
4. Resuspenda as células T a uma densidade de 1 x 10⁷ células por mL e adicione a quantidade calculada de anticorpo biotinilado. Incube por 20 minutos a 4 °C.
5. Lave adicionando 10 mL de buffer MACS e centrifuge por 10 minutos a 300 x g. Aspire e descarte o sobrenadante.
6. Resuspenda as células T em 1 x 10⁷ células por 80 μL de buffer MACS. Adicione microesferas de antibiotina em um volume de 20 μL por 1 x 10⁷ células. Misture bem e incube por 15 minutos a 4 °C.
7. Lave adicionando 10 mL de buffer MACS e centrifuge por 10 minutos a 300 x g. Aspire e descarte o sobrenadante. Resuspenda células em 500 μL de buffer MACS.
8. Coloque colunas LS pré-resfriadas em um ímã. Coloque um tubo cônico de 15 mL embaixo para coletar o fluxo de líquido.
9. Equilibre cada coluna LS com 3 mL de Buffer MACS. Usando o mesmo tubo cônico de 15 mL do tubo coletor, aplique a suspensão da célula à coluna LS equilibrada.
10. Lave a coluna 3 vezes com 1 mL de MACS Buffer. Deixe cada lavagem de 1 mL passar completamente pela coluna LS antes de aplicar a próxima lavagem.
11. Para coletar células positivas para transgene, retire a coluna de LS do ímã e coloque-a em um tubo cônico novo de 15 mL. Adicione 5 mL de buffer MACS e empurre suavemente o líquido para fora da coluna.
12. Conte as células isoladas e centrifuge por 10 minutos a 300 x g. Resuspenda as células trans-positivas em um volume apropriado de meio suplementado com IL-2 e incube até realizar avaliações funcionais e/ou fenotípicas. Realize a verificação de pureza antes de iniciar os fluxos de trabalho, colorindo para o marcador de transdução CAR ou substituto (Figura Suplementar 2).

5. Preparação do sistema

1. Ligue o instrumento e abra o software Cell Analysis Suite (CAS). Certifique-se de que o contêiner de coleta de resíduos esteja vazio. Verifique se há água na coluna do umidificador.
2. Navegue até o painel de fluxos de trabalho. Abra o fluxo de trabalho Full Clean (pré-carregado durante a instalação do sistema).
   NOTA: Recomenda-se executar o fluxo de trabalho Full Clean dentro de 72 horas após iniciar um experimento no instrumento.
3. Faça todas as verificações e prossiga clicando em Iniciar. Quando solicitado, troque os tubos cônicos e os frascos de reagentes em cada uma das ranhuras da baia de reagentes por recipientes novos com solução de limpeza BLI. Clique no ícone Correr para prosseguir.
4. Quando solicitado, troque os tubos cônicos e as garrafas de reagentes em cada uma das ranhuras da baía por recipientes novos por água estéril. Clique no ícone Correr para prosseguir.
5. Abra o fluxo de trabalho Pre-flight Check (pré-carregado durante a instalação do sistema). Faça todas as verificações e prossiga clicando em Iniciar.
6. Prepare um tubo cônico de 50 mL com 2 mL de Solução Molhante. Prepare um tubo cônico separado de 50 mL com 39,6 mL de 1x DPBS e 400 μL de Aditivo Molhador.
7. Quando solicitado, substitua o chip Flush por um chip optofluídico. Clique no ícone Correr para prosseguir. Limpe cuidadosamente a superfície do chip optofluídico e as ferulas do ninho com etanol 70% antes de fechar os ninhos.
8. Quando solicitado, troque os tubos cônicos e as garrafas de reagentes em cada uma das ranhuras da baía de reagentes por recipientes novos com as soluções apropriadas.

