Artigo de método

Ensaio de Placas Antiproliferativas para Triagem in vitro de Moléculas Bioativas contra Taquizoítos de Toxoplasma gondii

DOI:

10.3791/69725

⸱

23 de janeiro de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de Quimioterapia de Protozoários Egler Chiari, Departamento de Parasitologia - ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho tem como objetivo descrever um método simples de ensaio de placas para auxiliar na triagem de novas moléculas bioativas contra o estágio taquizoítico do protozoário Toxoplasma gondii.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A toxoplasmose é uma infecção parasitária comumente relacionada a lesões oculares e malformações neonatais. Desde o início dos anos 1950, o tratamento de primeira linha para essa doença tem sido baseado na combinação de sulfadiazina, pirimetamina e ácido folínico. Ao longo desses anos, apenas alguns regimes alternativos foram introduzidos. Isso destaca a necessidade de descobrir novas moléculas bioativas contra Toxoplasma gondii. Considerando que esse patógeno é um parasita intracelular obrigatório, a triagem tradicional de medicamentos em laboratório normalmente requer materiais e equipamentos caros, como ensaios usando proteínas fluorescentes ou parasitas expressores de β-galactosidase. Além disso, métodos como a quantificação por microscopia óptica podem ser demorados. O ensaio de placas é um método que avalia a intensidade da proliferação intracelular de patógenos medindo o número de regiões e a área de destruição em uma monocamada celular danificada pelo ciclo lítico do parasita. Este trabalho descreve um protocolo otimizado de ensaio de placas, projetado para rastrear moléculas ativas contra taquizoítos intracelulares de T. gondii in vitro. Esse protocolo utiliza materiais baratos e um sistema de laboratório simples, gerando resultados rápidos e reprodutíveis que facilitam a identificação de novas moléculas ativas contra esse parasita por diversos grupos de pesquisa.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A toxoplasmose é uma doença zoonótica com distribuição heterogênea mundial, afetando aproximadamente um terço da populaçãoglobal 1,2. Os sintomas dessa doença estão associados ao grau de imunidade do hospedeiro e à replicação doparasita 3,4. A fase aguda da doença, caracterizada pela replicação do estágio taquizoítico, é geralmente assintomática em indivíduosimunocompetentes 5,6. Em contraste, indivíduos imunocomprometidos apresentam sintomas mais frequentes, incluindo sintomas inespecíficos como mal-estar geral, febre, além de encefalite e retinocoroidite 6,7,8. Apesar de sua importância clínica, o tratamento atualmente disponível é ineficaz contra o estádio de bradizoíto Toxoplasma gondii (na fase crônica) e não resulta em cura parasitológica. Eventos adversos aos medicamentos atuais também reduzem a adesão ao tratamento 9,10,11. Portanto, é necessário encontrar tratamentos novos, mais seguros e eficazes para a toxoplasmose.

O desenvolvimento de novos medicamentos envolve um longo período de tempo, bilhões de dólares em investimentos e múltiplas etapas de pesquisa. Como o custo do desenvolvimento de medicamentos é alto, a indústria farmacêutica precisa selecionar o melhor candidato a medicamento comantecedência 12, 13, 14, 15. Para o rastreamento de drogas, várias abordagens podem ser empregadas, incluindo métodos in silico, o uso de inteligência artificial e a abordagem mais comum, métodosbiológicos 16,17,18,19. A triagem biológica in vitro envolve o uso de bibliotecas de moléculas (quimiobibliotecas) para disponibilizar moléculas para a identificação da atividade biológica 20,21,22. Como essas quimiobibliotecas contêm uma diversidade de moléculas, é necessário otimizar recursos e tempo. Portanto, o ensaio de placas pode ser um método para ajudar a filtrar rapidamente novas moléculas bioativas contra vários patógenos, como T. gondii.

O ensaio de placas é um método in vitro que utiliza o ciclo lítico de patógenos intracelulares para quantificar a concentração de patógenos em uma monocamada celular, resultando na formação de placas necróticas ao longo dotempo 23. O primeiro estudo usando a técnica de ensaio de placas data do início da segunda metade do século XX, quando a equipe de Renato Dulbecco usou monocamadas de fibroblastos de galinha infectados com o vírus da Encefalomielite Equina Ocidental para demonstrar a proporcionalidade entre o número de placas necróticas formadas e a concentração do vírus16. O uso dessa técnica em T. gondii também foi bem descrito, como já elucidado por Ufermann e colaboradores23.

