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Artigo de método

Efeitos Terapêuticos do Extrato de Acorus Calamus L. em Lesão Cutânea Induzida por Radiação em um Modelo de Rato

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DOI:

10.3791/69705

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9 de janeiro de 2026

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1Department of Nuclear Medicine, General Hospital of Northern Theater Command, 2College of Medicine and Biological Information Engineering, Northeastern University, 3Shenzhen Institute for Advanced Study, University of Electronic Science and Technology of China

Neste artigo

Resumo

A lesão cutânea induzida por radiação é uma complicação comum e grave da radioterapia em pacientes com câncer. Não existe um tratamento clínico eficaz. Este protocolo avalia o efeito terapêutico do extrato de Acorus calamus L. sobre lesões cutâneas induzidas por radiação, com o objetivo de fornecer novos candidatos a medicamentos e estratégias terapêuticas para sua prevenção clínica e tratamento.

Resumo

A lesão cutânea induzida por radiação é uma complicação comum e debilitante na terapia do câncer, frequentemente resultando em tardio na cicatrização da ferida e aumento do desconforto do paciente. Existem alguns medicamentos terapêuticos disponíveis para prevenção ou tratamento. A Medicina Tradicional Chinesa, especificamente Acorus calamus L., demonstrou potencial no tratamento de vários distúrbios de pele, mas sua eficácia em lesões cutâneas induzidas por radiação ainda é pouco explorada.

Este estudo utilizou um modelo de rato Sprague-Dawley exposto a radiação de 45 Gy para induzir lesão na pele. Os ratos foram tratados com extrato de Acorus calamus L. com 10%, 20% e 40% por 45 dias. Cicatrização de feridas, inflamação, apoptose e angiogênese foram avaliadas utilizando taxas de cicatrização de feridas, análise histopatológica, medições de citocinas, coloração TUNEL e imunohistoquímica. O tratamento com Acorus calamus L. acelerou a cicatrização da ferida, com o grupo de dose média apresentando a maior taxa de cicatrização (88,97% aos 45 dias). A análise histopatológica revelou redução da inflamação, melhora na organização do colágeno e formação de novos vasos sanguíneos. Os níveis séricos de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α) foram significativamente reduzidos, e a apoptose foi diminuída, com modulação das principais proteínas apoptóticas (P53, Bax, Bcl-2). A expressão de VEGF e bFGF foi aumentada, promovendo angiogênese e reparação tecidual. Acorus calamus L. melhora a cicatrização de lesões cutâneas induzidas por radiação ao reduzir a inflamação, inibir a apoptose e promover a angiogênese. Essas descobertas sugerem seu potencial como agente terapêutico para o manejo de danos cutâneos induzidos por radiação, oferecendo uma alternativa promissora para o manejo de lesões cutâneas induzidas por radiação em oncologia clínica. Estudos adicionais são necessários para esclarecer seus mecanismos moleculares.

Introdução

A lesão cutânea induzida por radiação é uma complicação frequente e difícil tanto de acidentes nucleares quanto de radioterapiatumoral 1. Na radioterapia, cerca de 95% dos pacientes desenvolvem algum grau de dano na pele, incluindo eritema, descamação, úlceras necróticas recorrentes, dor persistente e risco elevado de progressãomaligna 2. Essas lesões são frequentemente refratárias ao tratamento, reduzindo substancialmente a qualidade de vida dos pacientes e, às vezes, exigindo a interrupção da radioterapia, representando assim um grande desafio clínico na oncologiaradioterápica 3. Os mecanismos subjacentes do dano cutâneo induzido pela radiação são complexos, envolvendo principalmente a produção de radicais livres nos tecidos da pele, o que interrompe os processos celulares e agrava o processo decicatrização 4,5. Isso resulta na expressão prolongada de genes relacionados à apoptose, respostas inflamatórias desreguladas e vias de sinalização alteradas, todos contribuindo para a natureza persistente das feridas induzidas porradiação 6.