6. Criação de fluxos de trabalho de ensaio

1. Navegue até o painel de fluxos de trabalho. Selecione Criar novo fluxo de trabalho (+), selecione Perfil de células Opto T e então selecione MCA e Ensaio de Citotoxicidade no menu suspenso.
2. Clique duas vezes em Multiplex Cytokine Bead Load para expandir a lista de carga de bead. Se testar menos de 3 alvos de citocinas, clique no X para excluir esferas de citocinas da lista de carga de contas.
3. Atualize cada campo com o tipo de conta apropriado, alvo de citocinas e localização de importação.
   NOTA: O software CAS carregará automaticamente cada esfera de captura de citocinas na ordem de brilho decrescente do Cy5, independentemente de como as entradas de carregamento das contas estejam organizadas.
4. Clique em Priorizado de Carga de APC com Controle para expandir a lista de carga da célula alvo. Se testar mais de 1 célula-alvo de controle e 1 linha-célula-alvo de amostra, adicione etapas adicionais de carregamento de células.
5. Atualize cada campo com o nome desejado da linha celular-alvo, campo de visão desejado (FOVs) para a caneta e critérios de seleção do APC (especificando o arquivo modelo de seleção da caneta alvo (TPS)).
6. Selecione Configuração de Carga de Células T e selecione Múltiplas Linhas de Células. Clique duas vezes em Priorizar Carga de Células T para expandir a lista de carga das células T.
7. Atualize cada campo com o nome desejado da linha de células T, os FOVs desejados para canear e os critérios de seleção das células T (especificando o arquivo modelo TPS).
8. Clique duas vezes no Ensaio de Citotoxicidade para expandir as configurações do ensaio de citotoxicidade. Atualize os campos de Configurações de Imagem específicas do fluxo de trabalho com a Duração do Ensaio desejada (h).
9. Clique duas vezes nos ensaios de fenótipo e citocinas para expandir o protocolo de coloração do ensaio de secreção de citocinas.
10. Atualize os campos On Chip Staining com o local de importação apropriado para as manchas primária e secundária.
11. Clique duas vezes em T Cell Descarga para expandir a lista de descarregamento. Atualize o campo # de Exportações por Chip (incluindo espaços em branco) para o número desejado de exportações. Salve e abra o fluxo de trabalho recém-criado.

7. Carga da esfera de captura de citocinas

1. Sonice e/ou vórtice cada frasco de contas para resuspender completamente as contas de captura. Determine a concentração da esfera usando um contador celular.
2. Ajuste as densidades das esferas para 4,5 x 10⁶ contas/mL (esferas Tipo A) ou 4 x 10^{esferas de 6} esferas/mL (Esferas Tipo B) em 30 μL de Buffer de Diluição de Contas.
3. Armazene as suspensões de talonas a 4 °C até que seja solicitado a carregar na baía de carga da amostra. Faça todas as verificações e prossiga clicando em Iniciar.
4. Quando solicitado, misture a suspensão da esfera de citocinas com uma pipeta de 20 μL e carregue a suspensão da esfera no local de importação apropriado. Clique no ícone Correr para prosseguir.
5. Quando solicitado, inspecione visualmente vários FOVs para verificar se as contas de captura foram carregadas com distribuição uniforme entre os canais fluídicos em densidade adequada. Se a distribuição e/ou densidade de carga estiverem subótimas, selecione Flush e Import para tentar novamente o carregamento por conta. Se a distribuição e densidade de carga fossem adequadas, selecione Prossiga para começar a fazer as contas de pene.
6. Repita o passo 7.3 para cada esfera de captura de citocinas.

8. Carga da célula-alvo

1. Determine a densidade de células vivas de cada linha-alvo por meio da coloração com Trippan Blue.
   NOTA: Este fluxo de trabalho assume que as células-alvo são provenientes de culturas ativas. Se as células criopreservadas forem usadas, certifique-se de que as células tenham sido cultivadas para pelo menos uma passagem após o descongelamento e estejam pelo menos 90% viáveis.
2. Colhe 1 x 10⁶ células-alvo em um tubo de microfúgio de 1,7 mL. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos em RT. Aspire o sobrenadante.
3. Resuspenda cada pellet da célula-alvo em 100 μL de Solução de Coloração Annexin V. Incubar por 30 minutos em tempo de descanso, protegido da luz.
4. Adicione 400 μL de 1x Annexin V Binding Buffer e resuspenda por pipetagem. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos em RT. Aspire o sobrenadante.
5. Resuspenda cada pellet da célula-alvo em 250 μL de Meio de Carga +_{CaCl 2}. Armazene as suspensões da célula-alvo a 4 °C até que seja solicitado a carregar na baía de carga da amostra.
6. Quando solicitado, resuspenda as células-alvo com uma pipeta de 200 μL e carregue a suspensão da célula-alvo no local de importação apropriado. Clique no ícone Correr para prosseguir.
7. Quando solicitado, inspecione visualmente vários FOVs para verificar se as células-alvo foram carregadas com uma distribuição uniforme entre os canais fluídicos em densidade adequada. Se a distribuição e/ou densidade de carga estiverem subótimas, selecione Flush e Import para tentar novamente o carregamento da célula alvo. Se a distribuição e densidade de carga fossem adequadas, selecione Proceder para iniciar o gate TPS.
8. Quando solicitado, navegue até Operações Manuais, clique em TPS e carregue o modelo de TPS solicitado.
9. Especifique o(s) filtro(s) óptico(s) e os FOVs a serem imagados para definir portas TPS, depois clique em Capturar Somente para iniciar a aquisição de imagem.
10. Abra o Editor de Configuração de Gates, clique na caixa de seleção para Annexin e selecione o canal apropriado para a coloração Annexin V para o Parâmetro X. No menu suspenso, selecione Log (Brilho Mediano Delta). Selecione OEP para o parâmetro Y. No menu suspenso, selecione Vizinho Mais Próximo.
11. Arraste os cantos da porta resultante para excluir^{as células} baixas do^{Annexin V} e do Vizinho Mais Próximo, depois salve o template TPS sem alterar o nome do arquivo.
12. Navegue de volta para Fluxos de Trabalho e clique em Continuar para prosseguir com a escritura. Repita os passos 8.7-8.11 para cada linha-célula-alvo.

