Análise de DNA microbiano em campo usando um kit de extração biológica de campo e uma unidade qPCR de campo

Summary

Formas confiáveis e precisas de análise de DNA implantável em campo são cruciais para muitas indústrias. Este artigo oferece dois métodos para análise microbiana ambiental em campo: 1) o isolamento de DNA microbiano de amostras ambientais usando um kit de extração biológica de campo, e 2) a análise do DNA via unidade qPCR de campo.

Abstract

À medida que a PCR quantitativa (qPCR) é adotada mais amplamente em diversos setores, a capacidade de extrair e analisar DNA em ambientes remotos sem obstáculos logísticos está se tornando essencial. Um exemplo claro é a necessidade de ferramentas simples para quantificar bactérias degradadoras de contaminantes em locais remotos afetados por descarrilamentos de trens ou liberações de petróleo, permitindo uma avaliação oportuna de riscos e impacto ambiental. Para alcançar isso de forma confiável, os processos devem ser portáteis e leves, fáceis de usar para não cientistas, resistentes à contaminação e capazes de entregar resultados rápidos, mantendo ainda um rigoroso controle de qualidade. Embora existam opções tanto para extração de ácidos nucleicos quanto para análise de qPCR fora do laboratório há anos, só recentemente avanços tecnológicos permitiram o desenvolvimento de sistemas implantáveis em campo capazes de desempenho confiável e preciso. Neste estudo, demonstramos o uso de um kit de extração de DNA de campo acoplado a instrumentos portáteis de qPCR sob condições ambientais realistas. Testes de campo realizados em temperaturas ambientes externas de aproximadamente 30 °C demonstraram rendimentos de DNA e eficiências de amplificação comparáveis às obtidas em ambientes laboratoriais controlados. Importante destacar que os resultados obtidos em campo demonstraram sensibilidade e reprodutibilidade equivalentes, confirmando que fluxos de trabalho portáteis podem fornecer dados de alta qualidade sem a necessidade de infraestrutura laboratorial convencional. Essas descobertas destacam o potencial de análises moleculares descentralizadas que expandem o alcance da qPCR para ambientes remotos e com recursos limitados, mantendo a precisão e confiabilidade necessárias para a tomada de decisões.

Introduction

Ao considerar análises biológicas moleculares, como a qPCR, existem várias limitações para o manejo da amostra. Um exemplo claro é a demanda por ferramentas simples e confiáveis para quantificar bactérias degradadoras de contaminantes em locais remotos impactados por descarrilamentos de trens ou liberações de petróleo, apoiando a avaliação oportuna de riscos e impactos ^ambientais 1,2,3,4,5. A principal limitação é que, não importa o quão fria você mantenha a amostra, as comunidades microbianas podem (e vão) mudar ao longo do^{tempo 6,7}. Para garantir que os dados reflitam com precisão o ambiente original de onde as amostras foram coletadas, recomenda-se que o DNA seja extraído dessas amostras em até 24 horas^{e 8}. Para um engenheiro coletando amostras microbianas em uma plataforma petrolífera offshore, ou para um cientista no interior de uma floresta tropical, essa linha do tempo não é viável. Levar uma amostra de água ou solo de um desses locais remotos para uma empresa de transporte no mesmo dia e depois enviar uma noite para um laboratório (tudo isso mantendo a refrigeração), onde o DNA pode ser extraído antes da análise, é simplesmente impossível.

Uma vez extraído o DNA, o relógio para, e toda a informação genética da amostra é preservada indefinidamente com técnicas adequadas de armazenamento⁹. Isso torna o DNA extraído incrivelmente único em comparação com a grande maioria das amostras químicas, metalúrgicas e biológicas – a maioria das quais tem vida útil limitada. DNA arquivado pode ser recuperado anos ou décadas depois e analisado em busca de novos alvos em novas plataformas. Por essa razão, é crucial que o DNA extraído represente verdadeiramente a comunidade microbiana original, e não a alterada causada pelo atraso do transporte.

Além disso, a exigência de um laboratório extrair e analisar as amostras limita muito tanto a flexibilidade quanto a consistência nos programas de amostragem. O custo da logística sozinho pode ser proibitivo para certos^{projetos 10}. A capacidade de analisar amostras, quantificando com precisão alvos genéticos de interesse em poucas horas ou até minutos após a amostragem, abre muitas portas para projetos ambientais ao redor do mundo.