Um dos primeiros estudos a usar o ensaio de placa para observar uma resposta na inibição de T. gondii contra diferentes concentrações de moléculas foi realizado por Roberts et al. em 1976-17. Embora o ensaio de placas seja amplamente utilizado para a titulaçãoviral 16,24, esse método foi empregado por apenas alguns grupos de pesquisa para avaliar a atividade anti-T. gondii dasmoléculas 21,22,25,26,27. Buscando um ensaio que permitisse testar bibliotecas de compostos com alta produtividade, utilizando materiais baratos e um laboratório simples, o ensaio de placas foi explorado como alternativa para triagem de drogas em laboratório rotineira. Isso levou ao estabelecimento de um protocolo otimizado que permite a avaliação simultânea da atividade de diferentes moléculas usando materiais simples e um sistema de aquisição de imagem, resultando em resultados rápidos e reprodutíveis. Assim, descrevemos aqui o protocolo detalhado, validado em nosso laboratório, para auxiliar outros grupos na triagem de novas moléculas bioativas contra taquizoítos de T. gondii.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A manipulação de parasitas e culturas celulares, bem como o descarte e destino de resíduos, foram realizados de acordo com a legislação brasileira, conforme exigido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) RDC nº 222/2018. Todos os procedimentos foram supervisionados pelo Comitê Interno de Biossegurança (CIBio) do ICB-UFMG. Este estudo não envolve o uso de animais, humanos ou organismos geneticamente modificados. Bolsas do CNPq, CAPES e FAPEMIG apoiaram esse trabalho. ESMD (CNPq 308082/2023-0) e RWAV (CNPq 305574/2021-3) são bolsistas de produtividade do CNPq. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do médio RPMI-1640 suplementado

NOTA: O meio RPMI-1640 foi originalmente desenvolvido para cultivar células de leucemia humana, tanto em suspensão quanto em monocamadas. No entanto, estudos posteriores mostraram sua adequação para uma variedade de cultivos celulares de mamíferos.

  1. Ao frasco contendo 250 mL de RPMI-1640, adicione 2,5 mL de 200 mM de L-glutamina (100x).
  2. Adicione 2,5 mL do Antibiótico-Antimicótico (100 vezes) ao meio.
  3. Em seguida, adicione 5,0 mL ou 25 mL de soro fetal bovino (FBS) ao frasco com RPMI-1640 (2% ou 10% FBS).
  4. Armazene na geladeira (2-8 °C).

2. Preparação do PBS (1x)

NOTA: Para preparar 1 L de soro salino tamponado com fosfato (PBS) em pH 7,2 e 25 °C, siga os passos abaixo.

  1. Meça as seguintes quantidades de sais separadamente: 1,4 g de Na2HPO4, 0,24 g deKH 2PO4 e 8,5 g de NaCl.
  2. Adicione os sais pesados separadamente em um béquer de 1 L contendo 800 mL de água desionizada. Mexa a solução até que todos os sais estejam completamente dissolvidos.
  3. Meça o pH da solução usando um medidor de pH. Deveria ser 7,2. Se necessário, use 6 M de ácido clorídrico ou 3 M de hidróxido de sódio para elevar o pH a 7,2.
  4. Usando uma haste de vidro, transfira quantitativamente a solução acima para um frasco volumétrico de 1 L.
  5. Adicione água deionizada ao frasco volumétrico até que o volume total atinja 1 L, garantindo que o menisco esteja no ponto correto.
  6. Misture a solução no frasco volumétrico, invertendo-o suavemente.
  7. Divida a solução final de PBS em garrafas de vidro menores (100-250 mL).
  8. Autoclave as garrafas a 121 °C, 1,1 kg/cm 2 por 15 minutos.
  9. Armazene a solução de PBS na geladeira (2-8 °C).
    NOTA 1: Use PBS a 37 °C para todos os experimentos.

3. Preparação de solução de formol a 4%

  1. Misture 35,68 mL de 1x PBS e 4,32 mL de formaldeído P.A. a 37%.
  2. Armazene a solução em um frasco plástico em temperatura ambiente (25 °C).

