Esse protocolo descreve a fabricação de adesivos de microagulha solúveis que incorporam nanomicelles de α-lactalbumina carregadas com capsaicina. O método oferece uma abordagem reprodutível e minimamente invasiva para a entrega transdérmica direcionada de bioativos hidrofóbicos ao tecido adiposo, facilitando uma redução eficiente de gordura local e potencialmente expandindo aplicações no manejo da obesidade.
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Artigo de método
Fabricação de Adesivos Microagulhas Soluvíveis Carregados com Nanomicelles α-Lactalbumina para entrega transdérmica de capsaicina e redução de tecido adiposo
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve a fabricação e aplicação de adesivos de microagulha solúvel (MN) contendo nanomicelles de α-lactalbumina para a entrega transdérmica direcionada de capsaicina ao tecido adiposo. O processo começa com a hidrólise enzimática parcial da α-lactalbumina, resultando em peptídeos anfifílicos que se auto-montam em nanomicelas encapsulando o composto hidrofóbico capsaicina. As nanomicelles carregadas de capsaicina são misturadas com matriz de ácido hialurônico (HA) e álcool polivinílico (PVA), fundidas em moldes de polidimetilsiloxano (PDMS) e centrifugadas para produzir matrizes de 10 × 10 MN. Após a secagem a vácuo, os MNs apresentam resistência mecânica adequada para penetração na pele e se dissolvem em aproximadamente 30 minutos após a aplicação. Resultados representativos incluem microscopia eletrônica de varredura, que confirma a morfologia uniforme das MNs, microscopia confocal, que verifica penetração na pele e liberação de medicamentos, e experimentos in vivo em camundongos com dieta rica em gordura (HFD) mostrando redução da massa de gordura, aumento da atividade metabólica e indução de amarecimento adiposo. Esse protocolo oferece um método reprodutível e minimamente invasivo para a entrega transdérmica de bioativos hidrofóbicos, oferecendo uma abordagem terapêutica promissora para o manejo da obesidade. Esse protocolo é otimizado para reprodutibilidade e adequado para adaptação a outros bioativos hidrofóbicos.
Introdução
A obesidade tornou-se um dos desafios globais de saúde mais urgentes, com a prevalência aumentando de forma constante tanto em países desenvolvidos quanto em desenvolvimento. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, mais de 650 milhões de adultos foram classificados como obesos em 2016, e em 2022, aproximadamente 43% dos adultos com ≥18 anos estavam acima do peso e 16% viviam comobesidade 1. A obesidade está intimamente associada à síndrome metabólica, doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2 e vários tipos de câncer, impondo cargas socioeconômicas e de saúdesubstanciais 2,3. As estratégias terapêuticas atuais, incluindo restrição alimentar, exercícios, farmacoterapia e cirurgia bariátrica, oferecem apenas benefícios parciais e frequentemente transitórios. Essas abordagens frequentemente apresentam baixa adesão dos pacientes, eficácia limitada a longo prazo, alta invasividade e efeitos adversosindesejáveis 4,5. Consequentemente, há uma necessidade urgente de terapias localizadas seguras, eficazes e compatíveis com o paciente para o manejo da obesidade.
Compostos bioativos naturais têm despertado interesse crescente como agentes antiobesidade devido às suas ações multidirecionadas e perfis de segurança geralmente favoráveis. Por exemplo, a rutina, um glicosídeo flavonoide, apresenta efeitos regulatórios anti-lipogênicos e metabólicos ao suprimir fatores de transcrição adipogênicos e promover a biogênese mitocondrial6. Capsaicina, o componente pungente das pimentas, foi relatado como aumentando o gasto energético, induzindo escurecimento do tecido adiposo branco e inibindo o acúmulo de lipídios por meio da ativação do potencial receptor transitório vaniloide 1 (TRPV1) que emitea sinalização 7,8. No entanto, a tradução clínica desses compostos é dificultada por baixa solubilidade aquosa, baixa biodisponibilidade oral, metabolismo rápido e, no caso da capsaicina, irritação gastrointestinal ao seringerida.
