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Artigo de método

Isolamento e purificação de vesículas extracelulares vegetais de folhas de Arabidopsis usando um método otimizado de coleta por lavagem apoplástica

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DOI:

10.3791/69715

⸱

24 de março de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método otimizado para isolar vesículas extracelulares (EVs) das folhas de Arabidopsis thaliana para apoiar análises moleculares e funcionais posteriores.

Resumo

Vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas ligadas à membrana, secretadas por diversos organismos e tipos celulares, e são cada vez mais reconhecidas como importantes mediadoras da comunicação intercelular e entre reinos. Embora a biologia dos VE esteja bem estabelecida em sistemas mamíferos, a pesquisa sobre VE em plantas é relativamente recente e está em rápida expansão, impulsionada em parte por evidências de que os EVs de plantas podem fornecer pequenos RNAs, mRNAs, proteínas e outras cargas envolvidas na imunidade e nas interações planta-microrganismo. No entanto, isolar veículos elétricos de plantas de alta pureza continua sendo tecnicamente desafiador devido às paredes celulares rígidas, abundantes metabólitos secundários e ao risco de contaminação citosólica durante a coleta de fluidos apoplásicos. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho simplificado para o isolamento e purificação de VE vegetais a partir do tecido foliar de Arabidopsis thaliana . Uma etapa suave de infiltração baseada em seringa é usada para minimizar danos celulares e vazamentos citosólicos, enquanto o uso de lâminas individuais (sem pecíolos/tecido vascular) ajuda a reduzir a contaminação por conteúdo vascular e intracelular. Os EVs são inicialmente enriquecidos por centrifugação diferencial e podem ser ainda mais purificados usando fracionamento por gradiente de densidade de sacarose ou cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Esse protocolo proporciona EVs com integridade estrutural preservada e redução da contaminação celular ao minimizar danos celulares e vazamento citoplasmático durante a coleta de fluidos apoplásticos, conforme avaliado por análise de rastreamento de nanopartículas e microscopia eletrônica de transmissão. Essas amostras de EV são adequadas para aplicações posteriores, incluindo perfilamento de RNA, proteômica e ensaios funcionais para estudos de interação planta-microrganismo. No geral, esse método oferece uma abordagem reprodutível e adaptável para obter veículos elétricos de alta qualidade para usinas.

Introdução

Vesículas extracelulares (EVs) são partículas de membrana ligadas a duas camadas lipídicas secretadas por uma ampla variedade de organismos, desde bactérias até humanos 1,2. Em sistemas animais, os EVs são comumente classificados em exossomos, microvesículas e corpos apoptóticos com base em suas vias de biogênese e tamanho3. Exossomos (~30-150 nm de diâmetro) se originam da fusão de corpos multivesiculares (MVBs) com a membrana plasmática, levando à liberação de vesículasintraluminais 4, enquanto microvesículas (~100-1000 nm de diâmetro) brotam diretamente da membranaplasmática 5. Além de exossomos e microvesículas, células mamíferas também produzem corpos apoptóticos, que são liberados durante a morte celularprogramada 6. Essas vesículas têm sido implicadas na modulação imunológica, progressão tumoral e entrega terapêutica, tornando-as objeto de intensa pesquisabiomédica 7,8. Em plantas, a classificação de EV é menos bem definida do que em animais. Estudos em Arabidopsis thaliana identificaram múltiplos subtipos de EV de plantas com base em diferenças em marcadores proteicos, tamanho e vias de biogênese suposta. Incluem EVs tetraspaninas (TET) positivas, consideradas vesículas semelhantes a exossomos derivadas de corposmultivesiculares 9,10,EVs 11 positivos para a proteína sintaxina Penetração 1(PEN1), EVs derivadas de organelos positivos em exocisto(EXPO) 12,13, assim como outras populações de EVs como EVs14 relacionados à autofagia e polensomos15.