Atualmente, não existe uma terapia universalmente aceita como padrão ouro para lesão cutânea induzida por radiação. O manejo clínico enfatiza abordagens anti-inflamatórias ouantioxidantes 7, notadamente corticosteroides tópicos, que reduzem as reações cutâneas por meio de efeitos anti-inflamatórios, imunossupressores e vasoconstritores, mas podem causar afinamento da pele com usoprolongado 8. Amifostina, um agente radioprotetor aprovado pela FDA, é limitada em uso clínico devido a efeitos adversossignificativos 9. Os fatores de crescimento aceleram a cicatrização da ferida ao promover a proliferação celular, angiogênese e formação de tecido de granulação, mas suas ações são restritas, oferecem controle limitado sobre lesão e inflamação dos tecidos profundos, e apresentam risco de hiperplasiaexcessiva 7. Consequentemente, a Medicina Tradicional Chinesa (MTC) chamou atenção por sua filosofia holística, múltiplos constituintes ativos com diversos efeitos terapêuticos e um perfil de segurança favorável. Estudos anteriores mostraram que produtos naturais, como extrato de alcaçuz, polissacarídeos de aloe e curcumina, aliviam inflamações e danos teciduais induzidos pela radiação ao eliminar radicais livres, inibir mediadores pró-inflamatórios (TNF-α, IL-6) e promover a proliferação defibroblastos 10,11,12. No entanto, a maioria dessas investigações examina compostos ativos únicos ou alvos únicos, fornecendo uma compreensão inadequada sobre os mecanismos de ação sinérgica multicomponente. Acorus calamus L., uma planta bem conhecida por suas propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes, antibacterianas e cicatrizadoras de feridas, demonstrou potencial em diversos distúrbios de pele.

Acorus calamus L., uma erva perene da família Araneae, contém vários compostos bioativos, incluindo terpenos, fenilpropanoides, flavonoides, esteroides e alcaloides. Sua composição multicomponente permite a ação simultânea em múltiplos alvos, produzindo efeitos farmacológicossinérgicos 13. Estudos mostram que ele inibe vias de sinalização inflamatória como NF-κB e MAPK e que regula negativamente a expressão de mRNA de fatores pró-inflamatórios, como TNF-α e IL-6, enquanto aumenta as atividades de enzimas antioxidantes como SOD e GSH-Px, exercendo assim efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes eantibacterianos 14,15. Apesar de seus benefícios documentados no tratamento de condições de pele causadas por infecções e alergias, o papel do Acorus calamus L. nas lesões cutâneas induzidas por radiação ainda é pouco explorado. Estudos recentes demonstraram seus efeitos protetores contra danos induzidos pela radiação, promovendo a cicatrização de feridas e reduzindo ainflamação 13. No entanto, os mecanismos terapêuticos específicos do Acorus calamus L. em lesões cutâneas induzidas por radiação ainda não foram totalmente esclarecidos.

O objetivo geral deste estudo é avaliar os efeitos terapêuticos do extrato de Acorus calamus L. em modelos animais de lesão cutânea induzida por radiação. Avaliamos a cicatrização de feridas, respostas inflamatórias e comportamento celular para elucidar os mecanismos de ação do extrato sob múltiplas perspectivas. Os achados visam estabelecer uma base teórica para o uso do Acorus calamus L. no manejo clínico de lesões cutâneas decorrentes da radioterapia contra o câncer. Além disso, o estudo apresentará as características funcionais do extrato, cenários de intervenção adequados e dados centrais de eficácia para ajudar os leitores a julgar se essa abordagem baseada em produtos naturais complementa suas necessidades de pesquisa ou clínicas. Em última análise, esse trabalho busca opções terapêuticas eficazes para melhorar a qualidade de vida dos pacientes que recebem radioterapia tumoral.

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Protocolo

Os experimentos com animais descritos neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Médica Animal do Northern Theater Command General Hospital (Número de Aprovação Ética: 2018-03). Ratos machos SD de grau SPF (6-8 semanas, peso 190-220 g) foram usados para o estudo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Abrigo dos animais experimentais

  1. Selecione ratos machos SD com 108 FPS, com idade entre 6 e 8 semanas e peso entre 190 e 220 g.
  2. Mantenha a temperatura ambiente do animal em 22 ± 2 °C, umidade relativa em 50 ± 5% e um ciclo claro para escuro de 12 horas. Permita que os ratos tenham acesso irrestrito a comida e água. Após um período de aclimatação de uma semana, prossiga para os experimentos de acompanhamento.

2. Agrupamento de animais

  1. Distribuir aleatoriamente os ratos em cinco grupos distintos: Grupo normal (Normal, n = 18), Grupo modelo (Modelo, n = 18), grupos positivos de medicamentos (Positivo, n = 18, Creme de Betametona)16, Grupo experimental de baixa dose (Experimental-L, n = 18), Grupo experimental de dose média (Experimental-M, n = 18) e grupo experimental de alta dose (Experimental-H, n = 18). Exceto pelo grupo normal, todos os grupos foram expostos à radiação.