Sistemas de entrega de medicamentos baseados em nanotecnologia oferecem soluções promissoras para essas limitações. Lipossomos, nanopartículas poliméricas e nanotransportadores à base de proteínas podem melhorar significativamente a solubilidade, estabilidade e absorção celulardo medicamento 10. Em particular, a α-lactalbumina, uma proteína do leite derivada de alimentos, pode ser parcialmente hidrolisada em peptídeos anfifílicos que se auto-montam em nanomicele capazes de encapsular moléculas hidrofóbicas como acapsaicina 11. Essas nanoestruturas de α-lactalbumina demonstraram melhorar a solubilidade, estabilidade e biodisponibilidade de diversos bioativos hidrofóbicos em matrizes alimentícias efarmacêuticas 12,13. No entanto, a administração sistêmica de nanocarriers ainda pode levar à distribuição de tecidos fora do alvo e à potencial toxicidadesistêmica 14.
A tecnologia de microagulhas (MN) emergiu como uma plataforma minimamente invasiva e amigável para o paciente para a entrega transdérmica de medicamentos. MNs solúveis preparados a partir de polímeros biocompatíveis como ácido hialurônico (HA) e álcool polivinílico (PVA) podem penetrar indolor no estrato córneo, dissolver-se após a inserção e permitir a deposição local precisa de fármacos em tecidos alvo15,16. Combinar nanoportadores com MNs aumenta ainda mais o acúmulo de medicamentos no tecido adiposo subcutâneo, ao mesmo tempo em que reduz a exposição sistêmica e os efeitoscolaterais 17. Importante destacar que adesivos MN à base de HA e PVA dissolvíveis estão sendo avançados para uso clínico na administração transdérmica de vacinas e biofármacos, demonstrando segurança favorável, aceitação do paciente e fabricabilidade na escala18.
Com base nesses avanços, o presente estudo descreve a fabricação de patches de MN solúveis carregados com nanomicelles de α-lactalbumina que encapsulam capsaicina. Neste protocolo, a α-lactalbumina é dissolvida a 6 mg/mL e hidrolisada enzimaticamente para gerar peptídeos anfifílicos que se auto-montam em nanomicelas carregadas de capsaicina. As nanomicele são incorporadas a uma matriz HA/PVA (5% w/v cada) e fundidas em moldes de polidimetilsiloxano (PDMS) para formar matrizes de 10 × 10 MN com altura de agulha de 600 μm, uma configuração compatível com processos padrão de micromoldagem e facilmente escalável para patches maiores, do tamanho humano. Espera-se que esse desenho integrado melhore a solubilidade e estabilidade da capsaicina, proporcione liberação responsiva ao pH no tecido adiposo e aumente a eficácia local antiobesidade in vivo , promovendo o escurecimento do tecido adiposo, suprimindo a lipogênese e melhorando parâmetros metabólicos sistêmicos. Ao aproveitar α-lactalbumina de grau alimentício e materiais de dissolução de MN clinicamente avançados, essa plataforma oferece uma estratégia minimamente invasiva e relevante para translação, que pode ser adaptada a adesivos em escala humana para terapia de obesidade localizada e autoadministrada.
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética Experimental de Animais em Pequim. O número de aprovação atribuído ao laboratório/investigador é AW03019102-3. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de nanomicelles de α-Lactalbumina encapsulando capsaicina 12
- Dissolva α-lactalbumina em água desionizada até uma concentração de 6 mg/mL e ajuste o pH para 7,4. Mexa a solução usando um agitador magnético a 8-28 × g até que a α-lactalbumina esteja completamente dissolvida (normalmente 20-30 minutos).
- Adicione a protease Bacillus licheniformis (BLP) em uma proporção enzima-substrato de 1:100 (p/w).
- Incube a mistura a 50 °C por 30 minutos para gerar peptídeos anfifílicos.
- Termine a reação aquecendo a solução a 95 °C por 5 minutos, depois esfrie até a temperatura ambiente e filtre através de uma membrana de 0,22 μm.
- Dissolva a capsaicina em etanol até uma concentração de 1 mg/mL. Adicione a solução de capsaicina em gota na solução peptídica sob uma mistura suave.
- Continue mexendo por 2 horas para permitir a auto-montagem dos nanomicelas.
- Remova a capsaicina livre dialisando a mistura (MWCO 3,5 kDa) contra água desionizada por 12 horas, substituindo a água a cada 4 horas.
- Liofilize (liofilize) as nanomicelas de α-lactalbumina preparadas.
- Caracterize as nanomicelles usando análise de potencial TEM, DLS e zeta.
