Este trabalho tem como objetivo descrever um método simples de ensaio de placas para auxiliar na triagem de novas moléculas bioativas contra o estágio taquizoítico do protozoário Toxoplasma gondii.
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Artigo de método
* These authors contributed equally
Este trabalho tem como objetivo descrever um método simples de ensaio de placas para auxiliar na triagem de novas moléculas bioativas contra o estágio taquizoítico do protozoário Toxoplasma gondii.
A toxoplasmose é uma infecção parasitária comumente relacionada a lesões oculares e malformações neonatais. Desde o início dos anos 1950, o tratamento de primeira linha para essa doença tem sido baseado na combinação de sulfadiazina, pirimetamina e ácido folínico. Ao longo desses anos, apenas alguns regimes alternativos foram introduzidos. Isso destaca a necessidade de descobrir novas moléculas bioativas contra Toxoplasma gondii. Considerando que esse patógeno é um parasita intracelular obrigatório, a triagem tradicional de medicamentos em laboratório normalmente requer materiais e equipamentos caros, como ensaios usando proteínas fluorescentes ou parasitas expressores de β-galactosidase. Além disso, métodos como a quantificação por microscopia óptica podem ser demorados. O ensaio de placas é um método que avalia a intensidade da proliferação intracelular de patógenos medindo o número de regiões e a área de destruição em uma monocamada celular danificada pelo ciclo lítico do parasita. Este trabalho descreve um protocolo otimizado de ensaio de placas, projetado para rastrear moléculas ativas contra taquizoítos intracelulares de T. gondii in vitro. Esse protocolo utiliza materiais baratos e um sistema de laboratório simples, gerando resultados rápidos e reprodutíveis que facilitam a identificação de novas moléculas ativas contra esse parasita por diversos grupos de pesquisa.
A toxoplasmose é uma doença zoonótica com distribuição heterogênea mundial, afetando aproximadamente um terço da populaçãoglobal 1,2. Os sintomas dessa doença estão associados ao grau de imunidade do hospedeiro e à replicação doparasita 3,4. A fase aguda da doença, caracterizada pela replicação do estágio taquizoítico, é geralmente assintomática em indivíduosimunocompetentes 5,6. Em contraste, indivíduos imunocomprometidos apresentam sintomas mais frequentes, i....
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A manipulação de parasitas e culturas celulares, bem como o descarte e destino de resíduos, foram realizados de acordo com a legislação brasileira, conforme exigido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) RDC nº 222/2018. Todos os procedimentos foram supervisionados pelo Comitê Interno de Biossegurança (CIBio) do ICB-UFMG. Este estudo não envolve o uso de animais, humanos ou organismos geneticamente modificados. Bolsas do CNPq, CAPES e FAPEMIG apoiaram esse trabalho. ESMD (CNPq 308082/2023-0) e RWAV (CNPq 305574/2021-3) são bolsistas de produtividade do CNPq. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais
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Para avaliar o ensaio de placas após o tratamento, tanto os controles positivos (células infectadas com taquizoítos e não tratadas) quanto negativos (células não infectadas com 0,1% de DMSO) são cruciais. Ao final do experimento, o poço controle positivo deve apresentar espaços vazios bem definidos com remanescentes de células aderidas (Figura 2). Em contraste, o poço de controle negativo deve exibir uma monocamada intacta sem espaços vazios. O controle negativo é crucial para confirmar a in.......
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A padronização de novos protocolos para testes antiproliferativos é um passo fundamental para o avanço da pesquisa científica na identificação de futuros medicamentos. O protocolo apresentado aqui oferece uma abordagem alternativa para avaliar in vitro a atividade de moléculas bioativas contra taquizoítos de T. gondii. Considerando que T. gondii é um parasita intracelular obrigatório que se locomota por motilidade deslizante, quando os parasitas saem de uma cél.......
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Os autores declaram que não têm conflito de interesses.