Protocol

NOTA: O protocolo a seguir foi realizado usando um Bio-Extract Kit (kit de extração biológica de campo) e o FieldQuant qPCR (Field-based qPCR).

1. Amostragem de biomassa de águas subterrâneas e protocolo de isolamento de DNA usando um filtro encapsulado e um kit de campo de extração biológica

1. Use luvas e óculos de proteção em todas as etapas do passo 1.
2. Prepare a bomba peristáltica e a tubulação e purge o poço usando purga de volume padrão, seguindo a orientação¹¹ de Amostragem de Águas Subterrâneas da Agência de Proteção Ambiental (EPA).
3. Remova o filtro encapsulado, o adaptador, a gramposa e as tampas do tubo da centrífuga fornecido (Figura 1).
4. Passe o tubo (1/4-5/16 de diâmetro interno [I.D.]) pela gramposa fornecida e aperte a grampa para fixar a mangueira ao adaptador de travamento (Figura 2).
5. Conecte a entrada do filtro ao adaptador Luer-Lock instalado na etapa anterior.
6. Coloque o filtro dentro de um recipiente receptor para que a quantidade de água filtrada possa ser medida com precisão.
7. Filtre até 1 L de água usando baixas vazões (<0,5 L/min). A quantidade de água filtrada varia dependendo da turbidez da água.
   1. Se o filtro entupir antes de 1 L ser filtrado, pare e continue para a próxima etapa.
      NOTA: A análise de DNA é sensível e pode ser realizada com apenas 10 mL, dependendo da biomassa do sistema.
8. Registre manualmente o volume que passou pelo filtro em mililitros (mL). Descarte a água filtrada.
9. Tampe o filtro nas duas extremidades. Certifique-se de que a extremidade mais fina esteja fechada com a tampa vermelha e a extremidade mais grossa fechada com o plugue branco Luer-Lock.
10. Coloque o filtro de volta no tubo plástico fornecido.
11. Coloque a etiqueta no tubo da centrífuga e anote a quantidade de água que passou pelo filtro, a localização, a data da amostragem e as análises solicitadas. Armazene a 1-4 °C até ser extraído.
    NOTA: Os filtros devem ser extraídos dentro de 24 horas após a amostragem.
12. Usando os lenços de preparação com álcool incluídos, limpe uma superfície plana que possa ser usada para preparar a extração (por exemplo, uma tábua de madeira, porta traseira de caminhão, etc.)
13. Para extrair o DNA, coloque todos os componentes do campo de extração biológica Kit sobre a superfície plana e limpa (Figura 3).
    1. Destape as duas extremidades do filtro e separe as tampas para uso posterior. Encontre e abra uma das seringas de 3 mL incluídas no kit. Puxe ar para dentro da seringa de 3 mL e conecte-a ao filtro pela conexão de travamento do luer.
    2. Empurre o ar para fora da seringa para expulsar qualquer água restante do filtro. Desconecte a seringa e puxe mais ar antes de repetir.
    3. Repita várias vezes, garantindo que o máximo de água possível seja expulso do filtro. Refaça a tampa vermelha da saída.
14. Inverta a seringa Solução A fechada várias vezes para garantir que ela esteja bem misturada. Remova a tampa da seringa que trava o luer.
15. Conecte a seringa da Solução A à entrada do filtro encapsulada de 0,2 μm via a ponta de travamento do luer e adicione lentamente toda a Solução A pressionando o êmbolo. Pressionar rápido demais pode causar pressão de retropressão, então certifique-se de abaixar o êmbolo lentamente. Se o entupimento do filtro estiver impedindo a adição da Solução A, remova a tampa vermelha da saída do filtro e tente novamente. Refaça o recorte do filtro.
16. Agite vigorosamente o filtro fechado com a mão por 5 minutos.
    NOTA: Para evitar fadiga, várias amostras podem ser preparadas até essa etapa, e todas podem ser apertadas manualmente ao mesmo tempo. Se disponível, um misturador de vórtice recarregável pode ser usado para realizar essa etapa, em vez de fazer o shake manual.
17. Inverta a seringa Solução B fechada várias vezes para garantir que esteja bem misturada. Remova a tampa de travamento do luer da seringa.
18. Remova a tampa de entrada do filtro encapsulada. Conecte a seringa da Solução B à entrada do filtro encapsulado via a ponta de travamento do luer e adicione lentamente toda a Solução B pressionando o êmbolo. Pressionar rápido demais pode causar pressão de retropressão, então certifique-se de abaixar o êmbolo lentamente. Refaça a tampa da entrada do filtro.
19. Agite vigorosamente o filtro fechado com a mão por 5 minutos.