4. Preparação da solução padrão das moléculas ativas

NOTA: Verifique a solubilidade das moléculas em DMSO, DMF, etanol ou água, e selecione o solvente mais adequado. Para minimizar os potenciais efeitos de toxicidade diluente em parasitas, a solução padrão deve estar pelo menos 1000 vezes mais concentrada do que a maior concentração do composto a ser testado. Por exemplo, se a maior concentração a ser testada for 1 μM, a solução padrão deve ser pelo menos 1 mM. Para preparar uma solução de estoque de 10 mM, siga os passos abaixo:

  1. Pese o composto a ser testado usando uma balança analítica com precisão de 0,0001 g.
  2. Determine o volume do diluente necessário para obter uma solução de 10 mM usando a seguinte fórmula:
    V (mL) = (Y MM) x 100
    Onde:
    Y: massa do composto em miligramas (mg)
    MM: massa molar do composto
    V (mL): volume do solvente
  3. Adicione o diluente ao recipiente que contém o composto ponderado.
  4. Homogeneize usando um misturador de vórtice.
  5. Divida a solução em pequenas alíquotas e armazene-as em um freezer a -20 °C.
  6. Antes do uso, deixe a solução aliquota descongelar completamente e homogeneizar novamente usando um misturador de vórtice.
    NOTA: Para preparar soluções sub-stock com outras concentrações, utilize a seguinte fórmula
    V (μL) = x mM × y μL/10 mM
    V (μL) ∶ volume da solução padrão necessária para preparar a nova solução
    x mM: concentração desejada da nova solução.
    y (μL): volume desejado da nova solução.

5. Cultura celular

  1. Use células NHDF girando suavemente o frasco no banho-maria de 37 °C.
    NOTA: As células NHDF podem ser substituídas por Fibroblastos do Prepúcio Humano (HFF) ou outras linhagens celulares que formam uma monocamada estável. O ensaio de placas só funciona com linhagens celulares que formam uma monocamada estável, ou seja, células cujo crescimento para por contato. Linhagens celulares que não apresentam inibição da proliferação, como linhas tumorais, não podem ser usadas, pois as células competem com os parasitas por nutrientes no meio de cultivo e repõem a área de placa formada pelos parasitas.
  2. Transfira imediatamente as células descongeladas para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de meio RPMI-1640 suplementado (veja passo 1).
  3. Centrifuge as células a 200 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Quando o ciclo de centrifugação termina, um pellet de célula deve ser visível na parte inferior do tubo.
  4. Descarte cuidadosamente o sobrenadante para preservar a pastilha celular.
  5. Ressuspenda o pellet celular com 12 mL suplementado de meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS e semeie três frascosde cultura de 25 cm ou um frasco2 de 75 cm. Após 2-3 dias, examine o(s) frasco(s) de cultura usando um microscópio de contraste de fase invertido para determinar a recuperação da proliferação celular (as células devem apresentar pelo menos 40%-50% de confluência).
  6. Quando as células atingem uma monocamada completa (100% de confluência), remova o meio do frasco com uma pipeta Pasteur. Descarte o médio e a pipeta.
  7. Adicione 1-2mL de PBS 1x ao frasco, espere 1 minuto e retire o PBS.
  8. Adicione 1 mL de solução 0,05% tripsina-versa ao frasco e coloque-o na incubadora com 5% deCO2, umidade e temperatura de 37 °C por 2 minutos.
  9. Após 2 minutos, observe as células usando o microscópio invertido para confirmar que as células se desprenderam.
  10. Resuspenda as células destacadas com meio RPMI-1640 suplementado de 24 mL com 10% de FBS usando uma pipeta sorológica de 10 mL e um dispensador automático de pipeta.
    NOTA: Cada frasco de cultura de 25 ou 75 cm² com uma monocamada confluente é capaz de se replicar em 5 ou 15 outros frascos de cultura de 25 cm², respectivamente.
  11. Após adicionar o volume necessário de meio (24 mL), homogeneize a suspensão celular com a pipeta sorológica.
  12. Transfira 4 mL da suspensão celular em meio para cada 2 frascos de 25 cm ou 12 mL para2 frascos de 75 cm. Lembre-se de deixar 4 mL de suspensão celular no frasco inicial.
  13. Coloque os frascos em uma incubadora com 5% deCO2, umidade e temperatura de 37 °C.
  14. Espere até que uma monocamada completa de células seja obtida (100% da confluência).
    NOTA: Identifique cada cantil com a data e o número da passagem.