2. Fabricação de adesivos de microagulhas solúveis 11
- Prepare a solução polimérica dissolvendo HA (5% p/v) e PVA (5% p/v) em água desionizada a 60 °C e mexendo até que a solução fique clara.
- Resfrie a solução polimérica à temperatura ambiente e misture com as nanomicele carregadas de capsaicina (M(Cap)) em uma proporção de 4:1.
- Desgasifice a mistura a vácuo em um dessecador conectado a uma bomba de vácuo (aproximadamente −80 kPa) por 10 minutos para remover bolhas de ar antes de moldar em moldes PDMS.
- Carregue 200 μL da mistura em moldes PDMS (matriz de 10 × 10 agulhas, altura de 600 μm).
- Centrifuge os moldes a 1800 × g em RT por 10 minutos para garantir o preenchimento completo das cavidades da microagulha.
- Repita o preenchimento uma vez, seguida de uma segunda centrifugação nas mesmas condições do passo 2.5, e então seque os moldes a vácuo (aproximadamente −80 kPa) em temperatura ambiente por 12 horas.
- Cuidadosamente retire os remendos de microagulha dos moldes.
- Examine a morfologia das microagulhas por MEB.
3. Teste mecânico de microagulhas 19
- Coloque o patch de microagulha no palco de um analisador de textura com as agulhas voltadas para cima.
- Comprima o patch usando uma sonda a uma velocidade de 20 μm/s até atingir um deslocamento de 0,7 mm.
- Registre a força da fratura e confirme que ela é ≥0,15 N por agulha para garantir a capacidade de penetração da pele.
4. Teste de inserção e dissolução in vitro 11
- Raspe a pele abdominal dos camundongos e retire a pele para testes ex vivo .
- Coloque a pele extirpada sobre um suporte de gel de agarose.
- Pressione o adesivo de microagulha firmemente na pele por 30 segundos.
- Mantenha contato entre o adesivo e a pele por 30 minutos.
- Observe a dissolução da agulha.
- Tinga a pele com coloração H&E e visualize os locais de inserção sob CLSM.
5. Estudo de liberação in vitro 11
- Imerga os patches de microagulha em um buffer PBS (pH 6,5 ou 7,4) a 37 °C.
- Em intervalos definidos, retire amostras de buffer e reabasteça imediatamente com um volume igual de buffer novo.
- Determine a concentração de capsaicina nas amostras coletadas usando HPLC.
- Compare os perfis de liberação em diferentes condições de pH usando HPLC.
6. Aplicação in vivo em camundongos obesos induzidos por HFD 11
- Induza obesidade em camundongos C57BL/6N alimentando uma dieta rica em gordura (HFD, 60% kcal da gordura) por 8 semanas.
- Divida aleatoriamente os camundongos em cinco grupos: controle normal, controle HFD, patch microneedle micelle em branco (MP-M), injeção de nanomicelas carregada com capsaicina (InJ-M(Cap)) e patch microneedle nanomicelle carregado com capsaicina (MP-M(Cap)).
- Depilar a região inguinal de cada camundongo.
- Aplique um adesivo microagulha na área depilada a cada 2 dias durante 28 dias e mantenha o adesivo no lugar por 30 minutos.
- Registre o peso corporal e a ingestão de alimentos a cada 2 dias durante o período de tratamento.
- Analise a composição da gordura corporal inteira e dos tecidos magros por meio de ressonância magnética ao final do tratamento.
- Avalie a atividade física, o consumo de oxigênio, a produção de CO₂ e o quociente respiratório (QR) em gaiolas metabólicas conforme as instruções do fabricante.
- Colete iWAT, sBAT e órgãos principais, fixe, incorpore, corte e core os tecidos com H&E, e avalie alterações histológicas por microscopia óptica.
- Realize Western blot para TRPV1, PPARγ, C/EBPα, UCP1 e Cyt C usando procedimentos padrão.
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Resultados
Morfologia e caracterização das nanomicelles
A microscopia eletrônica de transmissão (MET) mostrou que as nanomicelles de α-lactalbumina eram partículas esféricas uniformemente dispersas com distribuição de tamanho estreita (Figura 1). Após a encapsulação da capsaicina, o diâmetro médio da partícula aumentou de ~22 nm para ~30 nm, indicando carregamento bem-sucedido do fármaco no núcleo micelar. Consistentemente, o potencial zeta deslocav...