9. Carga de células T

1. Determine a densidade de células vivas de cada linhagem de células T por meio da coloração com Trippan Blue.
   NOTA: Este fluxo de trabalho assume que as células T são obtidas de culturas ativas. Se as células criopreservadas forem usadas em vez disso, certifique-se de que as células tenham sido cultivadas durante a noite após o descongelamento e estejam pelo menos 90% viáveis.
2. Colhe 1 x^{10 6} células T em um tubo de microfúgio de 1,7 mL. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos em RT. Aspire o sobrenadante.
3. Resuspenda cada pellet da célula-alvo em 100 μL de Solução de Coloração Annexin V. Incubar por 30 minutos em tempo de descanso, protegido da luz.
4. Adicione 400 μL de 1x Annexin V Binding Buffer e resuspenda por pipetagem. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos em RT. Aspire o sobrenadante.
5. Resuspenda cada pellet de célula T em 250 μL de meio de carga +_{CaCl 2}. Armazene as suspensões das células T a 4 °C até que seja solicitado a carregar na área de carga da amostra.
6. Quando solicitado, resuspenda as células-alvo com uma pipeta de 200 μL e carregue a suspensão da célula T no local de importação apropriado. Clique no ícone Correr para prosseguir.
7. Quando solicitado, inspecione visualmente vários FOVs para verificar se as células T foram carregadas com uma distribuição uniforme entre os canais fluídicos em uma densidade adequada. Se a distribuição e/ou densidade de carga estiverem subótimas, selecione Flush e Import para tentar novamente o carregamento das células T. Se a distribuição e densidade de carga fossem adequadas, selecione Proceder para iniciar o gate TPS.
8. Quando solicitado, navegue até Operações Manuais, clique em TPS e carregue o modelo de TPS solicitado.
9. Especifique o(s) filtro(s) óptico(s) e os FOVs a serem imagados para definir portas TPS, depois clique em Capturar Somente para iniciar a aquisição de imagem.
10. Abra o Editor de Configuração de Gates, clique na caixa de seleção para Annexin e selecione o canal apropriado para a coloração Annexin V para o Parâmetro X. No menu suspenso, selecione Log (Brilho Mediano Delta). Selecione OEP para o parâmetro Y. No menu suspenso, selecione Vizinho Mais Próximo.
11. Arraste os cantos da porta resultante para excluir^{as células} baixas do^{Annexin V} e do Vizinho Mais Próximo, depois salve o template TPS sem alterar o nome do arquivo.
12. Navegue de volta para Fluxos de Trabalho e clique em Continuar para prosseguir com a escritura. Repita os passos 9.7-9.11 para cada linhagem de células T.