6. Preparação de placas de cultivo

  1. Inspecione a integridade da monocamada celular (100% de confluência) no frasco de cultura usando um microscópio invertido.
  2. Siga o procedimento de tripsinização conforme descrito acima (etapas 5.7-5.9).
  3. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, ressuspenda as células destacadas com meio RPMI de 4 mL e transfira-as para um tubo cônico de 15 mL.
  4. Centrifuge a 200 x g por 5 minutos em temperatura ambiente por 5 minutos.
  5. Descarte cuidadosamente o sobrenadante.
  6. Resuspenda o pellet da célula com 1 mL de meio RPMI-1640 novo.
  7. Homogeneize usando um misturador de vórtice.
  8. Transfira 10 μL para um tubo de 1,5 mL contendo 490 μL de uma solução de formaldeído a 4% (diluição 1:50) usando uma micropipeta com ponta estéril.
    NOTA: Fator de diluição = (Volume Total (μL)) / (Volume da amostra (μL))
  9. Montar uma câmara Neubauer.
  10. Homogeneize a solução fixadora com os parasitas (preparada no item 6.8) usando um misturador de vórtice.
  11. Adicione 10 μL da solução com os parasitas fixos na câmara de Neubauer.
  12. Conte os quatro quadrantes da câmara de Neubauer, cada um composto por 16 quadrados.
  13. Determine o número de células por mL:
    Número de células (por mL) = [(n° células por quadrado)/4] x Fd x 104
    Onde:
    Fd (fator de diluição) = 50
  14. Semeie cada poço de uma placa de cultura de 12 ou 6 poços, com 5 × 10células de 4 ou 1 x 10 de5 células, respectivamente, ressuspensas em 1 ou 2 mL de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS.
  15. Coloque as placas em uma incubadora com 5% deCO2, atmosfera úmida e temperatura de 37 °C.
  16. Espere até que a monocamada celular atinja 100% de confluência.

7. Cultivo in vitro com taquizoíto

NOTA: Para o ensaio de placas, recomendamos a cepa de RH de T. gondii.

  1. Descarte o meio antigo de um frasco2 de 25 cm contendo uma monocamada completa (100% de confluência) de células NHDF usando uma pipeta Pasteur. Em seguida, adicione 4 mL de meio completo RPMI-1640 novo ao frasco.
  2. Transfira 5 μL de um sobrenadante contendo taquizoítos frescos emissos de um frasco anterior com uma cultura infectada lisada. O volume de 5 μL permite um ciclo lítico de 6-7 dias por frasco de 25 cm².
  3. Coloque o novo frasco infectado em uma incubadora com 5% deCO2, atmosfera úmida e temperatura de 37 °C.

8. Quantificação de taquizoítos

  1. Remova o meio do frasco de cultura contendo parasitas recém-expulsos usando uma pipeta Pasteur e transfira para um tubo cônico de 15 mL.
  2. Centrifuge o tubo a 760 x g em temperatura ambiente por 2 minutos. Quando o ciclo de centrifugação termina, um pellet visível é visto na parte inferior do tubo.
  3. Descarte cuidadosamente o sobrenadante.
  4. Ressuspenda o pellet parasita com 1 mL de meio RPMI-1640 fresco com 2% de FBS.
  5. Homogeneize a suspensão parasita usando um misturador de vórtice.
  6. Transfira 10 μL da suspensão parasita para um tubo de 1,5 mL contendo 490 μL de solução de formaldeído a 4% (diluição 1:50) com uma pipeta de ponta estéril.
  7. Siga os passos descritos em 6.10 a 6.12.
  8. Determine o número de taquizoítos por 1 mL.
    NOTA: Número de taquizoitos (por mL) = [(n° taquizoitos de quadrado)/4] x Fd x 104
    Onde:
    Fd (fator de diluição) = 50

9. Preparação de ensaio de placas para moléculas ativas de creening S a partir de uma quimiobiblioteca

NOTA: Este ensaio tem como objetivo identificar moléculas que reduzem a proliferação de T. gondii em mais de 50% a uma concentração de 1 μM. Antes de iniciar esse ensaio, deve ser realizado um ensaio de citotoxicidade (por exemplo, método MTS ou método MTT) para garantir que as concentrações de composto usadas no ensaio de placa não sejam tóxicas para as células hospedeiras.

  1. Confirme que as culturas celulares atingiram 100% de confluência nas placas de 12 ou 6 poços.
  2. Descarte o meio antigo e adicione 1 ou 2 mL de meio RPMI-1640 novo suplementado com 2% FBS em cada poço nas placas de 12 e 6 poços, respectivamente.
  3. Adicione os compostos a serem testados em cada poço na concentração desejada. Para a triagem inicial, recomenda-se uma concentração de 1 μM.
    NOTA: Use a seguinte fórmula para calcular o volume a ser adicionado a cada poço.
    V (μL) = (Concentração final no poço (μM) x Volume dentro do poço (μL))/(Solução stock (μM))
  4. Adicione 600 taquizoítos (para a placa de 12 poços) ou 1.000 taquizoítos (para a placa de 6 poços) da deformação RH em cada poço da placa.
    NOTA: Variações na proliferação de parasitas podem ocorrer devido a diferenças nos fornecedores de meio de cultivo ou FBS, ou às linhas celulares utilizadas. Portanto, recomenda-se realizar um experimento piloto para determinar o número ótimo de parasitas para cada condição laboratorial. Ajuste a quantidade de parasita usada neste experimento, se necessário.
  5. Coloque as placas em um incubador a 37 °C com 5% deCO2 e uma atmosfera úmida por 7 dias sem qualquer perturbação.
    ATENÇÃO: As placas não devem ser movidas ou tocadas durante o período de incubação de 7 dias. Se isso acontecer, o experimento será arruinado.