Evidências crescentes sugerem que as plantas secretam veículos elétricos como parte de sua estratégia de defesa contra patógenos. Os VE de plantas transportam diversas cargas moleculares, incluindo pequenos RNAs, mRNAs e outras moléculas regulatórias, que suprimem a virulência de patógenos fúngicos e oomicetos 10,16,17,18,19. Essas descobertas destacam os VE como veículos de "guerra de RNA", permitindo que as plantas suprimam diretamente a expressão gênica de patógenos, um mecanismo com profundas implicações para a proteção dasculturas 20. Além da imunidade, os EVs das plantas também podem contribuir para a remodelação da parede celular, respostas ao estresse e sinalizaçãodo desenvolvimento 21. Diferentemente da pesquisa em EVs animais, onde protocolos padronizados de isolamento e caracterização são amplamenteestabelecidos, o campo de VE em plantas ainda está em seus estágios formativos. Isso limita a reprodutibilidade e a comparabilidade entre estudos, criando uma necessidade urgente de metodologias robustas e padronizadas para isolar e estudar essas vesículas.

Isolar os VE das plantas apresenta desafios técnicos únicos que não são encontrados em sistemas animais. Tecidos vegetais danificados contêm abundantes metabólitos secundários, detritos da parede celular e fragmentos organelares que podem co-purificar com os EVs, complicando a caracterização ajusante 23. Além disso, o fluido de lavagem apoplástico (AWF), comumente usado como material de partida para isolamento e purificação de VE em plantas, frequentemente produz uma mistura heterogênea de vesículas econtaminantes 24. Embora a centrifugação diferencial continue sendo uma abordagem fundamental amplamente utilizada, ela não pode resolver totalmente subpopulações distintas de EVs ou separar EVs de complexos macromolecularesco-isolados 25,26. Revisões recentes e estudos metodológicos forneceram orientações importantes e considerações de melhores práticas para o isolamento e caracterização de VEem plantas 27,28,29,30,31. No entanto, a implementação prática e a integração dessas abordagens continuam sendo desafiadoras, e etapas adicionais de purificação, como centrifugação por gradiente de densidade e cromatografia por exclusão de tamanho, são frequentemente necessárias para melhorar a pureza e reprodutibilidade dos EV em todos os estudos.

Aqui, apresentamos um protocolo simplificado para isolar veículos elétricos do fluido de lavagem apoplástico Arabidopsis usando uma estratégia de purificação em múltiplas etapas. Em contraste com as abordagens comuns de isolamento de VE de plantas, que dependem da infiltração inteira da planta com bombasde vácuo 11, esse protocolo evita a inclusão de pecíolos e tecidos vasculares, o que pode aumentar a contaminação por estruturas vasculares. Em vez disso, são usados lâminas isoladas e um método de infiltração suave baseado em seringa para melhorar a coleta de apoplastos enquanto minimizam a perturbação tecidual. O manuseio cuidadoso das folhas, orientação e condições de centrifugação reduzem ainda mais a contaminação por componentes intracelulares, fornecendo um material de partida mais limpo para o isolamento dos veículos elétricos. Após centrifugação diferencial, os EVs podem ser ainda mais purificados usando fracionamento por gradiente de densidade de sacarose ou cromatografia por exclusão de tamanho para alcançar maior pureza e resolução das vesículas. As preparações resultantes para EVs são bem adequadas para aplicações posteriores, incluindo sequenciamento de RNA, perfil proteômico e ensaios funcionais como interação de patógenos e estudos de captação de EVs, melhorando assim a reprodutibilidade e a interpretabilidade em pesquisas de VE em plantas.

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Protocolo

NOTA: Realize etapas de centrifugação em uma centrífuga refrigerada a 4 °C para preservar a integridade do veículo elétrico. Devem ser usados tubos estéreis. Todas as etapas do manuseio da amostra devem ser realizadas rápida e eficientemente, idealmente por várias pessoas trabalhando em paralelo, para minimizar danos aos tecidos e evitar contaminações que possam comprometer a qualidade dos veículos elétricos.