    NOTA: Para evitar fadiga, várias amostras podem ser preparadas até essa etapa e todas serem apertadas manualmente ao mesmo tempo. Se disponível, um misturador de vórtice recarregável pode ser usado para realizar essa etapa, em vez de fazer o shake manual.
20. Remova a tampa de entrada.
21. Com o filtro invertido, pressione 1 mL de ar para dentro do filtro usando uma seringa de 3 mL presa à unidade de filtro encapsulada e depois puxe o êmbolo para remover o máximo possível do lisado (líquido).
    NOTA: Se o lisado for particularmente viscoso, pode ser necessário empurrar e puxar o êmbolo várias vezes para remover a solução do filtro.
22. Adicione o lisado a um tubo de 5 mL. Tampe o tubo e fele com parafilm na parte superior.
23. Agite vigorosamente o tubo com a mão por 5 minutos. Coloque o tubo na vertical enquanto continua com os passos.
    NOTA: Para evitar fadiga, várias amostras podem ser preparadas até essa etapa, e todas podem ser apertadas manualmente ao mesmo tempo. Se disponível, um misturador de vórtice recarregável pode ser usado para realizar essa etapa, em vez de fazer o shake manual.
24. Evitando a contaminação da tampa do alumínio, coloque o cartucho de preparação da amostra sobre uma superfície plana.
25. Retire a seringa de 1 mL da embalagem e rosqueie a coluna com travamento luer na extremidade da seringa. Use a ponta pontiaguda da coluna para fazer dois furos na primeira seção do cartucho de preparação de amostras.
    ATENÇÃO: Algumas seções do cartucho contêm sais caotrópicos e/ou etanol. Use luvas e óculos de proteção.
26. Usando uma pipeta volumétrica plástica, transfira 1 mL de lisato (apenas líquido, evite transferir esferas o máximo possível) do tubo de esferas para o furo recém-perfurado da primeira seção do cartucho de preparação da amostra. Para melhores resultados, adicione lentamente o lisado em um leve ângulo ao pipetar no furo da folha de alumínio.
27. Insira a coluna da seringa de volta na seção vermelha do cartucho. Puxe o fluido completamente para dentro da seringa e depois empurre-o para fora. Execute essa ação de bomba 10 vezes.
28. Empurre todo o fluido para fora da seringa e de volta para a seção vermelha do cartucho antes de passar para a próxima etapa. Nenhum líquido deve ser transferido de uma seção para outra – isso se aplica a cada etapa restante do protocolo de isolamento de DNA da amostra.
29. Posicione a ponta pontiaguda da coluna de seringas sobre a seção vermelho-alaranjada e perfure dois furos através da barreira de alumínio. Use o êmbolo para puxar o volume total da seringa do fluido até o alto e bombear totalmente para fora. Repita essa etapa uma vez para um total de 2 bombas, empurrando todo o líquido para fora. Não transfira nenhum líquido para a próxima etapa.
30. Posicione a ponta pontiaguda da coluna de seringas sobre a seção laranja e perfure dois furos através da barreira de alumínio. Use o êmbolo para puxar todo o volume do fluido da seringa para dentro e bombeie totalmente para fora. Não transfira nenhum líquido para a próxima etapa.
31. Posicione a ponta pontiaguda da coluna da seringa sobre a seção amarela e perfure duas vezes através da barreira de alumínio. Use o êmbolo para puxar todo o volume do fluido da seringa para dentro e bombeie totalmente para fora. Não transfira nenhum líquido para a próxima etapa.
32. Posicione a ponta pontiaguda da coluna de seringa sobre a seção azul seca ao ar e perfure a barreira de alumínio apenas uma vez. Use o êmbolo para puxar todo o volume de ar da seringa para dentro da seringa e bombee rapidamente de volta. Repita rapidamente essa ação de bombeamento no mínimo 20 vezes até que a coluna pareça seca.
33. Posicione a ponta pontiaguda da coluna de seringas sobre a seção verde final e perfure a barreira de alumínio duas vezes. Use o êmbolo para puxar todo o volume do fluido da seringa para dentro e bombeie totalmente para fora. Repita essa etapa para um total de 5 bombas.
34. Usando a seringa de 1 mL e a coluna de preparação da amostra, transfira toda a solução da seção verde para um microtubo bem marcado de 1 mL – esta é a amostra de DNA extraída no campo. Armazene a 1-10 °C (por exemplo, em um cooler usando gelo/bolsas de gelo, ou na geladeira, etc.) por até uma semana, ou até o uso.
    NOTA: Para armazenamento a longo prazo, amostras de DNA podem ser armazenadas a -20 °C indefinidamente.