10. Coloração de placas com violeta cristalino e aquisição de imagem

  1. Após 7 dias, retire o meio de cada poço.
  2. Lave cada poço cuidadosamente com 1x PBS em temperatura ambiente.
  3. Descarte o PBS e adicione cuidadosamente 1 mL de álcool a 70% em cada poço. Deixe em temperatura ambiente por 15 minutos e depois descarte.
  4. Adicione a solução aquosa de violeta cristalina a 0,5% e deixe descansar por 30 minutos em temperatura ambiente.
  5. Remova a solução de violeta cristalina.
  6. Lave cada poço cuidadosamente uma vez com água desionizada.
    ATENÇÃO: Ao remover o meio ou PBS durante as etapas de lavagem, não toque no fundo do poço com a ponta da pipeta, pois isso pode danificar a integridade da monocamada. Durante as etapas de lavagem, não jogue um jato de PBS ou álcool diretamente sobre as células. Adicione-as cuidadosamente ao longo da borda do poço.
  7. Coloque a placa virada para baixo sobre papel absorvente para drenar o excesso de água e deixe secar em temperatura ambiente por 24 horas.
  8. Fotografe as placas usando um scanner de alta definição28,29 ou um sistema de documentação de imagem configurado para a opção de gel azulCoomassie 21,22,30.

11. Ensaio de reversibilidade

NOTA: O objetivo principal do ensaio de reversibilidade com taquizoítos de T. gondii é determinar se a capacidade de proliferação dos parasitas tratados é completamente abolida ou reduzida após a remoção dos compostos do meiode cultivo 31.

  1. Semeie uma placa de 6 poços com células NHDF, conforme descrito no passo 6. Para cada poço, adicione 1 x 105 células ressuspensas em 2 mL de RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS.
    NOTA: Assim que a monocamada celular atinge 100% de confluência em cada poço, a placa está pronta para o ensaio da placa.
  2. Descarte o meio e adicione 1 x 104 taquizoitos resuspensos em 2 mL de meio fresco com 2% de FBS em cada poço.
  3. Após permitir que os taquizoítos interajam com as células NHDF por 1 hora, adicione os compostos selecionados em uma concentração final próxima ao valor de 90% da concentração inibitória (IC90). Um poço contendo apenas o diluiente do medicamento é usado como controle positivo.
  4. Trate os taquizoítos por 4 dias em incubadora a 37 °C com 5% de CO2 e ambiente úmido.
  5. Após o período de tratamento de 4 dias, lave a placa três vezes com 1x PBS a 37 °C para garantir a remoção completa dos compostos.
  6. Adicione a cada poço 2 mL de meio fresco sem os compostos e mantenha a placa na incubadora por mais 7 dias.
  7. Tinga a placa com corante violeta cristalino e fotografe-a conforme descrito no passo 10.

12. Análise de imagens usando o software ImageJ

  1. Abra as imagens usando o softwareImageJ 32.
  2. Selecione a área correspondente a um poço usando a ferramenta de seleção oval (Figura 1A,B).
    NOTA: Ao fazer a seleção, ignore as regiões nas bordas dos poços que apresentam defeitos. Esses estão comumente presentes nas bordas do poço.
  3. Copie e crie uma nova imagem: copie a área selecionada pressionando Ctrl + C; criar um novo arquivo de imagem pressionando Ctrl + N; cole a imagem copiada na nova janela preta usando Ctrl + V.
    NOTA: Ao criar a nova imagem, use as configurações padrão: 8-bit, preencha com preto, 512 x 512 pixels e uma fatia (Figura 1C).
  4. Navegue para: Imagem > Ajustar > Limiar, ou pressione Ctrl + Shift + T (Figura 1D).
  5. Na janela do Limiar, selecione as opções Huang e Red , depois clique em Auto (Figura 1E).
  6. Clique em Analisar, depois selecione Analisar Partículas (Figura 1F). Mantenha as opções padrão na janela que aparece e clique em OK (Figura 1G).
  7. Uma nova janela vai se abrir. Copie o valor exibido em %Área (destacado por um retângulo vermelho na Figura 1H) para calcular a porcentagem de proliferação ou inibição do parasita.
  8. Repita esses passos para cada poço na placa.
  9. Para calcular a porcentagem de proliferação, use a seguinte fórmula:
    % de proliferação = (%Poço de área tratada/%Poço de controle de área) × 100
  10. Para calcular a porcentagem de inibição, use a seguinte fórmula:
    % de inibição = [1- (%Poço de área tratada/%Poço de controle de área)] × 100