1. Preparação e infiltração das folhas

  1. Prepare 1 L de tampão de isolamento de vesícula (VIB) composto por 20 mM de hidrato de mes, 2 mM deCaCl 2, 0,1 M de NaCl, pH 6.
  2. Colhe as zonas distais da lâmina cortando na base da lâmina para remover o pecíolo.
    NOTA: Pelo menos 100 plantas de quatro semanas por tratamento ou genótipo são recomendadas para garantir rendimento suficiente de EV. As plantas de Arabidopsis foram cultivadas em ciclos de 8 h de luz e 16 h de escuro. Não use folhas que mostrem sinais visíveis de estresse, como branqueamento ou murcha das folhas.
  3. Lave as folhas com água de osmose reversa (RO) três vezes. Coloque-as em papel toalha e sece-as suavemente.
  4. Coloque aproximadamente 50 mL de folhas em uma seringa de 120 mL. Bata levemente na seringa para acalmar as folhas.
  5. Adicione aproximadamente 60 mL de VIB na seringa até que as folhas fiquem totalmente imersas. Expulse o ar preso pressionando suavemente o êmbolo. Pressione um pedaço de parafilme dobrado quatro vezes na ponta da seringa para evitar vazamento.
    NOTA: Ao realizar infiltração a vácuo baseada em seringa, certifique-se de que a seringa e o êmbolo estejam bem montados antes de aplicar vácuo. Aplique força gradualmente e mantenha uma pegada firme na seringa para evitar movimentos bruscos do êmbolo ou perda de controle.
  6. Infiltre as folhas puxando lentamente o êmbolo para fora para criar um vácuo. Mantenha o êmbolo na posição estendida por 5 segundos e depois solte lentamente. Repita esse ciclo de infiltração 2-3 vezes até que as folhas pareçam mais escuras e translúcidas, indicando infiltração bem-sucedida.
  7. NOTA: Puxar o êmbolo requer força moderada devido à resistência ao vácuo. A seringa deve ser mantida firmemente enquanto o êmbolo é retirado lentamente para manter a infiltração controlada.
  8. Depois que as folhas forem infiltradas, retire o desentupidor. Despeje o excesso de buffer na pia.
  9. Repita os passos 1.4-1.7 até que todas as folhas colhidas estejam infiltradas (Figura 1A).

2. Coleta de líquido de lavagem apoplástico (AWF)

  1. Corte uma tira de fita adesiva de ~12 polegadas e coloque com o lado grudado para cima. Prenda uma das extremidades da fita envolvendo-a em uma seringa vazia e desnecessária de 1 mL, logo abaixo da extremidade mais larga. Organize cuidadosamente aproximadamente 50-70 folhas infiltradas em camadas sobrepostas ao longo da superfície pegajosa, posicionando-as de modo que a base de cada lâmina fique voltada para a seringa inferior e as pontas apontem para cima para coleta (Figura 1B).
    NOTA: Sobrepor várias folhas em uma única tira de fita ajuda a evitar danos. Alinhe todas as folhas com a pá voltada para uma extremidade e orientada para a parte inferior do tubo de coleta para permitir uma recuperação eficiente do fluido apoplástico durante a centrifugação.
  2. Enrole as folhas presas com fita firmemente ao redor da seringa, depois prenda o topo do feixe com duas tiras de fita adesiva. Insira a seringa enrolada em um tubo de 50 mL com a extremidade cortada das folhas e a base da seringa orientada para a parte inferior do tubo. Certifique-se de que as folhas estejam bem coladas, pois uma venda solta pode causar danos nas folhas e liberar células quebradas que contaminam o fluido de lavagem do apoplasto (Figura 1B).
  3. Centrifuge a seringa enrolada contendo folhas infiltradas a 900 × g por 10 minutos a 4 °C usando uma centrífuga refrigerada equipada com rotor de ângulo fixo. Colete o fluido de lavagem apoplástico em um novo tubo cônico de 15 mL e mantenha a amostra no gelo. Repita os passos 2.1-2.3 até que todas as folhas tenham sido usadas para coletar AWF.
    NOTA: O AWF precisa ser transparente, não verde ou mesmo verde claro. Um AWF verde indica a presença de cloroplastos/clorofila e também pode indicar contaminação celular. Para minimizar danos nas folhas, use um rotor de ângulo fixo.