10. Ensaio de citotoxicidade

1. Prepare um meio de perfusão em um tubo cônico de 50 mL adicionando 100 μL do reagente NucView 530 Caspase-3 pré-descongelado a 20 mL de meio de células T (concentração original 1 mM, concentração final 5 μM).
2. Quando solicitado, troque o tubo cônico apropriado nos slots da baía de reagentes pelo tubo cônico preparado contendo o Meio de Perfusão. Clique no ícone Correr para prosseguir.
   NOTA: 20 mL de meio de perfusão são suficientes para perfundir um único chip optofluídico por 24 horas. Prepare meios de perfusão adicionais se o ensaio de citotoxicidade for para durar mais de 24 horas.
3. Se desejar, encerre quaisquer etapas restantes do ensaio de citotoxicidade após 14 horas clicando em Pular o restante da imagem TPS e prossiga com o fluxo de trabalho.

11. Ensaio de fenótipo e citocinas

1. Prepare a solução primária de coloração em um tubo microfuge de 1,7 mL misturando 76 μL de Anticorpos de Detecção Multiplex Humanos CD8/NK e 4 μL de anti-CD137_BV421.
2. Misture pipetando e armazene a 4 °C até ser solicitado a carregar. Quando solicitado, misture a solução primária de coloração com uma pipeta de 20 μL e coloque no local de importação apropriado. Clique no ícone Correr para prosseguir.
3. Prepare a solução secundária de coloração em um tubo microfuge separado de 1,7 mL, misturando 72 μL de 1x DPBS com 8 μL do kit multiplex SA-PE.
   NOTA: A solução secundária de tingimento deve ser preparada antecipadamente, de modo que esteja pronta para carregar assim que a coloração primária for concluída.
4. Misture pipetando e armazene a 4 °C até ser solicitado a carregar. Quando solicitado, misture a solução secundária de coloração com uma pipeta de 20 μL e coloque no local de importação apropriado. Clique no ícone Correr para prosseguir.

12. Análise de ensaio

1. Navegue até a área de trabalho e abra o software Assay Analyzer . Selecione Analisador de Ensaios, selecione Fluxos de Trabalho e depois selecione o tipo de fluxo de trabalho a ser analisado.
2. Use quaisquer critérios desejados para definir canetas de interesse para descarregar. Gerar a lista de descarregamento de acordo com os critérios desejados, depois retorne ao software CAS e selecione Continuar o fluxo de trabalho selecionado.
3. Verifique essa caixa de seleção para a lista de Criar exportação com o Anay Analyzer para: [ID do chip optofluidics] está marcada.

13. Descarregar

1. Prepare uma placa de fundo arredondado de 96 poços com 50 μL de meio de célula T por poço. Clique em Continuar para prosseguir com o descarregamento da célula.
2. Quando solicitado, abra a baía de carregamento do chip, abra a tampa do nest e remova o chip optofluídico. Coloque o chip em uma placa de Petri estéril, com a borda superior do chip optofluídico elevada >1° para evitar que as células saiam das canetas. Armazene em uma incubadora de cultura de tecido estéril durante a próxima etapa de lavagem.
3. Coloque um Flush estéril no ninho vazio, feche a tampa do ninho e depois feche a baía do chip. Clique em Finalizado e depois Continue.
4. Quando solicitado, abra a baía de carregamento do chip, abra a tampa do ninho e remova o chip Flush. Coloque o chip optofluídico no ninho vazio, feche a tampa do ninho e feche a baía do chip. Clique no ícone de corrida para prosseguir.
5. Quando solicitado, selecione Abrir para exibir o menu Carregar/Descarregar Placa do Poço . Clique em Descarregar para remover a placa anterior. Atualize o ID da placa do poço e o tipo da placa do poço, selecione Carga e depois selecione Feito.
6. Clique em Continuar para prosseguir com o descarregamento da célula. Depois que todas as canetas desejadas estiverem descarregadas, navegue até Operações Manuais e abra a baia do chip para recuperar a placa contendo as células de interesse.

Results

Usando o protocolo descrito, desafiamos células T CAR simuladas, CAR e c-Jun com superexpressão, com células tumorais K562 da Figura 3 negativas ou positivas para antígenos, ou deixando-as não estimuladas (apenas células T). As células-alvo foram avaliadas quanto à expressão homogênea do antígeno como pré-requisito para resultados reprodutíveis (Figura Suplementar 3). Devido ao seu isolamento em nanopens simples, conseguimos caracterizar os perfis de expressão de citocinas dessas células como produtores simples, duplos ou triplos, dependendo da condição testada (Figura 3). Esses resultados foram verificados usando o ELISA como método estabelecido para detecção de citocinas (Figura Suplementar 4).