3. Estabelecer um modelo animal de lesão radioativa na pele

  1. Administrar anestesia com precisão e desconforto mínimo por meio de injeção intraperitoneal (i.p.) de uma solução pentobarbital de sódio a 1% (40 mg/kg). Confirme a profundidade da anestesia observando a ausência do reflexo corneano e a ausência de resposta ao beliscão dos dedos. Aplique pomada nos olhos dos ratos para evitar o ressecamento.
  2. Remova os pelos traseiros dos ratos com um barbeador elétrico. Depois, desinfete a região das costas com iodo e álcool 75%.
  3. Coloque cada rato em posição deitada. Fixe o irradiador 32P-β (taxa de dose superficial: 0,9 Gy/min) sobre a região bilateral da coluna vertebral (2 cm × 2 cm de área) centralizada 1 cm lateralmente à linha média, garantindo que a fonte entre em contato com a epiderme sem folga. Fixe o aplicador com fita médica estéril para evitar deslocamento durante a irradiação. Irradie a área da pele alvo por 50 minutos para alcançar uma dose total absorvida de 45 Gy17.
  4. Quando o rato recuperar a consciência após a irradiação, deva-o à sua gaiola individual, garantindo acesso à água e alimento ad libitum, mantendo temperatura em 22 ± 2 °C, umidade relativa em 50 ± 5% e um ciclo claro e escuro de 12 horas.
    NOTA: O processo experimental deve seguir rigorosamente os princípios estabelecidos de proteção ocupacional biológica e radioativa. Além disso, todos os procedimentos operacionais devem seguir diretrizes para o descarte adequado e conforme de resíduos médicos e radioativos, garantindo a segurança e saúde de todo o pessoal envolvido.

4. Preparação do extrato de Acorus calamus L. e administração de medicamentos

  1. Pese os rizomas de Acorus calamus L., garanta uma limpeza completa, deixe secar ao ar livre e moa até formar um pó grosso (malha 40). Incorpore de 10 a 20 volumes de etanol 50% e homogeneize em temperatura ambiente por 24 horas
  2. Após deixar o extrato assentar por 30 minutos, decante o sobrenadante e realize a filtração preliminar através de 4 a 8 camadas de gaze para eliminar impurezas grosseiras. Em seguida, filtre-se usando papel de filtro e evapore o filtrado sob pressão reduzida em um evaporador rotativo a 50-60 °C para recuperar o solvente, resultando em um resíduo sólido livre de solvente (AE, teor de umidade < 5%).
  3. Preparação da pomada AE18
    NOTA: Formule pomadas de extrato de Acorus calamus L. 10% (Experimental-L, c/w), 20% (Experimental-M, c/w) e 40% (Experimental-H, c/w) de acordo com a Edição 2020 da Farmacopeia Chinesa (Capítulo Geral 0109)19.
    1. Pese corretamente o AE (por exemplo, 20 g para pomada a 20%) e o petrolato de grau farmacêutico correspondente (por exemplo, 80 g para pomada a 20%).
    2. Adicione 10% do petrolato total ao AE, triture vigorosamente por 5 minutos para formar uma pasta homogênea (método de diluição geométrica, garantindo que o AE se disperse uniformemente na base lipofílica).
    3. Derreta o petrolato restante a 60 °C, esfrie até 55 °C e adicione lentamente à pasta de AE-petrolato.
    4. Mexa magneticamente a 250 rpm por 30 minutos a 55 °C, depois mexa continuamente enquanto resfria até a temperatura ambiente para obter uma pomada lisa e sem partículas.
    5. Preparação de controle em branco: derreter petrolato a 60 °C, mexer a 250 rpm por 30 minutos e esfriar até temperatura ambiente (idêntico à base da pomada AE).
    6. Armazene todas as pomadas e o petrolato em branco a 4 °C em recipientes estéreis e selados.
  4. Todos os grupos receberam agentes administrados topicamente duas vezes ao dia, às 09:00 e 17:00, por 45 dias consecutivos após a irradiação (o grupo normal, não irradiado, recebeu o mesmo cronograma de administração sincronizada). A dose aplicada foi de 0,2 g/cm², distribuída uniformemente em uma área de pele dorsal de 2 cm × 2 cm. O grupo normal recebia veículo (petrolato), e o grupo de modelos recebia veículo (petrolato). O grupo controle positivo recebeu creme de betametasona. Os grupos experimentais L, M e H receberam cremes contendo AE em 10%, 20% e 40% (peso e volta), respectivamente. Após cada aplicação, a área tratada foi suavemente massageada por 10 segundos para melhorar a absorção, e os ratos foram contidos por 5 minutos para evitar que sejam lambidos.