3. Isolamento de EV por Arabidopsis do AWF via centrifugação diferencial

  1. Centrifuge o fluido de lavagem apoplástico coletado a 2.000 g por 20 minutos a 4 °C usando uma centrífuga refrigerada equipada com rotor de balde oscilante, com configurações padrão de aceleração e desaceleração. Após a centrifugação, utilize um filtro de célula de nylon de 0,45 μm para remover grandes detritos celulares do sobrenadante. Descarte a cápsula. Transfira o sobrenadante filtrado para novos tubos de centrífuga (Figura 2).
  2. Centrifuge o sobrenadante filtrado a 10.000 × g por 30 minutos a 4 °C usando uma centrífuga refrigerada equipada com rotor de ângulo fixo, com configurações padrão de aceleração e desaceleração. Descarte o comprimido e retenha o sobrenadante para ultracentrifugação. Essa etapa remove ainda mais grandes detritos celulares e grandes vesículas (Figura 2).
  3. Transfira o sobrenadante para tubos ultracentrífugas de 17 mL e ultracentrífuga a 100.000 × g por 1 hora a 4 °C usando uma ultracentrífuga equipada com rotor oscilante, com configurações padrão de aceleração e desaceleração. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em aproximadamente 16 mL de buffer VIB para lavagem. Repita a rodada de ultracentrifugação para coletar os EVs (Figura 2).
    NOTA: A centrifugação a 100.000 x g é feita para a sedimentação de pequenas vesículas, como exossomos. Passos subsequentes de lavagem ajudam a eliminar proteínas não EV ao ressuspender o pellet em um tampão. Os tubos de ultracentrífuga devem ser cuidadosamente balanceados pela massa de acordo com as especificações do fabricante antes da centrifugação. Inspecione os tubos e rotores em busca de defeitos antes do uso e certifique-se de que o rotor está devidamente fixado antes de iniciar a funcionamento.
  4. Descarte o sobrenadante e resuspenda a cápsula no VIB. Use uma ponta de pipeta para raspar suavemente a parte inferior do tubo e facilitar a recuperação completa do pellet EV (Figura 2).
    NOTA: O pellet EV costuma ser translúcido e pode não ser detectável visualmente após suspenso novamente. Raspar suavemente a parte inferior do tubo facilita o processo de resuspensão dos veículos elétricos. Ajuste o volume de resuspensão para alcançar a concentração desejada de EV, pois volumes menores geralmente resultam em preparações mais concentradas para EV. Normalmente, a ressuspensão de EVs em 50 μL gera concentrações de proteína de aproximadamente 1-1,5 μg/μL e concentrações de partículas próximas de 109-10 10 partículas/mL.
  5. Armazene os EVs resuspensos a 4 °C para uso imediato ou a -80 °C para armazenamento prolongado sem congelamento repentino em nitrogênio líquido.
    NOTA: O armazenamento de longo prazo pode reduzir a integridade dos veículos elétricos. Use veículos elétricos recém-preparados sempre que possível.

4. Uso do fracionamento do gradiente de densidade de sacarose para purificação de EVs

NOTA: A ultracentrifugação sozinha co-ssedimenta múltiplos tipos de vesículas. Para alcançar uma resolução mais fina, pode-se empregar fracionamento por gradiente de densidade, separando vesículas de acordo com sua densidade de flutuabilidade e propriedades de flutuação. Nessa abordagem, gradientes de sacarose são usados para enriquecer subpopulações definidas de EV. Alternativamente, gradientes de iodixanol podem ser usados.