Figura 1
Figura 1: Análise passo a passo dos resultados no software ImageJ. (A) Seleção de ferramentas "oval". (B) Seleção da área de interesse na imagem. (C) Nova janela de imagem (Ctrl + N) com configurações recomendadas. (D) Etapas para "Análise de limiar após colar a área de interesse na nova janela de imagem." (E) Huang e seleção de opções vermelhas na janela de Limiar, resultando em todas as áreas brancas preenchidas em vermelho. (F) Sequência dos passos usados para o "Analisar Partículas". (G) O cenário usado para analisar as partículas. (H) O resultado da porcentagem da área total destruída é mostrado na janela de resumo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

13. Análise estatística

  1. Organize os dados em uma planilha Excel dentro do software Office após calcular a porcentagem de inibição da proliferação.
  2. Abra o software GraphPad Prism 5.0 e clique em XY (Abaixo de Nova Tabela & Gráfico).
  3. Na seção Y (abaixo da "barra X:error"), insira o número de repetições de dados (tipicamente três réplicas biológicas). Esse número pode variar dependendo do número de repetições realizadas.
  4. Selecione Média apenas ao lado do gráfico e NÃO selecione "Introduza e plote valores de erro já calculados em outro lugar", depois clique em Criar.
  5. Coloque os dados de concentração no eixo X e os dados percentuais de inibição da proliferação nas colunas A, A:Y1, A:Y2, A:Y3, A:Y4, A:Y5.
  6. Clique em = Analisar, depois clique em Transformar, e então OK. Uma nova janela vai se abrir. Nesta nova janela, clique em Transformar valores X usando X = Log(X), depois clique em Criar um novo gráfico dos resultados, e então OK.
  7. Clique em = Analisar e depois em Normalizar. Uma nova janela vai se abrir. Na seção Como 0% é definido?, clique e defina Y = 0,0. Na seção Como é 100% definido?, clique e defina Y = 100; selecione Percentuais e clique em Criar um novo gráfico dos resultados.
  8. Clique no símbolo: Ajustar uma curva com regressão não linear localizada acima = Analisar. Clique em Dose-resposta - Inibição, depois em logaritário (inibidor) vs. resposta normalizada - Inclinação variável, e então clique em OK.
    NOTA: Uma janela será aberta exibindo os seguintes resultados: o IC50 (Concentração Inibitória de 50%), o intervalo de confiança de 95% e o valor R2. Esses valores são cruciais e devem ser incluídos em uma tabela de resultados dentro do artigo.
  9. Para estimar outras concentrações inibitórias, como IC25, IC90 ou IC95, use o link (https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm), Quick Calcs - GraphPad; EC: concentração eficaz. Informe o IC50 e o HillSlope obtidos pelo software Prism para cada droga testada.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para avaliar o ensaio de placas após o tratamento, tanto os controles positivos (células infectadas com taquizoítos e não tratadas) quanto negativos (células não infectadas com 0,1% de DMSO) são cruciais. Ao final do experimento, o poço controle positivo deve apresentar espaços vazios bem definidos com remanescentes de células aderidas (Figura 2). Em contraste, o poço de controle negativo deve exibir uma monocamada intacta sem espaços vazios. O controle negativo é crucial para confirmar a in...