5. Coleta de tecido de pele e sangue de rato

  1. Anestesie os ratos usando uma solução de pentobarbital de sódio a 1% (40 mg/kg, i.p.). Desinfete instrumentos cirúrgicos e retire a pele ao longo do local da ferida.
  2. Fixe uma porção do tecido em paraformaldeído a 4% (10 mL), outra porção em glutaraldeído/tetróxido de ósmio (5 mL, 2,5%) e preserve o restante em nitrogênio líquido para análise posterior (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Colete amostras de sangue da aorta abdominal do rato. Centrifugar a 3.000 × g a 4 °C por 15 minutos; aspirar o sobrenadante em tubos EP; aliquota e armazene a -80 °C.

6. Avaliação de cura

  1. Observe a ferida nos dias 7, 15, 30 e 45 após a irradiação e tire imagens da superfície da ferida com uma câmera de alta definição. Importe as imagens para o ImageJ e desenhe a área da ferida ao longo da borda do ferimento. Calcule a área na imagem. Certifique-se de que cada operação seja consistente para evitar erros de medição. Calcule o tempo de cicatrização e a taxa de cicatrização da ferida.
    NOTA: Taxa de cicatrização da ferida (%) = (Área inicial irradiada - Área da ferida não cicatrizada) / Área inicial irradiada. Critérios para cicatrização de feridas: Cicatrização completa é definida como área com crosta < 5% da área da ferida ou área cicatrizada > 95% da área da ferida. Área irradiada inicial: a área da ferida medida no momento em que animais irradiados apresentaram uma ferida estável (uma linha de base).

7. Exame por microscopia eletrônica

  1. Amostragem rápida e fixação de tecidos
    1. Utilize uma lâmina afiada para extirpar um bloco de tecido cutâneo medindo 1 mm³, abrangendo a camada epiderme-derme.
    2. Imerga imediatamente a amostra em um tampão fosfato de glutaraldeído pré-resfriado (0,1 M, pH 7,4) a 4 °C por 24 horas para fixação.
  2. Lavagem com tampão
    1. Realize três lavagens com 0,1 M de fosfato tampão (pH 7,4), permitindo 15 minutos para cada lavagem.
  3. Pós-fixação
    1. Faça a transição da amostra para uma solução de tetróxido de ósmio a 1% a 4 °C para fixação com duração de 1,5 h.
  4. Desidratação por gradiente
    1. Passando progressivamente pelas concentrações de acetona de 50%, 70%, 80%, 90% e 100%, alocando 15 minutos a cada etapa.
    2. Repita o tratamento com acetona 100% três vezes, com cada imersão durando 10 minutos.
  5. Embedding de resina epóxi
    1. Deixe a amostra de molho em uma mistura 2:1 de acetona e resina epóxi por 2 horas, seguida de imersão durante a noite em resina epóxi pura.
    2. Polimerize a amostra a 60 °C por 48 horas para formar um bloco sólido.
  6. Seccionamento e coloração
    1. Produza seções ultrafinas de 70 nm usando um ultramicrotomo.
    2. Tinga com acetato de urânio por 15 minutos, depois com citrato de chumbo por 5 minutos a 60 °C.