Os autores também agradecem o financiamento do Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) e CAPES/PROEX. Os autores gostariam de agradecer à Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais pelo apoio a essa pesquisa. ESMD (CNPq 308082/2023-0) e RWAV (CNPq 305574/2021-3) são bolsistas de produtividade do CNPq.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-EDTA | Tecnologias de Vida | 25300-062 | |
| Pipeta sorológica de 10 mL | Olen | K17-110 | |
| Centrífuga Falcon tube de 15mL | Fanem | Modelo: 206 | |
| Pipeta sorológica de 5 mL | Olen | K17-115 | |
| Placa de cultura de 6 poços | Sarstedt | 833920 | |
| Balanço analítico | Mettler Toledo | Modelo: AB204 Número de Série: 1116473813 | |
| Antibiótico-Antimicoótico (100X) | Tecnologias de Vida | 15240-062 | |
| Pipeta automática | Kasvi | K1-AID | |
| Centrífuga | Eppendorf | Modelo 5415 R Número de Série: 0023591 | |
| Incubadora CO2 | PHC Corporation | Modelo Nº: MCO-230AICUVL-PA Número de Série: 210360090 | |
| Garrafa de cultura 25 cm² | Sarstedt | 833910 | |
| Dimetil sulfóxido (DMSO) P.A. | Merck | 1,02,95,21,000 | |
| Ethanol P.A | Merck | 1,00,98,31,000 | |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | Tecnologias de Vida | 12657-029 | |
| Formaldeído 37-38% | Panreac | 131328 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | - | Versão 8.0.1 |
| ImageJ software | - | - | Versão 1.52e |
| Sistemas de documentação de imagem | Bio-Rad | Modelo: Sistema de Imagem ChemiDoc MP Número de Série: 734BR2249 | |
| Exaustor de fluxo laminar | Veco do Brasil | Modelo: VLFS-09 | |
| L-glutamina 200 mM (100X) | Tecnologias de Vida | 25030-081 | |
| Microtubo 0,5 mL | Sarstedt | 72,699 | |
| Fibroblasto Dérmico Humano Normal Neonatal (NHDF) | Lonza | CC-3132 | Generosamente fornecido pela Dra. Sheila Nardelli, de Fiocruz Paraná, Brasil |
| Câmara de Neubauer 0,100 mm 0,0025 mm² | Nova Óptica | 7301-1 | |
| Phmeter | Micronal | Modelo: B374 Número de série: 30/37 | |
| Pipeta 20-200 & micro; L | Kasvi básico | 22032893 | |
| Pipeta 2-20 & micro; L | Labmate Pro | 656630226 | |
| Pipeta 0.2-2 & micro; L | Labmate Pro | 556610114 | |
| Pipeta 1000-5.000 & micro; L | Uniscience | YM4A021482 | |
| Pipeta 100-1000 & micro; L | Eppendorf Research Plus | Q34354C | |
| Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) P.A | Sintetizador | 01F2002.01.AF | |
| RPMI-1640 médio | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) P.A. | Cromoline Quí mica Fina | - | |
| Dibásico de fosfato de sódio (Na2HPO4) P.A. | CRQ Produtos Quimicos Eireli | R2715920500 | |
| Dica 1.000 & micro; L | Sarstedt | 7,01,186 | |
| Dica 10 & micro; L | Sarstedt | 7,03,010 | |
| Dica 5.000 & micro; L | Sarstedt | 70,11,83,001 | |
| Dica e ponta; 200 & micro; L | Sarstedt | 7,03,030 | |
| Pipeta de transferência (3,5 mL) | Sarstedt | 86,11,71,001 | |
| Tubo 15 mL | Sarstedt | 6,25,54,502 | |
| Cristal Violeta | Merck | 101408 | |
| Misturador de vórtice | Phoenix | Modelo: AP56 Número de série: 6633 | |
| Banho-maria | Hemoquimica do Brasil | Modelo: HM1003 Número de Série: 700001556 |
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