Como esperado, a maioria das células T mock-nucleofetadas permaneceu negativa para as três citocinas medidas (TNF-α, IFN-γ e IL-2). Entre as células CAR T padrão, produtores de citocinas IFN-γ duplas, triplas e simples, assim como pequenas frações de células secretoras de TNF-α e IL-2, foram detectadas após desafio de antígeno, enquanto a exposição a células tumorais antigênico-negativas não induziu secreção multicelular de citocinas. Curiosamente, a superexpressão de c-Jun aumentou a proporção de produtores de dupla e tripla citocina, bem como células secretoras de citocinas únicas, no momento do encontro com o alvo, reduzindo assim a fração total de células citocinas negativas em comparação com células T CAR padrão. Esses resultados são consistentes com relatórios anteriores que descrevem a modulação fenotípica das células CAR T por expressão forçada desse fator^{de transcrição 6}. Notavelmente, observamos uma proporção maior de células IFN-γ-positivas no grupo apenas de células T do que no grupo de células tumorais antigênicas negativas, o que pode ser devido ao menor número de células analisadas nessa condição.

Para investigar mais a fundo a ativação das células T, avaliamos a expressão de CD137 em células T CAR simuladas, CAR e com superexpressão de células CAR individuais com superexpressão de nucleofecção, tratadas conforme descrito acima (Figura 4 e Tabela Suplementar 1). O desafio de células CAR T com células-alvo K562 que expressam antígeno resultou em aumento da expressão de CD137 em comparação com células mock-nucleofetadas. Além disso, observamos uma tendência para uma fração ligeiramente maior de células CD137-positivas entre células CAR T que superexpressam c-Jun em comparação com o produto padrão da CAR.

Em conclusão, o protocolo descrito permitiu a avaliação da secreção e ativação de citocinas das células CAR T no nível de célula única, possibilitando a identificação de produtores de citocinas unicelulares e multicelulares e a recapitulação das tendências fenotípicas anteriormente descritas no nível⁶ em massa.

Figura 1: Fluxo de trabalho esquemático para perfilamento multimodal via uma plataforma optofluídica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas de diferentes recursos da plataforma optofluídica. (A) Importar a sequência de partículas individuais em canetas individuais via OEP. As canetas na parte esquerda das imagens foram carregadas na sequência anterior. (B) Eventos de morte em três currais individuais ao longo do tempo, mostrando células tumorais expressando antígenos com GFP. (C) Exportação de uma célula individual de uma caneta via OEP. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Análise representativa dos perfis de secreção de citocinas no nível de célula única. Células T mock-nucleofetadas individuais ou células CAR-T foram cultivadas na presença ou ausência de células tumorais K562 negativas ou positivas para antígenos dentro de nanopentos contendo esferas de captura de citocinas para TNF-α, IL-2 e IFN-γ. Gráficos circulares mostram as proporções de células CAR-T individualmente desenhadas individualmente com o perfil indicado de secreção de citocinas após 24 horas de co-cultura (análise de desfechos). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Análise representativa da expressão de CD137 no nível de célula única. Células T mock-nucleofetadas individuais ou células CAR-T foram coloridas para expressão superficial de CD137 no chip optofluídico, 24 horas após a cultura, na presença ou ausência de células tumorais K562 negativas ou positivas para antígenos. Gráficos de violino mostram a intensidade de fluorescência da expressão de CD137 em células T e células CAR-T simuladas após 24 horas de cultivo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Componentes do meio T cell (Filtrado estéril usando unidades de filtro a vácuo 0,22μM)	Volume (concentração final)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
β-Mercaptoetanol (50mM)	0,5 mL (45μM)
Soro humano (inativado por calor)	50 mL (9%)
Suplemento GlutaMAX (100x)	5mL (0,9x)
Componentes do meio celular tumoral	Volume (concentração final)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
Soro de Bezerro Fetal (inativado por calor)	50 mL (9%)
Componentes do buffer MACS	Volume (concentração final)
DPBS (Mg2+-livre, Ca2+-livre)	500 mL
Soro de Bezerro Fetal (inativado por calor)	2,5 mL (0,5 %)
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
Componentes de buffer PBS/EDTA	Volume (concentração final)
DPBS	500 mL
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
Componentes do meio de carregamento	Volume (concentração final)
Meio de células T	18 mL
Reagente de Carregamento	2 mL
Meio de Carregamento + Componentes CaCl2	Volume (concentração final)
Mídia de Carregamento	499 μL
CaCl2	1,25 μL
Meio de perfusão + substrato de caspase	Volume (concentração final)
Meio de células T	20 mL
Substrato Caspase-3 NucView 530 (1 mM em DMSO)	100 μL
Componentes do buffer de diluição por esferas	Volume (concentração final)
DPBS	800 μL
BSA (2% em termos de compensação)	100 μL (0,2% w/v)
Pré-adolescente-20 (10% de trabalho)	10 μL (0,1% em v/v)

Tabela 1: Preparação de mídia e de tampão.