8. Coloração por Hematoxilina-Eosina (HE)

  1. Realizar a incorporação de parafina
    1. Excisar amostras de pele, desidratar usando um gradiente de álcool (por exemplo, 70%, 80% e 95% etanol, cada um por 15 minutos, seguido por duas mudanças de 100% etanol, cada por 15 minutos), e posteriormente transferir para xileno até que o tecido atinja um estado translúcido.
    2. Submerga em parafina para garantir a incorporação, depois permite a solidificação.
  2. Execute a deceração e a reidratação
    1. Imerga as seções de parafina em xileno I/II por 10 minutos cada.
    2. Enxague xileno com 100% etanol, depois imerga em etanol 95% por 3 minutos, 80% etanol por 3 minutos, 70% etanol por 3 minutos e, finalmente, enxágue com água destilada.
  3. Conduza a coloração nuclear por hematoxilina
    1. Deixe de molho na solução de hematoxilina de Harris por 7 minutos em temperatura ambiente.
    2. Enxágue sob água corrente por 10 minutos até aparecer a coloração azulada.
  4. Diferenciação e contra-coloração de implementos
    1. Diferencie usando 1% de ácido clorídrico em etanol por 3 s (observe a clareza nuclear ao microscópio).
    2. Contra-tinga com uma solução de amônia 0,5% por 30 segundos.
  5. Realizar contracoloração de eosina
    1. Tinga com uma solução de eosina a 0,5% (contendo 1% de ácido acético glacial) por 90 segundos.
    2. Enxágue rapidamente com água destilada por 5 segundos para remover o excesso de mancha.
  6. Executar desidratação e limpeza
    1. Passam sequencialmente por 70%, 80%, 95%, 100% etanol I/II (1 min cada).
    2. Limpe com xileno I/II por 2 minutos cada.
  7. Aplicar vedação e observação
    1. Aplique resina neutra no sentido das gotas e depois cubra com uma capa de cobertura.
    2. Seque em um forno a 60 °C por 30 minutos antes do exame microscópico.

9. Coloração tricroma de Masson

  1. Realize a deceração rotineira de forma semelhante à antes da coloração HE.
  2. Coloração nuclear
    1. Deixe de molho em solução de hematoxilina por 10 minutos.
    2. Enxágue sob água corrente por 5 minutos até o tom azul voltar a ser restaurado.
  3. Coloração por fibras de colágeno
    1. Imerga em uma mistura de Alizarina Vermelha e Fucinina Ácida por 5 minutos.
  4. Diferenciação de ácidos fosfomolilíbdicos
    1. Transfira para uma solução aquosa de ácido fosfomolíbdico a 1% por 1 minuto.
  5. Contracoloração de miofibras
    1. Transfira diretamente para uma solução azul de anilina a 2,5% por 5 minutos.
    2. Enxágue rapidamente com uma solução aquosa de ácido acético glacial 0,5% por 5 segundos.
  6. Desidratação e montagem
    1. Executar desidratação por etanol gradiente: 95% etanol I, 100% etanol II (30 s cada).
    2. Limpe com xileno.
    3. Monte usando resina neutra, seque a 60 °C e depois examine ao microscópio.

10. Detecção ELISA dos níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α

NOTA: IL-1β, IL-6 e TNF-α são citocinas pró-inflamatórias importantes, comumente usadas para avaliar tanto a presença quanto a intensidade da inflamação. Monitorar seus níveis é fundamental para obter insights sobre os processos inflamatórios e para determinar a eficácia dos tratamentos anti-inflamatórios.

  1. Prepare amostras de soro
    1. Siga o protocolo detalhado no Passo 5.3 para coletar amostras de soro.
  2. Padrões e amostras diluídas
    1. Criar uma diluição de gradiente de padrões utilizando o diluente da amostra; Dilua as amostras de soro na proporção de 1:4.
  3. Adicione amostras e incube
    1. Introduza 100 μL do padrão/amostra em cada poço; cobrir os poços com uma membrana; incubar a 37 °C por 90 minutos; Depois, descarte o líquido e sece os poços.
  4. Detectar reação anticorpo-enzima
    1. Dispense 100 μL de reagente marcado por enzimas específico para IL-1β, IL-6 e TNF-α em cada poço; incubar a 37 °C por 60 minutos; remova o líquido e sece; lave a placa quatro vezes com 200 μL de tampão de lavagem.
    2. Adicionar 100 μL de solução de trabalho estreptavidina-HRP (diluição 1:100) a cada poço; incubar a 37 °C no escuro por 30 minutos; lave a placa quatro vezes com 200 μL de tampão de lavagem.
  5. Desenvolver cor e terminar
    1. Introduza 100 μL de solução de substrato TMB em cada poço; incubar em temperatura ambiente no escuro por 10 minutos; posteriormente, adicione 50 μL de solução de parada a cada poço.
  6. Dados de leitura
    1. Meça a absorvância a 450 nm (com comprimento de onda de calibração de 630 nm) usando um leitor de ensaio imunossorvente ligado a enzimas em até 30 minutos; calcule a concentração (pg/mL) utilizando a curva padrão.