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Discussão
Este estudo demonstra que adesivos de microagulha solúveis (MN) carregados com nanomicelles de α-lactalbumina que encapsulam capsaicina (M(Cap)) podem alcançar efeitos antiobesidade localizados e minimamente invasivos. Nanomicelles de α-Lactalbumina encapsularam eficientemente capsaicina hidrofóbica, melhoraram sua dispersibilidade aquosa e aumentaram a absorção celular, levando a uma inibição mais forte da adipogênese e a uma biogênese mitocondrial mais proeminente nos adipócitos 3T3-L1...
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Divulgações
Não há divulgações.
Agradecimentos
Este projeto foi apoiado pelo Fundo de Jovens Cientistas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32202024), pelo Fundo de Jovens Cientistas da Fundação Provincial de Ciências Naturais de Shandong (nº ZR2024QC103), o Plano Chave de Pesquisa e Desenvolvimento da Província de Shandong (2025CXGC010803, 2022CXPT022), o Sistema de Tecnologia da Indústria Avícola da Província de Shandong (SDAIT-11-10) e o Programa de Colaboração Universidades-Indústria financiado pelo Bureau de Educação da Cidade de Yantai, China (Desenvolvimento da Plataforma de Vacinas de Próxima Geração para Animais de Estimação).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Preadipócitos 3T3-L1 | ATCC | CL-173 | Linha celular para estudos de adipogênese |
| Protease Bacillus licheniformis (BLP) | Sigma-Aldrich | P5380 | Hidrólise enzimática da &alfa;-lactalbumina |
| Capsaicina (≥ 98%) | Sigma-Aldrich | M2028 | Composto ativo a ser encapsulado |
| Centrífuga (≥ 4000 rpm) | Eppendorf | 5810R | Para preencher moldes |
| Microscópio de varredura a laser confocal (CLSM) | Zeiss | LSM 900 | Visualizar a distribuição e penetração das micelas |
| Corante fluorescente Cy3 | GE Healthcare | PA23001 | Para marcação de nanomicelles |
| Corantes fluorescentes Cy5 ou Cy7 | Fanbo Biochemical, Pequim, China | N/A | Para imagens de biodistribuição |
| Dulbecco' s Modified Eagle' s Médio (DMEM) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Para cultura celular |
| Etanol (≥ 99.7%) | Reagente Químico Sinopharm | 100092683 | Solvente para capsaicina |
| Soro fetal bovino (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 16000-044 | Para cultura celular |
| Dieta rica em gordura (60% kcal de gordura, D12492) | Research Diets, EUA | D12492 | Para induzir obesidade em camundongos |
| Ácido hialurônico (HA, Mw 100– 300 kDa) | Aladdin Biochemical Technology Co., China | H108124 | Polímero para fabricação de microagulhas |
| Isoflurano | RWD, China | R510-22-10 | Anestésico |
| Sistema metabólico de gaiolas | Panlab, EUA | N/A | Avaliar atividade, consumo de oxigênio e QR |
| Água desionizada Milli-Q | Millipore | N/A | Solvente |
| Sistema de ressonância magnética | NiuMag, China | MesoQMR23-060H-I | Para medir a composição corporal gorda/magra |
| Moldes de microagulha PDMS (10 e vezes 10, 600 e mu; m altura) | Blueacre Tecnologia ou Customização | N/A | Fabricação de microagulhas |
| Penicilina– Estreptomicina | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Para cultura celular |
| Soro tamponado com fosfato (PBS, pH 7,4) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Buffer para estudos in vitro e in vivo |
| Álcool polivinílico (PVA, Mw 30– 70 kDa) | Aladdin Biochemical Technology Co., China | P109389 | Polímero para fabricação de microagulhas |
| Microscópio eletrônico de varredura (SEM) | FEI Tecnai | G2 F30 | Caracterizar a morfologia das microagulhas |
| Analisador de textura | BosinTech, Xangai, China | TCAI. XTC-20 | Para testar a resistência da microagulha |
| Solução de azul de tripano (0,4%) | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Para visualizar os locais de inserção da microagulha |
| UV– Espectrofotômetro Vis | PerkinElmer | Lambda 35 | Para ensaios de liberação de medicamentos |
| Forno/dessecador a vácuo | Thermo Fisher Scientific | N/A | Para secar microagulhas |
| Aparelho Western blotting | Bio-Rad | Tetra Mini-PROTEANO | Análise de proteínas |
| α-Lactalbumina (≥ 95%) | Sigma-Aldrich | L6010 | Fonte de proteína para formação de nanomicelas |
Referências
- Obesity and overweight. WHO Fact Sheets. , World Health Organization. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-overweight (2025).