  1. Separação do gradiente de sacarose de carga superior dos veículos elétricos
    1. Prepare estoques do gradiente de sacarose de 10 a 90% compostos pelas seguintes concentrações: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%. 52%, 58%, 64%, 70% e 90% usando VIB. Use um banho-maria a 60 °C para ajudar a dissolver os estoques de 70% e 90%.
    2. Prepare um gradiente descontínuo aplicando 1 mL de cada solução de sacarose em um tubo ultracentrífuga de 17 mL, começando pela solução mais concentrada no fundo e seguindo sequencialmente até a menos concentrada. Exclua a camada de 10% de sacarose ao montar o gradiente.
      NOTA: Dispense cuidadosamente cada camada de densidade ao longo da parede interna do tubo para minimizar a mistura entre camadas adjacentes. Recomenda-se uma pipeta automática ajustada para uma velocidade de dispensação lenta para fornecer fluxo contínuo e controlado e melhorar a estabilidade do gradiente. Se uma pipeta manual comum for usada, a dispensação deve ser realizada lenta e constantemente, com a ponta da pipeta posicionada logo acima da interface da camada anterior, e cuidado para evitar a formação de bolhas de ar.
    3. Misture o pellet EV ressuspenso (~100 μg de proteína EV) com 1 mL de solução de sacarose a 10%. Depois, coloque essa mistura como a camada final da camada descontínua. O volume total será de ~12,1 mL.
    4. Centrifugar a 100.000 g por 16 horas a 4 °C.
      NOTA: Para execuções prolongadas de ultracentrifugação, confirme que válvulas, tampas e rotores são classificados para operação prolongada em alta velocidade e que os procedimentos de balanceamento recomendados pelo fabricante são seguidos.
    5. Colete seis frações de 2 mL por amostra pipetando a partir do topo. Transfira cada fração para um novo tubo de ultracentrífuga de 17 mL.
    6. Resuspenda as frações coletadas em um buffer VIB de ~16 mL e centrifuge a 100.000 g por 1 hora a 4 °C.
    7. Descarte o sobrenadante, depois resuspenda cada promessa em 50 μL de VIB.
      NOTA: O balão EV não está visível. Raspe suavemente o fundo do tubo com a ponta da pipeta para resuspender. Ajuste o volume do buffer conforme necessário (por exemplo, 10 μL para concentração maior).
  2. Separação do gradiente de sacarose de carga inferior dos EVs
    1. Prepare estoques do gradiente de sacarose de 10-90% compostos pelas seguintes concentrações: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%, 52%, 58%, 64%, 70% e 90% usando o buffer VIB. Use um banho-maria a 60 °C para ajudar a dissolver os estoques de 70% e 90%.
    2. Misture o pellet EV resuspenso (~100 μg de proteína EV) com 1 mL de solução de sacarose 90%. Depois, faça uma camada sobre essa mistura como a primeira camada de uma camada descontínua.
    3. Prepare o gradiente descontínuo restante de sacarose aplicando sequencialmente 1 mL de cada solução de sacarose sobre a mistura EV-90% de sacarose, começando por 70% de sacarose e avançando passo a passo para concentrações menores (64%, 58%, 52%, 46%, 40%, 34%, 28%, 22%, 16% e 10%). Dispense cuidadosamente cada camada ao longo da parede do tubo usando uma pipeta para minimizar a mistura entre camadas adjacentes. O volume total será de ~12,1 mL.
    4. Centrífuga a 100.000 g por 72 horas a 4 °C.
      NOTA: Para execuções prolongadas de ultracentrifugação, confirme que válvulas, tampas e rotores são classificados para operação prolongada em alta velocidade e que os procedimentos de balanceamento recomendados pelo fabricante são seguidos.
    5. Colete seis frações de 2 mL por amostra pipetando a partir do topo. Transfira cada fração para um novo tubo de ultracentrífuga de 17 mL.
    6. Resuspenda as frações coletadas em um ~16 mL de tampão VIB e centrifuge a 100.000 g por 1 hora a 4 °C.
    7. Descarte o sobrenadante e depois resuspenda cada projétil em 50 μL de buffer VIB.
      NOTA: O balão EV não está visível. Raspe suavemente o fundo do tubo com a ponta da pipeta para resuspender. Ajuste o volume do buffer conforme necessário (por exemplo, 10 μL para concentração maior).