11. Ensaio TUNEL

  1. Pré-tratamento de seção
    1. Dewax e parafina desidratam seções até que cheguem à água destilada.
    2. Introduza uma solução de trabalho de proteinase K em concentração de 20 μg/mL e incube a 37 °C por 20 minutos.
    3. Lave as seções três vezes com PBS, com cada lavagem durando 2 minutos.
  2. Reação de rotulagem
    1. Aplique a mistura de reação TUNEL contendo a enzima TdT e dUTP marcada com fluoresceína.
    2. Incube em uma câmara umidificada a 37 °C no escuro por 60 minutos.
  3. Conversão de sinal
    1. Lave três vezes com PBS, deixando 5 minutos para cada lavagem.
    2. Introduza um anticorpo anti-fluoresceína marcado com HRP em diluição de 1:500.
    3. Incube a 37 °C por 30 minutos.
  4. Desenvolvimento cromogênico DAB
    1. Após a lavagem com PBS, aplique solução cromogênica DAB e monitore o desenvolvimento ao microscópio por 1 a 3 minutos.
    2. Pare a reação usando água destilada.
  5. Contra-tintura e montagem
    1. Contra-colorir núcleos com hematoxilina por 1 minuto.
    2. Desidrate usando etanol graduado, transparente com xileno e monte com resina neutra.
  6. Interpretação do resultado
    1. Identifique núcleos apoptóticos como amarelo-amarelados, enquanto núcleos normais aparecem azuis.
    2. Selecione aleatoriamente cinco campos de alta potência (400×) por slide para calcular a taxa de apoptose.

12. Coloração imunohistoquímica

  1. Desceramento e recuperação de antígenos
    1. Deixe de molho em seções de parafina em Xylene I por 10 minutos, depois transfira para Xylene II por mais 10 minutos. Em seguida, desidrate usando uma série de etanol gradiente, começando com 5 min em 100% Etanol I, seguido por 5 min em 100% Etanol II, 3 min em 95%, 80% e 70% etanol, e finalmente enxágue com água destilada por 2 min.
    2. Realize reparação térmica em alta pressão com um tampão de citrato de sódio de 0,01 M a pH 6,0, mantendo uma temperatura de 121 °C por 3 minutos.
  2. Bloquear interferência endógena
    1. Introduza uma solução de 3%H2O2 em temperatura ambiente por 10 minutos para inativar enzimas endógenas.
    2. Aplique uma solução bloqueadora de BSA a 5% no tecido e incube em uma câmara umidificada a 37 °C por 45 minutos; Aspire qualquer solução bloqueadora em excesso sem enxaguar.
  3. Incubação de anticorpos
    1. Dispense uma solução bloqueadora de BSA a 5% e incube a 37 °C por 30 minutos.
    2. Adicione a solução primária de trabalho de anticorpos na concentração otimizada (por exemplo, P53, Bax, Bcl-2, VEGF e bFGF) e incube durante a noite em uma câmara umidificada a 4 °C; lave três vezes com tampão PBS-T contendo 0,1% Tween-20 por 5 minutos cada.
    3. Introduzir um anticorpo secundário marcado com HRP diluído em 1:200; incubar em uma câmara umidificada a 37 °C por 60 minutos; lave três vezes com PBS-T buffer por 5 minutos cada. Depois, adicione a solução conjugada ABC e incube a 37 °C por 30 minutos, seguido por três lavagens com PBS buffer por 5 minutos cada.
  4. Desenvolvimento de cor DAB
    1. Adicione uma solução reveladora de DAB contendo 0,02% de H₂O₂ e monitore o desenvolvimento ao microscópio em temperatura ambiente por 1 a 4 minutos.
    2. Encerre imediatamente a reação com água destilada.
  5. Contra-tintura e montagem
    1. Mergulhe a amostra na solução de hematoxilina de Harris por 1 minuto e enxágue sob água corrente por 10 minutos para obter a recuperação azul.
    2. Imerga sequencialmente nas seguintes soluções: 70% de etanol por 30 segundos, 80% de etanol por 30 segundos, 95% de etanol por 30 segundos, 100% etanol I por 1 minuto e 100% etanol II por 1 minuto.
    3. Para limpeza completa e fixação, imerga no xileno I por 2 minutos, depois transfira para o xileno II por 2 minutos. Adicione a resina neutra para montagem no meio a gota, cubra com uma capa de cobertura e sece em um forno a 60 °C por 30 minutos.
  6. Quantificação de resultados
    1. Uma cor marrom indica uma reação positiva; Sinais positivos (amarelo-marrom) devem ser contrastados com o fundo negativo.
    2. Utilize o software Image-Pro Plus para calcular a porcentagem de células positivas em pelo menos 5 campos de visão.