- Bray, G. A., Kim, K. K., Wilding, J. P. H. Federation, W. O. Obesity: A chronic relapsing progressive disease process. A position statement of the World Obesity Federation. Obes Rev. 18 (7), 715-723 (2017).
- Hruby, A., Hu, F. B. The epidemiology of obesity: A big picture. Pharmacoeconomics. 33 (7), 673-689 (2015).
- Dietrich, M. O., Horvath, T. L. Limitations in anti-obesity drug development: The critical role of hunger-promoting neurons. Nat Rev Drug Discov. 11 (9), 675-691 (2012).
- Garvey, W. T., et al. American Association of Clinical Endocrinologists and American College of Endocrinology comprehensive clinical practice guidelines for medical care of patients with obesity. Endocr Pract. 22, 1-203 (2016).
- Li, Z., Liang, S., Sun, H., Bao, C., Li, Y. Antilipogenesis effect of rutin-loaded liposomes using a microneedle delivery system. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (47), 54294-54303 (2023).
- Hsu, C. L., Yen, G. C. Effects of flavonoids and phenolic acids on the inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. J Agric Food Chem. 55 (21), 8404-8410 (2007).
- Zhang, L. L., et al. Activation of transient receptor potential vanilloid type-1 channel prevents adipogenesis and obesity. Circ Res. 100 (7), 1063-1070 (2007).
- Zheng, J., Zheng, S., Feng, Q., Zhang, Q., Xiao, X. Dietary capsaicin and its anti-obesity potency: from mechanism to clinical implications. Biosci Rep. 37 (3), BSR20170286(2017).
- Negahdari, R., et al. Therapeutic benefits of rutin and its nanoformulations. Phytother Res. 35 (4), 1719-1738 (2021).
- Bao, C., et al. Microneedle patch delivery of capsaicin-containing α-lactalbumin nanomicelles to adipocytes achieves potent anti-obesity effects. Adv Funct Mater. 31 (20), 2011130(2021).
- Hu, Y., et al. The construction of enzymolyzed α-lactalbumin-based micellar nanoassemblies for encapsulating various kinds of hydrophobic bioactive compounds. Food Funct. 10 (12), 8263-8272 (2019).
- Wang, Q., et al. The stability and bioavailability of curcumin-loaded α-lactalbumin nanocarriers formulated in functional dairy drink. Food Hydrocoll. 131, 107807(2022).
- Luo, T., et al. Adipose tissue-targeted drug delivery for treating obesity: Current opportunities and challenges. Drug Deliv. 32 (1), 2547751(2025).
- Patel, D., Patel, N., Parmar, M., Kaur, N. Transdermal drug delivery system: An overview. Int J Toxicol Pharmacol Res. 1, 61-80 (2011).
- Singh, P., et al. Single-administration self-boosting microneedle patch for the treatment of obesity. Adv Ther. 7 (9), 2400028(2024).
- Than, A., et al. Transdermal delivery of anti-obesity compounds to subcutaneous adipose tissue with polymeric microneedle patches. Small Methods. 1 (11), 1700269(2017).
- Nguyen, H. X., Nguyen, C. N. Microneedle-mediated transdermal delivery of biopharmaceuticals. Pharmaceutics. 15 (1), 277(2023).
- Chu, L. Y., Choi, S. O., Prausnitz, M. R. Fabrication of dissolving polymer microneedles for controlled drug encapsulation and delivery: Bubble and pedestal microneedle designs. J Pharm Sci. 99 (10), 4228-4238 (2010).
- Richmond, W., Wogan, M., Isbell, J., Gordon, W. P. Interstrain differences of in vitro metabolic stability and impact on early drug discovery. J Pharm Sci. 99 (11), 4463-4468 (2010).
- Amini-Nik, S., Yousuf, Y., Jeschke, M. G. Scar management in burn injuries using drug delivery and molecular signaling: Current treatments and future directions. Adv Drug Deliv Rev. 123, 135-154 (2018).
- Prausnitz, M. R., Langer, R. Transdermal drug delivery. Nat Biotechnol. 26 (11), 1261-1268 (2008).
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Reimpressões e permissões