5. Uso de cromatografia de exclusão de tamanho (coluna de 35 nm) para purificar veículos elétricos

  1. Preparação do tampão e equilíbrio da coluna
    1. Prepare o VIB e todos os buffers adicionais frescos. Filtre todos os tampões através de uma membrana de 0,22 μm e desgase a vácuo antes do uso para evitar a formação de bolhas de ar e o bloqueio dos poros.
      NOTA: O desgaseificação incompleta ou o uso de tampões não filtrados podem introduzir bolhas de ar ou partículas na cama de resina, levando a fluxo interrompido e redução da eficiência da separação dos EVs. Se bolhas forem observadas na coluna, a corrida deve ser interrompida e a coluna reequilibrada.
    2. Deixe a coluna e os buffers se equilibrarem à temperatura ambiente (18-24 °C) antes de remover as tampas das colunas.
      NOTA: A coluna e os buffers devem estar totalmente equilibrados à temperatura ambiente antes da remoção da tampo. Aplicar um tampão à temperatura ambiente a uma coluna fria pode causar a formação de bolhas dentro da resina, resultando em perfis de elução distorcidos e redução da reprodutibilidade.
    3. Coloque a coluna em posição vertical e remova cuidadosamente a tampa superior da coluna.
    4. Remova a tampa inferior e deixe o buffer drenar completamente para fora da coluna.
      NOTA: Certifique-se de que o buffer de armazenamento tenha sido totalmente drenado da coluna antes do equilíbrio.
    5. Equilibre a coluna lavando com três volumes da coluna (25,5 mL) de tampão VIB desgaseificado de 0,22 μm.
  2. Carregamento de veículos elétricos e coleta de amostras
    1. Use 100 μg de proteína EV total para cada purificação SEC. Antes de carregar na coluna SEC, ajuste as amostras de EV para um volume final de 500 μL usando VIB.
    2. Aplique a suspensão EV de 500 μL diretamente na frita de carga no topo da coluna.
    3. Deixe a amostra entrar completamente na cama de resina antes de adicionar o buffer VIB. Mantenha fluxo contínuo de colunas durante toda a separação para garantir uma elução precisa baseada no tamanho.
      NOTA: O fluxo das colunas deve permanecer contínuo durante toda a separação. Permitir que a coluna sece ou pausar o fluxo por períodos prolongados interrompe a separação baseada no tamanho e pode levar à sobreposição de frações e à redução do enriquecimento de EV.
    4. Depois que a amostra de EV (500 μL) entrar totalmente na cama de resina, adicione 2 mL de VIB e permita que elude completamente. Esse eluado corresponde ao volume morto da coluna e deve ser descartado. Frações de EV foram então coletadas adicionando sequencialmente 400 μL de VIB e coletando o eluato, repetindo esse processo para obter frações 1-6 em tubos microcentrífugas de 1,5 mL.
      NOTA: O volume morto não deve conter veículos elétricos. Com base na validação usando a coluna de 35 nm, os EVs são normalmente recuperados nas frações 1 a 3. Se necessário, o volume morto pode ser avaliado por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) ou imunoblotting para marcadores de EV para confirmar a ausência de EVs.
  3. Limpeza e armazenamento de colunas
    1. Imediatamente após a coleta da fração, lave a coluna com um volume de coluna (8,5 mL) de 0,5 M NaOH para higienizar a resina. Depois, lave a coluna com 17 mL de VIB para restaurar o pH neutro. A coluna então está pronta para o carregamento da próxima amostra.
      NOTA: Lavar a coluna apenas com tampão é insuficiente para remover proteínas ou vesículas residuais. A etapa de limpeza com NaOH é essencial para evitar o retransporte entre amostras, especialmente para análises posteriores de ácidos nucleicos ou RNA.
    2. Para armazenamento a longo prazo, lave a coluna com dois volumes de água desionizada após a limpeza, seguido por dois volumes de 20% de etanol para armazenamento. Recapite a coluna e guarde-a na vertical.
      NOTA: Enxaguar a coluna com água desionizada antes do armazenamento de etanol impede a cristalização do sal dentro da camada de resina, o que preserva o desempenho da coluna.