13. Detecção de Western blot

  1. Preparação para lise de tecidos
    1. Introduza tecido de pele congelado em nitrogênio líquido em uma argamassa de aço inoxidável pré-resfriada a -80 °C; adicionar gradualmente nitrogênio líquido em três incrementos para mitigar a vaporização; moer verticalmente até que todas as partículas não fiquem mais visíveis; transfira o pó resultante para um tubo EP contendo tampão de lise.
    2. Incorporar inibidor de protease (1:100) e inibidor de fosfatase (1:50); vórtice no gelo por 30 s; conduzir a interrupção ultrasônica; incubar a 4 °C em uma incubadora agitada por 2 horas; centrífuga a 4 °C, 14.000 × g por 20 minutos; Aspire cuidadosamente o sobrenadante.
  2. Quantificação e processamento de proteínas
    1. Dispensar 5 μL do sobrenadante em uma placa de 96 poços; adicionar 200 μL de solução de trabalho BCA; incubar a 37 °C no escuro por 30 minutos; meça a absorvância a 562 nm usando um leitor de microplaca; Determine a concentração de acordo com a curva padrão.
    2. Combine o Tampão de Carga Proteica Reduzida 5× com a solução proteica em uma proporção de 4:1; desnaturalizar colocando em banho-maria fervente por 15 minutos; armazene a -20 °C para uso futuro.
  3. Eletroforese SDS-PAGE
    1. Prepare um gel resolvedor de acrilamida a 12%; Despeje o gel até atingir 1 cm abaixo dos dentes do pente; cubra com isopropanol para evitar a exposição ao ar; após a solidificação, remova o isopropanol; Despeje um gel concentrador a 4%; insira um pente de 15 poços; permitir solidificação em temperatura ambiente por 30 min; adicionar 5 μL de marcador proteico pré-colorido ao poço de carga 1; adicionar 20 μL de lisato em branco ao poço 2; adicionar 10 μL de amostra contendo 40 μg de proteína em cada poço de 3 a 14.
    2. Iniciar eletroforese a 80 V; mudar para 120 V quando o azul de bromofenol migrar para o gel separador; manter uma temperatura de 10-15 °C com circulação de água gelada; Corra até que o azul de bromofenol atinja 0,5 cm a partir do fundo do gel.
  4. Procedimento de limpeza úmida
    1. Prepare um tampão de transferência contendo 20% de metanol; pré-resfriamento a 4 °C. Ative a membrana PVDF mergulhando-a em metanol por 1 minuto; equilibre a membrana NC em buffer. Monte a grampa de transferência nesta ordem: "Placa de cátodo - Almofada de esponja - Papel filtro - Gel - Membrana - Papel filtrante - Almofada de esponja - Placa de ânodo"; remova completamente qualquer bolha com um rolo; definir parâmetros de acordo com o peso molecular da proteína alvo: para proteínas < 50 kDa, usar uma transferência de tensão constante a 100 V por 60 min; para proteínas de 50-100 kDa, aplicar uma transferência de corrente constante a 250 mA por 90 min; para proteínas > 100 kDa, implemente uma transferência constante de corrente a 300 mA por 120 min; conecte-se a um banho-maria circulante de 4 °C.
  5. Procedimento de imunodetecção
    1. Após a transferência, imerga a membrana PVDF em metanol por 1 minuto; lave três vezes com TBST por 5 minutos cada; cobrir a superfície da membrana com 3% de H₂O₂/TBST; incubar em temperatura ambiente no escuro por 15 minutos; aspire o líquido; adicionar uma solução bloqueadora de 5% de BSA/TBST; bloqueio por 1 h em uma incubadora agitadora a 37 °C; lave a membrana três vezes com TBST por 5 minutos cada.
    2. Adicionar a solução principal de trabalho de anticorpos (como P53, Bax, Bcl-2, VEGF e bFGF); incubar durante a noite a 4 °C em uma incubadora agitada; lave a membrana quatro vezes com TBST por 10 minutos cada; adicionar anticorpos secundários marcados com HRP; incubar em uma incubadora agitada em temperatura ambiente por 90 minutos; lave a membrana seis vezes com TBST + 0,5% SDS por 8 minutos cada.
  6. Imagem por quimioluminescência
    1. Misturar volumes iguais de soluções ECL A e B; revestem uniformemente a superfície da membrana; permitir que a reação ocorra no escuro por 60 s; aspire qualquer líquido em excesso; definir um tempo de exposição entre 1 e 5 s para proteínas de sinal forte; realizar exposição cumulativa em cinco segmentos (10/30/60/120/300 s) para proteínas sinal fracas; Capture imagens usando um imageador de quimioluminescência.
  7. Fluxo de trabalho de análise de dados
    1. Quantificar proteínas utilizando o software ImageJ; estabelecer um limiar uniforme de subtração de fundo; calcular a razão em escala de cinza da proteína alvo em relação à proteína de referência (β-actina ou GAPDH)
    2. Importe os dados para o GraphPad Prism para análise.