2. Protocolo de análise qPCR baseado em campo usando uma unidade qPCR de campo

NOTA: O instrumento qPCR baseado em campo e o telefone que controla o instrumento dependem de baterias recarregáveis. Certifique-se de que ambos estejam totalmente carregados antes de ir ao campo.

1. Coloque até três amostras de DNA extraídas em campo nos slots puros da bandeja. Certifique-se de que haja uma amostra por seção: uma amostra nos slots 1, 2 ou 3, uma amostra nos slots 4, 5 ou 6, e uma amostra nos slots 7, 8 ou 9.
2. Coloque as tiras de ensaio para cada amostra nos respectivos slots A, B ou C na bandeja. Alinhe o primeiro poço na tira com o primeiro slot na bandeja.
3. Desbloqueie o telefone e abra o aplicativo nomeado em homenagem ao instrumento qPCR registrado como marca. O telefone e a unidade qPCR de campo conectam-se via wireless integrado de curto alcance. Quando o app abrir, toque no botão Iniciar Correr .
   NOTA: O aplicativo está pré-carregado no telefone incluído e não pode ser baixado em outro lugar.
4. Na próxima tela, toque no botão Criar IDs .
5. Nesta próxima tela, é onde as informações da amostra para cada amostra são inseridas; toque em ID de amostra e digite o nome da amostra.
   1. Extrai as unidades de amostra e selecione a unidade de volume apropriada para o tipo de amostra usada na extração (gramas [g], mililitros [mL] ou swab).
   2. Depois, bater abaixo da quantidade da amostra e digitar o volume da amostra usada na extração de campo acima (por exemplo, mililitros de água filtrados). Repita esse processo para as duas amostras restantes.
   3. Ao inserir as informações de amostra para todas as amostras completas, toque no botão continuar .
      NOTA: Se estiver usando menos de 3 amostras, deixe o ID da amostra como padrão, selecione qualquer unidade e digite um 1 na linha de quantidade de amostras para que as amostras não utilizadas prossigam.
6. Na próxima tela, toque na pasta. Mova para a próxima tela e toque em salvar na pasta atual.
7. Na próxima tela, digite o nome da execução e toque em confirmar.
8. Ligue o instrumento pressionando e segurando o botão de energia , localizado no canto superior esquerdo do instrumento, até que todas as luzes na frente do instrumento estejam acesas (~5 s). Depois, toque em confirmar no app para continuar.
9. Na próxima tela, toque conectar via Wi-Fi integrado de curto alcance. Pressione o botão wireless de curto alcance integrado (um símbolo familiar e registrado) no topo do instrumento até que a luz azul comece a piscar. Toque em confirmar e espere até que o app e o instrumento se sincronizem. Depois de sincronizadas, toque no nome do instrumento no app para selecioná-lo e depois toque no botão de conectar para continuar carregando as tiras de ensaio.
   NOTA: Se o instrumento e o aplicativo não sincronizarem na primeira vez, certifique-se de que a luz sem fio integrada de curto alcance no instrumento ainda esteja piscando e toque novamente.
10. Antes de remover as tampas das tiras de ensaio, verifique se os pellets liofilizados não estão no topo de nenhum dos poços de tiras de ensaio. Se estiverem, dê um toque suave no fundo do poço para fazer a pelota cair mais fundo no poço.
11. Remova as tampas dos tubos de tira para a primeira amostra. Adicione 18 μL de água estéril ao primeiro poço da tira de ensaio e pipete suavemente para cima e para baixo para dissolver o pellet. Repita para os dois poços restantes.
12. Adicione 2 μL da amostra a cada poço e sele os tubos inserindo um conjunto de tampas de borracha para ensaio nos tubos, com as ranhuras entre as tampas voltadas para a parte de trás da bandeja. Repita os passos 2.10-2.12 para as amostras restantes, se necessário. Depois que todas as tiras de ensaio estiverem preenchidas e seladas com tampas, toque em confirmar no app.
13. Remova cada tira de ensaio uma de cada vez e verifique se há bolhas no fundo dos poços. Se houver bolhas no fundo de qualquer um dos poços, balance suavemente a faixa para frente e para trás até que as bolhas subam em direção ao topo do poço. Depois que todos os poços forem verificados, toque em confirmar no app e proceda a carregar as tiras no instrumento.
14. Abra a tampa do instrumento e coloque as tiras de ensaio no instrumento qPCR de campo na mesma ordem e orientação que estão na bandeja, de modo que as dobradiças do poço e os entalhes entre as tampas fiquem voltadas para a parte de trás do instrumento. Depois que todas as tiras forem adicionadas, empurre suavemente a tampa para baixo até que trave no lugar e toque confirmar.
15. Toque no botão de iniciar corrida no app.
    NOTA: A corrida começará e levará ~45 minutos para ser concluída usando condições pré-definidas da corrida. Essas condições não são editáveis.
16. Quando a corrida terminar, toque nos resultados do e-mail. Uma vez que o telefone esteja no Wi-Fi, os resultados serão enviados para análise e relatório; até lá, os resultados são armazenados no instrumento.
    1. Uma vez conectado ao Wi-Fi, o usuário precisará apertar novamente o botão de enviar para enviar os resultados.
17. Limpe a bandeja entre as corridas para evitar contaminação entre as amostras.
    NOTA: A saída é um arquivo Excel contendo valores de limiar de ciclo (Ct) para cada poço. Esses resultados são enviados ao laboratório, que verifica a qualidade da amplificação e converte os valores de Ct em abundâncias usando curvas padrão validadas específicas para cada alvo de qPCR e com base no volume e matriz da amostra original. Esses resultados são enviados ao usuário como entregáveis eletrônicos, além de um PDF.