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A padronização de novos protocolos para testes antiproliferativos é um passo fundamental para o avanço da pesquisa científica na identificação de futuros medicamentos. O protocolo apresentado aqui oferece uma abordagem alternativa para avaliar in vitro a atividade de moléculas bioativas contra taquizoítos de T. gondii. Considerando que T. gondii é um parasita intracelular obrigatório que se locomota por motilidade deslizante, quando os parasitas saem de uma cél...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores também agradecem o financiamento do Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) e CAPES/PROEX. Os autores gostariam de agradecer à Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais pelo apoio a essa pesquisa. ESMD (CNPq 308082/2023-0) e RWAV (CNPq 305574/2021-3) são bolsistas de produtividade do CNPq.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% Tripsina-EDTATecnologias de Vida25300-062
Pipeta sorológica de 10 mLOlenK17-110
Centrífuga Falcon tube de 15mLFanemModelo: 206
Pipeta sorológica de 5 mLOlenK17-115
Placa de cultura de 6 poçosSarstedt833920
Balanço analíticoMettler Toledo Modelo: AB204 Número de Série: 1116473813
Antibiótico-Antimicoótico (100X)Tecnologias de Vida15240-062
Pipeta automáticaKasviK1-AID
CentrífugaEppendorfModelo 5415 R Número de Série: 0023591
Incubadora CO2PHC CorporationModelo Nº: MCO-230AICUVL-PA Número de Série: 210360090
Garrafa de cultura 25 cm²Sarstedt833910
Dimetil sulfóxido (DMSO) P.A.Merck 1,02,95,21,000
Ethanol P.AMerck1,00,98,31,000
Soro Bovino Fetal (FBS)Tecnologias de Vida12657-029
Formaldeído 37-38%Panreac131328
GraphPad Prism GraphPad Software-Versão 8.0.1
ImageJ  software --Versão 1.52e
Sistemas de documentação de imagemBio-RadModelo:  Sistema de Imagem ChemiDoc MP Número de Série: 734BR2249
Exaustor de fluxo laminarVeco do BrasilModelo: VLFS-09
L-glutamina 200 mM (100X)Tecnologias de Vida25030-081
Microtubo 0,5 mLSarstedt72,699
Fibroblasto Dérmico Humano Normal Neonatal (NHDF)LonzaCC-3132Generosamente fornecido pela Dra. Sheila Nardelli, de Fiocruz Paraná, Brasil
Câmara de Neubauer 0,100 mm 0,0025 mm²Nova Óptica7301-1
PhmeterMicronalModelo: B374 Número de série: 30/37
Pipeta 20-200 & micro; LKasvi básico22032893
Pipeta 2-20 & micro; LLabmate Pro656630226
Pipeta  0.2-2 & micro; LLabmate Pro556610114
Pipeta  1000-5.000 & micro; LUniscienceYM4A021482
Pipeta  100-1000 & micro; LEppendorf Research PlusQ34354C
Fosfato de potássio monobásico   (KH2PO4) P.A Sintetizador01F2002.01.AF
RPMI-1640 médioSigma-Aldrich R0883
Cloreto de sódio (NaCl) P.A. Cromoline Quí mica Fina -
Dibásico de fosfato de sódio (Na2HPO4) P.A.CRQ Produtos Quimicos EireliR2715920500
Dica 1.000 & micro; LSarstedt7,01,186
Dica 10 & micro; LSarstedt7,03,010
Dica 5.000 & micro; LSarstedt70,11,83,001
Dica e ponta; 200 & micro; LSarstedt7,03,030
Pipeta de transferência   (3,5 mL) Sarstedt86,11,71,001
Tubo 15 mLSarstedt6,25,54,502
Cristal VioletaMerck101408
Misturador de vórticePhoenixModelo: AP56 Número de série: 6633
Banho-mariaHemoquimica do BrasilModelo: HM1003 Número de Série: 700001556