6. Validação, quantificação e avaliação de tamanho/morfologia de EVs

  1. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
    1. Meça a distribuição do tamanho dos EVs e a concentração de partículas por NTA.
    2. Dilua as amostras de EV a 1:100 em VIB estéril, filtrado a 0,2 μm, para alcançar uma concentração de partículas dentro da faixa ótima de detecção (aproximadamente 10⁷-10⁹ partículas/mL).
    3. Misture suavemente as amostras diluídas para evitar a formação de bolhas e carregue-as no instrumento equipado com um laser de 532 nm e uma câmera sCMOS de alta sensibilidade.
    4. Realize aquisição e análise de dados usando o software NS Xplorer com um limiar de detecção de 10 nm (até 1.000 nm), aplicando um algoritmo dinâmico de concentração baseado em volume de observação.
  2. Análise de Western blot de marcadores EV
    1. Para análise Western blot, lave e ressuspenda as frações de EV obtidas após separação do gradiente de sacarose em 50 μL de VIB. Misture uma alíquota de 10 μL de cada fração com tampão de carga SDS, desnaturada, e resolva em um gel de Trisglicina a 12% antes da imunoblotting com anticorpos TET8 do marcador EV.
    2. Para frações EV derivadas da SEC, primeiro concentre 400 μL de cada fração até 50 μL usando um filtro centrífugo de corte molecular de 100 kDa. Depois, use 10 μL da amostra concentrada para análise de Western blot conforme descrito acima.
  3. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
    1. Deposite 5 μL de VEs suspensos em VIB em grades de carbono formvar 300 com descarga glow-desk. Depois, retire o excesso de amostra usando papel de filtro.
    2. Depois, tinga negativamente a grade com 3 μL de coragem de microscopia eletrônica, remove com papel de filtro e deixe secar ao ar antes de fazer a imagem com um TEM de 300 kV.

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Resultados

Para avaliar se o protocolo otimizado de coleta de AWF reduz danos aos tecidos e contaminação citoplasmática, o AWF obtido usando nosso método (Método 1) foi diretamente comparado com um método alternativo (Método 2) baseado na infiltração de bomba de vácuointeira da planta 11. O dano celular após infiltração foi avaliado por coloração com Trippan Blue, que revelou uma coloração marcadamente reduzida nas folhas processadas pelo Método 1, indicando níveis mais baix...

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Discussão

Os VE das plantas surgiram como atores fundamentais na imunidade das plantas, especialmente na mediação da comunicação entre reinos com patógenosfúngicos 32. Evidências crescentes mostram que as plantas secretam EVs no apoplasto, onde funcionam para entregar pequenos RNAs (sRNAs), mRNAs e proteínas que podem suprimir a virulência em patógenos invasores, como Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani e o patógeno oomiceto Phytophthora capsici<...

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Divulgações

Os autores não revelam conflito de interesses.

Agradecimentos

O B.D. é apoiado pela Bolsa Pathways to the Doctorate da Texas A&M University. O B.H. é apoiado por fundos iniciais da Texas A&M University e do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos HATCH 7009138 projeto número: TEX08074.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,45 & micro; Filtros de nylon mVWR76479-032
1 ml de seringa desnecessáriaBD em Biociências309659
Filtro ultra centrífugo de 100 kDaAmiconUFC 910008
100 ml seringa desnecessáriaBD em Biociências551721050
Tubos cônicos de 15 mlVWR89039-664
Tubos cônicos de 50 mlVWR89039-656
Arabidopsis thaliana (Col-0)Linhas mantidas em laboratórioNão aplicável
Grades de 300 malhas carbono-formvarTED PELLA01753-F
Fita transparenteFita Mágica EscocêsS-9783
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Buffer PBSFeito internamenteNão aplicável
qEV coluna original Gen2 35 nmIZON ScienceICO-35
Centrífuga refrigeradaEppendorf5810R
Centrífuga refrigerada com rotor de ângulo fixoEppendorfF-34-6-38
Rotor de balde oscilante refrigerado para centrífugaEppendorfA-4-62
SacaroseVWR470302-810
UltracentrífugaBeckman CoulterXPN-100
Tubos ultracentrífugasBeckman Coulter337986
Coloração UranyLessCiências da Microscopia Eletrônica250218-01