Figura suplementar 1. Estratégia exemplar de gating para avaliar a eficiência de transferência gênica antes do enriquecimento magnético. Gráficos exemplares de contorno e histograma estão mostrando a estratégia de gate para identificar células T CAR expressas (tEGFR-positivas) após a transferência gênica realizada. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2. Controle de pureza após a separação. Gráficos de contorno exemplares representam frações de células T CAR expressas (tEGFR-positivo) após a realização da separação magnética. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3. Expressão de antígeno em células-alvo tumorais. Gráficos histogramáticos representativos mostram células tumorais WT K562 ou foram modificados para expressar ROR1 coloridos com anticorpo isotipo ou direcionado a ROR1 por citometria de fluxo. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4. Detecção de citocinas usando ELISA padrão. Concentrações de IL-2 e IFN-γ no sobrenadante após 24h de co-cultura com células tumorais^{K562 ROR1} em E:T de 4:1, conforme medido via ELISA para células CAR vs CAR+cJ T. Significância estatística determinada pelo teste t não pareado com *P≤ 0,05, **P≤ 0,01, ***P≤ 0,001, ****P≤ 0,0001. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 1: Células analisadas. A tabela indica o número de células individuais analisadas por condição. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O fluxo de trabalho demonstrado permite a avaliação do perfil de secreção e ativação de citocinas de células CAR-T individuais durante a co-cultura com células-alvo antigênico-positivas e negativas, que podem ser opcionalmente combinadas com avaliação da atividade citolítica. Embora a capacidade de capturar dados funcionais multimodais em resolução de célula única ofereça uma forma de analisar o desempenho das células T CAR com precisão sem precedentes, a quantificabilidade das medições depende fortemente da precisão da tecnologia OEP ao carregar o mesmo número de esferas de captura de citocinas, células-alvo e células CAR-T em cada caneta. Portanto, é fundamental garantir que a densidade de carga e os critérios de TPS de cada reagente ou amostra de célula estejam otimizados para permitir o carregamento de esferas únicas e/ou células únicas em cada caneta. Embora adaptar a concentração da suspensão da esfera ou célula nos canais de fluidica possa permitir carregamento adequado da caneta, as opções de Flush e Import da plataforma servem como uma estratégia adicional para tentar novamente o processo de carregamento.

Uma característica vantajosa do design do chip optofluídico é a segregação do layout da caneta em 22 FOVs distintos. Ao carregar células T projetadas com diferentes construções CAR em diferentes FOVs dentro do chip optofluídico, também conseguimos avaliar se uma construção alternativa que imponha a superexpressão de c-Jun poderia potencializar a geração de células CAR-T com funcionalidade multimodal, em relação a uma construção padrão de CAR (Figura 3 e Figura 4). Dessa forma, uma plataforma optofluídica oferece meios para identificar rapidamente construtos candidatos a CAR que podem ter potencial para aumentar a durabilidade da remissão do câncer induzida por células CAR-T. Vale ressaltar que a análise da interação entre células-alvo e efetoras no nível de célula única exige controle crucial de parâmetros-chave, por exemplo, a heterogeneidade da expressão do antígeno-alvo em células tumorais e a pureza da população de células CAR-T (Figura Suplementar 2 e Figura Suplementar 3).