14. Análise estatística

  1. Apresente os dados por média ± erro padrão de média. Utilize testes t de amostras independentes para comparações entre dois grupos e utilize ANOVA unidirecional para comparações entre múltiplos grupos.
  2. Analise dados usando SPSS 26.0 e GraphPad Prism 8.0.2.
  3. Considere P < 0,05 como indicativo de diferenças estatisticamente significativas.

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Resultados

Efeito terapêutico do Acorus calamus L. na lesão cutânea induzida por radiação
15 dias após a irradiação, todos os grupos de ratos apresentaram descamação seca, vermelhidão localizada, inchaço, ulceração e crostas. Aos 30 dias após a irradiação, o grupo modelo apresentou o dano cutâneo mais severo, com crostas e ulcerações no local irradiado atingindo seu pico. Aos 45 dias, o grupo modelo mostrou queda mínima de crosta, e a ferida apresentou alguma contração. Em contraste, os grupos Acorus calamus L. ...

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Discussão

A lesão cutânea induzida por radiação continua sendo uma das complicações mais comuns e desafiadoras na radioterapia clínica do câncer. Como o maior órgão e o primeiro alvo da radiação, a pele é suscetível a danos causados por radicais livres e espécies reativas de oxigênio produzidas pela radiação, que podem prejudicar funções celulares, incluindo divisão celular, migração e diferenciação, levando a tardio na cicatrização das feridas e danosaos tecidos 20,21...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelo Plano Conjunto do Plano de Ciência e Tecnologia da Província de Liaoning (Projeto de Enfrentamento Técnico) (2024JH2/102600273) e pelo Projeto de Pesquisa Independente do Hospital Geral do Teatro Norte (ZZKY2024001, ZZKY2024002, ZZKY2024003).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de Fixação com Paraformaldeído 4%Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaP0099
Extrato de Acorus calamus L.Preparado internamenteN/A   O protocolo detalhado de preparação está descrito na Seção 4 do Protocolo.
Anticorpo Anti-Bax    Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB11690
Anticorpo Anti-Bcl-2Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB113375
Anticorpo anti-bFGFProteintech Group, Inc. (Wuhan, Hubei, China)11234-1-AP
Anticorpo Anti-P53  Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB111740
Anticorpos Anti-VEGF  Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB111971
Kit de Ensaio de Proteína BCA  Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)G2026-200T
Creme de Betametona.  United Pharmaceutical Co., Ltd. (China)N/A Concentração: 0,1% em termos
Aprovação Nacional de Medicamentos nº: H19994057
EtanolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.E111991Usado como solvente de extração para o extrato de Acorus calamus L.
Sistema de Imagem Gel e BlotBio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, EUA)ChemiDoc MP
Kit de Stain com Hematoxilina-EosinaBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., (Pequim, China) e nbsp;  G1120
HRP conjugado Cabrita Anti-Coelho IgG (H+L)Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB23303
Microscópio de Fluorescência InvertidaOlympus Corporation (Tóquio, Japão)IX83   
Masson' s Kit de Mancha TricromáticaBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., (Pequim, China) e nbsp;  G1340
Leitor de Microplacas (para absorvida, fluorescência e detecção de luminescência)Dispositivos Moleculares (San Jose, CA, EUA)SpectraMax iD3
petrolatoSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Xangai, China)N/A   Petrolato branco de grau farmacêutico ; Ponto de fusão: 45-60 °C; C;  Aprovação Nacional de Medicamentos nº: H31022350
Rat IL-1 & beta; Kit ELISA   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaPI303
Rat IL-6 ELISA Kit    Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaPI328
Rat TNF-α Kit ELISA   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaPT516
Kit de Detecção de Apoptose (DAB) para Células TUNELBeyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaC1091

Referências

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