Results

A extração de DNA de amostras ambientais representativas foi realizada usando tanto o kit de campo de extração biológica quanto um método laboratorial altamente validado anteriormente^{descrito 4}. Como mostrado na Figura 4, a conclusão bem-sucedida do isolamento de DNA usando o kit de campo foi confirmada ao comparar os resultados da qPCR com um método de extração laboratorial altamente validado. Essa consistência confirma que o método preservou a integridade do DNA das amostras ambientais no campo.

Os componentes do kit de qPCR de campo são mostrados na Figura 5. A análise de uma diluição padrão de cultura de Dehalococcoides (DHC) usando a unidade qPCR de campo foi realizada tanto em temperaturas internas (21 °C) quanto externas (30 °C) para ilustrar a robustez do instrumento sob condições reais de campo. Os resultados, vistos na Figura 6, destacam o baixo desvio para 10 repetições diferentes de cada um. Para contexto completo, o DHC é um organismo capaz de degradar solventes clorados e é comumente quantificado via qPCR na indústria de remediação ambiental⁴.

Para validar a precisão dos instrumentos, o DHC foi analisado em três concentrações diferentes usando dez instrumentos qPCR de campo realizados em duplicados (Figura 7). Mesmo em abundâncias baixas, o desvio padrão relativo permaneceu baixo (abaixo de 5%) em todas as corridas. Note que, comparado ao desvio padrão, o desvio padrão relativo é importante para dados logarítmicos, pois normaliza os resultados através da seguinte equação:

Onde RSD é o Desvio Padrão Relativo, σ é o desvio padrão do conjunto de dados, e μ é a média do conjunto de dados.

Juntos, ambos os métodos deste artigo fornecem resultados reprodutíveis através de extrações de campo replicado e ensaios qPCR. O acordo entre extrações de campo e laboratoriais e análise qPCR demonstra que dados confiáveis e de alta qualidade podem ser obtidos sem depender da infraestrutura laboratorial, permitindo que análises microbianas sejam realizadas em ambientes remotos ou com recursos limitados.