Referências

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Zhou, X., et al. Small extracellular vesicles: The origins, current status, future prospects, and applications. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 184(2025).
  3. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  4. Akers, J. C., Gonda, D., Kim, R., Carter, B. S., Chen, C. C. Biogenesis of extracellular vesicles (EV): Exosomes, microvesicles, retrovirus-like vesicles, and apoptotic bodies. J Neurooncol. 113 (1), 1-11 (2013).
  5. Ratajczak, M. Z., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: Discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  6. Hristov, M., Erl, W., Linder, S., Weber, P. C. Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro. Blood. 104 (9), 2761-2766 (2004).
  7. Marar, C., Starich, B., Wirtz, D. Extracellular vesicles in immunomodulation and tumor progression. Nat Immunol. 22 (5), 560-570 (2021).
  8. Ruan, S., et al. Extracellular vesicles as an advanced delivery biomaterial for precision cancer immunotherapy. Adv Healthc Mater. 11 (5), e2100650(2022).
  9. Cai, Q., et al. Message in a bubble: Shuttling small RNAs and proteins between cells and interacting organisms using extracellular vesicles. Annu Rev Plant Biol. 72, 497-524 (2021).
  10. Cai, Q., et al. Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes. Science. 360 (6393), 1126-1129 (2018).
  11. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles isolated from the leaf apoplast carry stress-response proteins. Plant Physiol. 173 (1), 728-741 (2017).
  12. Ding, Y., et al. Exo70e2 is essential for exocyst subunit recruitment and expo formation in both plants and animals. Mol Biol Cell. 25 (3), 412-426 (2014).
  13. Wang, J., et al. Expo, an exocyst-positive organelle distinct from multivesicular endosomes and autophagosomes, mediates cytosol to cell wall exocytosis in Arabidopsis and tobacco cells. Plant Cell. 22 (12), 4009-4030 (2010).
  14. Jeon, H. S., et al. Pathogen-induced autophagy regulates monolignol transport and lignin formation in plant immunity. Autophagy. 19 (2), 597-615 (2023).
  15. Prado, N., et al. Nanovesicles are secreted during pollen germination and pollen tube growth: A possible role in fertilization. Mol Plant. 7 (3), 573-577 (2014).
  16. Samuel, M., Bleackley, M., Anderson, M., Mathivanan, S. Extracellular vesicles including exosomes in cross kingdom regulation: A viewpoint from plant-fungal interactions. Front Plant Sci. 6, 766(2015).
  17. Pinedo, M., De La Canal, L., De Marcos Lousa, C. A call for rigor and standardization in plant extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 10 (6), e12048(2021).
  18. Huang, Y., et al. Rice extracellular vesicles send defense proteins into fungus rhizoctonia solani to reduce disease. Dev Cell. 60 (8), 1168-1181.e6 (2025).
  19. Wang, S., et al. Plant mrnas move into a fungal pathogen via extracellular vesicles to reduce infection. Cell Host Microbe. 32 (1), 93-105.e6 (2024).
  20. He, B., et al. Publisher correction: Rna-binding proteins contribute to small rna loading in plant extracellular vesicles. Nat Plants. 7 (4), 539(2021).
  21. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles as key mediators of plant-microbe interactions. Curr Opin Plant Biol. 44, 16-22 (2018).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  23. Regente, M., et al. Plant extracellular vesicles are incorporated by a fungal pathogen and inhibit its growth. J Exp Bot. 68 (20), 5485-5495 (2017).
  24. Mu, J., et al. Interspecies communication between plant and mouse gut host cells through edible plant derived exosome-like nanoparticles. Mol Nutr Food Res. 58 (7), 1561-1573 (2014).
  25. Baldrich, P., et al. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  26. Regente, M., et al. Vesicular fractions of sunflower apoplastic fluids are associated with potential exosome marker proteins. FEBS Lett. 583 (20), 3363-3366 (2009).
  27. Rutter, B. D., Innes, R. W. Growing pains: Addressing the pitfalls of plant extracellular vesicle research. New Phytol. 228 (5), 1505-1510 (2020).
  28. Thieron, H., et al. Practical advice for extracellular vesicle isolation in plant-microbe interactions: Concerns, considerations, and conclusions. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70022(2024).
  29. Borniego, M. L., et al. Diverse plant Rnas coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  30. Chen, A., He, B., Jin, H. Isolation of extracellular vesicles from Arabidopsis. Curr Protoc. 2 (1), e352(2022).
  31. Koch, B. L., Rutter, B. D., Innes, R. W. Arabidopsis produces distinct subpopulations of extracellular vesicles that respond differentially to biotic stress. bioRxiv. , (2024).
  32. Hamby, R., Cai, Q., Jin, H. RNA communication between organisms inspires innovative eco-friendly strategies for disease control. Nat Rev Mol Cell Biol. 26 (2), 81-82 (2025).
  33. Hou, Y., et al. A phytophthora effector suppresses trans-kingdom RNAi to promote disease susceptibility. Cell Host Microbe. 25 (1), 153-165.e5 (2019).

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