Embora tenhamos focado na avaliação da secreção de IL-2, TNF-α e IFN-γ, a ampla gama de analitos solúveis que podem ser detectados com painéis comerciais de captura de citocinas multiplex permite uma considerável personalização do fluxo de trabalho. Desenvolvimentos recentes destacam que o campo também está avançando na direção da citometria de fluxo de alta dimensão, abrindo novas possibilidades para sinergias com o perfilamento funcional de diferentes tipos de células^{imunes 12,13}. Por exemplo, aplicações futuras podem envolver campanhas de triagem para identificar células T reguladoras (Tregs) que expressam CAR polifuncionais. Esses secretam múltiplas citocinas anti-inflamatórias, como TGF-β e^IL-10-14. Assim, a adaptabilidade de um sistema optofluídico pode abrir caminho para insights críticos à medida que as imunoterapias celulares se expandem para novas fronteiras no tratamento de doenças não malignas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nucleofector 4D	Lonza
Microesferas de antibiotina	Miltenyi Biotec	130-090-485
Dinabeads CD3/CD28	Thermo Fisher	11131D
Kit de isolamento CD8+ T cell	Miltenyi Biotec	130-096-495
Tubos cônicos CELLSTAR de 15 ml (PP)	Greiner Bio-One	188271-N
Tubos cônicos CELLSTAR de 50 ml (PP)	Greiner Bio-One	227261
Corning 75cm² Frasco de cultura celular inclinado em forma de U com tampa de vedação do plugue	Corning	430720U
Placas de múltiplos poços Costar Clear 24 poços tratados com TC, enroladas individualmente, estéreis	Corning	3526
Placas de Múltiplos Poços Transparentes Costar de 48 Poços, Enroladas Individualmente, Estéreis	Corning	3548
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Thermo Fisher	14190169
Ímã DynaMag-15	Thermo Fisher	12301D
EGFR (Erbitux, Cetuximab)	Eli Lilly	NDC 66733-948-23	para conjugação interna (biotina)
Anticorpo EGFR (C225 (Cetuximabe)) [Alexa Fluor 647]	Novus Biologicals	NBP2-75903AF647
Soro Bovino Fetal, Valor	Thermo Fisher	A5256801
Suplemento GlutaMAX (100x)	Thermo Fisher	35050038
IL-2 Humano IS, grau premium	Miltenyi Biotec	130-097-748
Soro Humano	Deutsches Rotes Kreuz (DRK)/ Cruz Vermelha Alemã (GRC)	N/A
Coluna de separação de células MACS, LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Kit de Célula Primária 4D-Nucleofector X P3	Lonza	V4XP-3032
Pancoll humano, Densidade: 1,077 g/ml	PanBiotech	P04-60500
Kit de Detecção de Apoptose PE Annexin V I	BD em Biociências	559763
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)	Thermo Fisher	15140122
Kit de Biotinilação e Isolamento da Superfície Celular Pierce	Thermo Fisher	A44390
Kit de Partida QuadroMACS (LS)	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI 1640 Médio, Suplemento de Glutamax, HEPES	Thermo Fisher	72400054
Pipetas sorológicas 2, 5, 10, 25 e 50 ml	Greiner Bio-One	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
Tintura Trippan Blue (0,4%)	Thermo Fisher	15250-061
UltraPure 0,5  M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher	15575020
β-Mercaptoetanol (50mM)	Thermo Fisher	31350010
Reagentes de baliza
Placa de 96 poços com fundo arredondado	Corning	3799
Chip Beacon Plastic Flush		500-00030
Solução de Limpeza BLI, hipocloito de sódio, 0,825%	Bruker	520-08000
Albumina Sérica Bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A4161
Anticorpo anti-humano Brilliant Violet 421 CD137 (4-1BB)	Biolenda	309820
Cloreto de cálcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
LEGENDplex Humano IFN-& gama; Capturas B3, 13X	Biolenda	740545
LEGENDplex Esfera de Captura IL-2 Humana A5, 13X	Biolenda	740934
Anticorpos de Detecção do Painel Th Humano LEGENDplex V02	Biolenda	741041
LEGENDplex Humano TNF-α Captura Bead B7, 13X	Biolenda	740711
LEGENDplex SA-PE	Biolenda	740452
Substrato de Caspase-3 NucView 530, 1 mM em DMSO	Hö Izel	B-10406
OptoSelect Chip 3500	Bruker	500-12001
Azida de Sódio	Sigma-Aldrich	S2002
PRÉ-ADOLESCENTES 20	Sigma-Aldrich	P1379
Buffer de Exportação Vegana	Bruker	520-00040
Garrafas VWR Media, Square, PETG, 125ml	VWR	216-2265
Garrafas VWR Media, Square, PETG, 500ml	VWR	216-2267
Aditivo de Molhação	Bruker	520-08016
Solução molhante	Bruker	520-00009