Figura 1: Componentes do kit de filtro encapsulados. O filtro encapsulado é usado para filtrar a biomassa da amostra de água. Ao conectar a uma bomba peristáltica por meio de tubulação, a água é empurrada através do filtro. Após anotar o volume total de água, a água é descartada e a biomassa coletada no filtro fica pronta para extração de DNA. Componentes: a. tubo estéril que segura o filtro e os componentes antes e depois do uso, b. tampa de entrada, c. abraçadeira de mangueira, d. adaptador de conexão de tubo com travamento de luer, e. filtro encapsulado, f. tampa de saída de borracha. Imagem usada com permissão da Microbial Insights, ^Inc.12. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Conexão do filtro e do tubo. O tubo é empurrado sobre o adaptador de conexão de tubo com travamento de luer e é mantido no lugar usando a braçadeira de mangueira. A outra extremidade da tubulação está conectada a uma bomba peristáltica (essa conexão e a operação da bomba estão fora do escopo deste protocolo). Imagem usada com permissão da Microbial Insights, ^Inc.12. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Componentes do kit de isolamento de DNA no campo. Todos os componentes são estéreis antes do uso. Os componentes incluem: (1) kit de filtro encapsulado ( veja a Figura 1 para mais detalhes), (2) seringa de 3 mL, (3) seringa de 1 mL pré-carregada com a Solução A, tampo, (4) seringa de 1 mL pré-carregada com a Solução B, tampo, (5) seringa de 3 mL, (6) tubo de esferas de silicone, (7) seringa de 1 mL equipada com coluna de isolamento, (8) pipeta de transferência descartável de 1 mL, (9) cartucho de preparação para amostra de isolamento de DNA, (10) tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Não mostrado na foto: quadrados de parafilme para vedação durante a agitação, e lenços com álcool usados para limpar a superfície usada na extração. Imagem usada com permissão da Microbial Insights, ^Inc.12. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Comparação de extração de campo usando amostras do mundo real. Resultados comparativos de qPCR de DNA isolado de duas amostras representativas usando método laboratorial (barras vermelhas) versus o kit de campo de extração biológica (barras azuis). Esses não foram analisados em replicação, como seria esperado em uma análise qPCR padrão. Alvos gênicos (eixo x) apresentam abundância (eixo y) dentro de uma ordem de magnitude para ambos os métodos. Informações sobre cada alvo genético específico não estão incluídas, pois estão fora do escopo deste artigo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Instrumento e componentes de qPCR baseados em campo. Os componentes incluem: A. O instrumento qPCR baseado em campo, B. bandeja de preparação de amostras, C. tira de ensaio contendo reagentes liofilizados, D. telefone pré-carregado com aplicação usada para rodar o instrumento. Imagem usada com permissão da Microbial Insights, ^Inc.12. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Demonstração da robustez da qPCR em campo. O padrão Dehalococcoides (DHC) foi analisado em dez réplicas sob condições externas (30 °C, barras vermelhas) e internas (21 °C, barras azuis), destacando a confiabilidade do instrumento para o campo. O número de corrida replicado é listado ao longo do eixo x e a abundância calculada do DHC está listada ao longo do eixo y. A média interna (20 °C) foi calculada em 4,92 × 10² célula/mL, DS = 1,14 × 10² células/mL (n = 10), e a média externa (30 °C) foi calculada como 5,89 × 10² células/mL, DS = 1,80 × 10² célula/mL (n = 10). As medições obtidas em 20 °C e 30 °C não diferiram significativamente (teste t de Welch, p = 0,17). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Demonstração da precisão da qPCR em campo. Performance de precisão entre 10 instrumentos diferentes, executada em duplicado em três concentrações padrão diferentes. O valor verdadeiro e o número de replicação (n = 2 para 10 instrumentos em cada concentração padrão) são listados ao longo do eixo x, com barras coloridas específicas para a unidade de campo. O eixo y mostra a abundância calculada para cada execução. O desvio padrão relativo percentual para cada concentração padrão é mostrado nas linhas pontilhadas acima das barras. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussion

Uma característica crítica desse protocolo é que ele permite a extração de DNA microbiano e a análise qPCR em condições de campo, sem a necessidade de infraestrutura laboratorial ou^{eletricidade 12}. O método foi otimizado para equilibrar portabilidade com confiabilidade, fornecendo resultados reproduzíveis que são consistentes com fluxos de trabalho laboratoriais mesmo quando realizados ao ar livre sob uma faixa de temperaturas^{ambientes 12}. A faixa de uso sugerida é de 4 °C a 95 °C (39 °F a 104 °F), e a comparação lado a lado em temperaturas externas padrão (30 °C, 86 °F) para uma equipe de campo mostra consistência confiável (Figura 6). Essa consistência é essencial para garantir que os resultados de campo sejam interpretáveis junto com os conjuntos de dados laboratoriais.