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molan, A., Nosaka, K., Hunter, M., Wang, W. Global status of Toxoplasma gondii infection: systematic review and prevalence snapshots. Trop Biomed. 36 (4), 898-925 (2019).
  2. Bigna, J. J., et al. Global, regional, and country seroprevalence of Toxoplasma gondii in pregnant women: A systematic review, modelling and meta-analysis. Sci Rep. 10 (1), 12102(2020).
  3. Dian, S., Ganiem, A. R., Ekawardhani, S. Cerebral toxoplasmosis in HIV-infected patients: A review. Pathog Glob Health. 117 (1), 14-23 (2023).
  4. Wang, Z. -D., et al. Toxoplasma gondii Infection in Immunocompromised Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. Front Microbiol. 8, 389(2017).
  5. Layton, J., et al. Clinical spectrum, radiological findings, and outcomes of severe toxoplasmosis in immunocompetent hosts: A systematic review. Pathogens. 12 (4), 543(2023).
  6. Weiss, L. M., Dubey,, Jitender, P. Toxoplasmosis: A history of clinical observations. Int J Parasitology. 39 (8), 895-901 (2009).
  7. Fabiani, S., et al. Ocular toxoplasmosis, an overview focusing on clinical aspects. Acta Trop. 225, 106180(2022).
  8. Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: Clinical features, pathology and management. Clin Exp Ophthalmol. 41 (1), 95-108 (2013).
  9. Dunay, I. R., Gajurel, K., Dhakal, R., Liesenfeld, O., Montoya, J. G. Treatment of Toxoplasmosis: Historical perspective, animal models, and current clinical practice. Clin Microbiol Rev. 31 (4), e00057-e00117 (2018).
  10. Wei, H. -X., Wei, S. -S., Lindsay, D. S., Peng, H. -J. A systematic review and meta-analysis of the efficacy of anti-Toxoplasma gondii medicines in humans. PloS One. 10 (9), e0138204(2015).
  11. Shammaa, A. M., Powell, T. G., Benmerzouga, I. Adverse outcomes associated with the treatment of Toxoplasma infections. Sci Rep. 11 (1), 1035(2021).
  12. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nat Biotechnol. 32 (1), 40-51 (2014).
  13. Paul, S. M., et al. How to improve R&D productivity: The pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 9 (3), 203-214 (2010).
  14. Andrade, E. L., et al. Non-clinical studies required for new drug development - Part I: Early in silico and in vitro studies, new target discovery and validation, proof of principles and robustness of animal studies. Braz J Med Biol Res. 49 (11), e5644(2016).
  15. Brodniewicz, T., Grynkiewicz, G. Preclinical drug development. Acta Poloniae Pharmaceutica. 67 (6), 578-585 (2010).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Roberts, C. O., Chaparas, S. D., McLaughlin, D. The use of the plaque assay in chemotherapeutic and dermal hypersensitivity studies on Toxoplasma gondii. Trans Am Microsc Soc. 95 (3), 470(1976).
  18. Mo, J., et al. Effect of the Pseudomonas metabolites HQNO on the Toxoplasma gondii RH strain in vitro and in vivo. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 21, 74-80 (2023).
  19. Barbosa, B. F., et al. Enrofloxacin is able to control Toxoplasma gondii infection in both in vitro and in vivo experimental models. Vet Parasitol. 187 (1-2), 44-52 (2012).
  20. Wall, G., Lopez-Ribot, J. L. Screening repurposing libraries for identification of drugs with novel antifungal activity. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), e00924-e01020 (2020).
  21. dos Santos, M., et al. Medicines for malaria venture pandemic box in vitro screening identifies compounds highly active against the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Trop Med Infect Dis. 8 (12), (2023).
  22. Costa, A. L. O., et al. Antiproliferative and morphological analysis triggered by drugs contained in the medicines for malaria venture COVID-box against Toxoplasma gondii tachyzoites. Microorganisms. 12 (12), 2602(2024).
  23. Ufermann, C. -M., Müller, F., Frohnecke, N., Laue, M., Seeber, F. Toxoplasma gondii plaque assays revisited: Improvements for ultrastructural and quantitative evaluation of lytic parasite growth. Exp Parasitol. 180, 19-26 (2017).
  24. Condit, R. C. Principles of virology. Fields Virology. I, 25-57 (2007).
  25. Montazeri, M., et al. In vitro and in vivo evaluation of kojic acid against Toxoplasma gondii in experimental models of acute toxoplasmosis. Exp Parasitol. 200, 7-12 (2019).
  26. Ke, O. Y., Krug, E. C., Marr, J. J., Berens, R. L. Inhibition of growth of Toxoplasma gondii by qinghaosu and derivatives. Antimicrob Agents Chemother. 34 (10), 1961-1965 (1990).
  27. Liu, X., et al. Anti-Toxoplasma gondii effects of lipopeptide derivatives of Lycosin-I. Toxins. 15 (8), 477(2023).
  28. Emi, A., et al. Development of an automated plaque-counting program for the quantification of the Chikungunya virus. Sci Rep. 15 (1), 12429(2025).
  29. Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179 (1), 81-89 (2012).
  30. Pereira Filho, A. A., et al. In vitro activity of essential oils from piper species (Piperaceae) against tachyzoites of Toxoplasma gondii. Metabolites. 13 (1), 95(2023).
  31. Martins-Duarte, E. S., et al. In vitro activity of N-phenyl-1,10-phenanthroline-2-amines against tachyzoites and bradyzoites of Toxoplasma gondii. Bioorg Medl Chem. 50, 116467(2021).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Subramanian, G., et al. Targeted phenotypic screening in Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii reveals novel modes of action of medicines for malaria venture malaria box molecules. mSphere. 3 (1), e00534(2018).
  34. Dans, M. G., et al. Screening the medicines for malaria venture pathogen box for invasion and egress inhibitors of the blood stage of Plasmodium falciparum reveals several inhibitory compounds. Int J Parasitol. 50 (3), 235-252 (2020).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Triagem AntiproliferativaParasita IntracelularEnsaio de Taquizo tosTriagem de F rmacosMonocamada CelularProlifera o de ParasitasProtocolo In Vitro

Artigos relacionados