Vários passos são cruciais para o sucesso do protocolo. Durante o processo de extração, a remoção completa do líquido dos filtros e a mistura cuidadosa dos reagentes são importantes para garantir a lise eficiente e a recuperação do DNA. Da mesma forma, a transferência cuidadosa do lisato para o cartucho de preparação da amostra, minimizando o remanescente das contas, é fundamental para evitar entupimentos ou falhas na coluna. Estratégias de solução de problemas incluem desacelerar a depressão do êmbolo para reduzir a contrapressão e repetir o bombeamento da seringa se lisados viscosos dificultarem o movimento do fluido. Para qPCR, evitar bolhas em poços de ensaio e garantir a resuspensão completa dos pellets são críticos para uma amplificação precisa.

Apesar de suas vantagens, o método apresenta limitações. Os rendimentos de DNA podem ser menores do que os obtidos com kits baseados em centrifugação de bancada, e amostras altamente turvas ou ricas em orgânica podem desafiar o desempenho da coluna. Embora os kits de isolamento sejam simples e fáceis de usar para qualquer pessoa – inclusive usuários sem experiência prévia em laboratório – há um risco adicional de erro ao comparar uma pessoa inexperiente no campo. Além disso, embora a unidade qPCR de campo forneça resultados rápidos, ela é restrita a um número limitado de reações simultâneas (atualmente limitada a 9 alvos gênicos por execução) em comparação com termocicladores padrão. Essas limitações, no entanto, são compensadas pela velocidade da análise e pela capacidade de capturar perfis de comunidades microbianas no campo. Não há limitação inerente sobre quais alvos qPCR podem ser analisados além do catálogo do laboratório que oferece a unidade.

A importância desse método está em sua capacidade de mobilizar análises moleculares, possibilitando o monitoramento em tempo real de populações microbianas em ambientes como campos petrolíferos, locais agrícolas ou ecossistemas remotos. Ao preservar a integridade do DNA no ponto da amostragem e gerar resultados no local, essa abordagem reduz barreiras logísticas, melhora a qualidade dos dados e permite a tomada rápida de decisões. Aplicações futuras podem incluir vigilância de patógenos em saúde pública, monitoramento do progresso da biorremediação ou avaliação de riscos microbianos em sistemas hídricos. Com pequenas modificações, a plataforma pode ser continuamente adaptada para alvos moleculares adicionais e ensaios qPCR emergentes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de silício 5/16"	Amazon (www.amazon.com)	796753613221	Modelos alternativos podem ser aceitáveis
Coolers	Grampos (www.staples.com)	24299978	Modelos alternativos podem ser aceitáveis
Kit de Campo de Isolamento de DNA	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/bio-extract/	Proprietário
Unidade qPCR de campo com acessórios	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/fieldquant/	Proprietário
Luvas	Amazon (www.amazon.com)	Depende do tamanho	Modelos alternativos podem ser aceitáveis
Filtros de água subterrânea	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
Gelo	Loja de conveniência local	NA
Bomba peristáltica Kamoer DIP1500 24 V 1500 mL/min de altura	Amazon (www.amazon.com)	701705886813	Modelos alternativos podem ser aceitáveis
Alicate de Ponta Fina	Amazon (www.amazon.com)	762983170575	Modelos alternativos podem ser aceitáveis
Papel toalha	Grampos (www.staples.com)	2126874	Modelos alternativos podem ser aceitáveis
Óculos de proteção	Amazon (www.amazon.com)	B0BNHKWR6W	Modelos alternativos podem ser aceitáveis
Marcador de ponta fina marcador	Amazon (www.amazon.com)	71641300033	Modelos alternativos podem ser aceitáveis