Métodos para Quantificação In Situ da Morfologia Mitocondrial em Células Musculares e Terminais de Schwann de Camundongos

Resumo

Injeções locais de um corante mitocondrial marcando mitocôndrias da célula terminal de Schwann in vivo para microscopia confocal. Esse método utiliza prova de conceito demonstrada em tecido muscular esquelético de camundongos com músculo saudável ou doente para fornecer visualização mitocondrial de alta resolução.

Resumo

A morfologia das redes mitocondriais é amplamente utilizada como indicador da saúde celular; no entanto, quantificar a arquitetura mitocondrial dentro de tecidos intactos continua sendo tecnicamente desafiador. As células terminais de Schwann (tSCs), que são essenciais para a manutenção e regeneração das junções neuromusculares, são particularmente difíceis de analisar in situ devido à sua localização anatômica e sensibilidade à perturbação tecidicular. Este protocolo descreve uma abordagem reprodutível para marcar e quantificar a morfologia da rede mitocondrial tridimensional em músculo esquelético de montagem completa e em tSCs em camundongos usando microscopia confocal padrão. O método emprega a administração in vivo de um corante mitocondrial sensível ao potencial de membrana, seguido por processamento rápido de tecidos e imagem confocal de alta resolução. As pilhas de imagens são analisadas para quantificar a conectividade, área e fragmentação da rede mitocondrial. O protocolo é validado primeiro em músculos esqueléticos distóficos e saudáveis para confirmar as diferenças esperadas na morfologia mitocondrial e, posteriormente, adaptado para visualizar e quantificar redes mitocondriais em tSCs identificados usando camundongos repórteres S100β. Essa abordagem permite a análise da morfologia mitocondrial em tecidos neuromusculares intactos sem necessidade de repórteres mitocondriais transgênicos ou plataformas especializadas de imagem. O protocolo requer apenas equipamentos comumente disponíveis em instalações centrais universitárias e pode ser adaptado para outros tecidos finos ou superficialmente acessíveis.

Introdução

As mitocôndrias são organelos notavelmente plásticos que atuam como os pulmões da célula, consumindo oxigênio durante a respiração celular para apoiar a produção de trifosfato de adenosina (ATP) em resposta à demanda^{metabólica 1}. Embora antes pensados como organelos discretos, agora entende-se que as mitocôndrias são altamente^{integradas 2,3,4}, compartilhando substrato energético em toda a sua rede, de acordo com as necessidades locais. A integração oferece uma vantagem distinta em relação ao isolamento: as mitocôndrias conectadas suportam déficits de energia, mantendo gradientes eletroquímicos para fosforilação oxidativa durante demanda metabólica elevada. De fato, a distribuição, o volume e a morfologia das mitocôndrias se adequam às necessidades energéticas em sua^{vizinhança 5}. Na saúde, a renovação regular das redes mitocondriais é mantida por biogênese mitocondrial, eventos de fusão e fissão, e^{mitofagia 2,3}. A biogênese mitocondrial é necessária para manter e expandir mitocôndrias saudáveis. A demanda metabólica, como exercícios físicos, aumenta a expressão do receptor ativado pelo proliferador de peroxissomos γ coativador 1α (PGC-1α)⁵. Esse processo ocorre por meio de sinais primários de resistência, especificamente a elevação induzida pelo exercício da proteína quinase ativada por AMP (AMPK), cálcio e espécies reativas de oxigênio ^6,7. A fusão expande as redes, promovendo sobrevivência e complementando déficits, enquanto a fissão mitiga danos mitocondriais adicionais por meio da exclusão preferencial da região ^{disfuncional 2,3,8}. Uma vez removidas, as regiões excluídas devem passar por mitofagia, prevenindo o acúmulo de organelos e proteínas^{disfuncionais 6,9}.

O músculo esquelético representa cerca de 40% da massa corporal e depende das mitocôndrias para o metabolismo aeróbico e a sinalização celular para manter a homeostase¹⁰. Coletivamente, em condições de disfunção muscular esquelética, os mecanismos de controle de qualidade mitocondrial são^{comprometidos 10}. Investigações de disfunção muscular tipicamente medem a respiração mitocondrial, volume, morfologia e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) para avaliar a qualidade mitocondrial ^3,10. Nesse sentido, durante disfunções musculares prolongadas, a respiração mitocondrial é reduzida, enquanto os ROS aumentam e as redes ficam^{fragmentadas 3,10}. Perturbações na morfologia mitocondrial surgem principalmente da ativação das proteínas de fissão mitocondrial, proteína relacionada à dinamina 1 (DRP1) e fissão mitocondrial 1 (FIS1)^2,8,11. Em resposta à atrofia muscular, o FIS1, que reside na superfície da membrana mitocondrial externa, recruta o DRP1 para oligomerizar com múltiplos dímeros de DRP1 para criar um filamento ao redor das mitocôndrias, diminuindo de tamanho até que uma determinada seção das mitocôndrias seja "presa", promovendo a^{fragmentação 3,11}. Juntas, a hiperatividade da fissão mitocondrial, as reduções na fusão de novas mitocôndrias formadas e a mitofagia disfuncional são responsáveis pela aparência fragmentada das redes mitocondriais disfuncionais, como as descritas em músculos inativos^ou doentes ^2,12.

A junção neuromuscular (NMJ) é o local da excitação muscular. Potenciais de ação iniciados no soma propagam-se ao longo dos axônios, revestidos por células de Schwann mielinizantes (SCs), e terminam em NMJs, que são encapsuladas por células de Schwann terminais (tSC). Os NMJs podem se regenerar após lesão. No entanto, a probabilidade e a velocidade de regeneração diminuem à medida que a distância entre o local da lesão e o NMJ aumenta^{em 13,14}. Após lesão nervosa por transsecção, esmagamento ou estiramento, os SCs se desdiferenciam para um estado progenitor desmielinizado^15,16. Os SCs desmielinizados proliferam e trabalham em conjunto com macrófagos para remodelar o ambiente local para regeneração, removendo detritos entre o local da lesão e o toco axônico proximal através da degeneração^{walleriana 17,18}. Os SCs migratórios sinalizam uma resposta inflamatória que remodela o ambiente para uma regeneração nervosa^{bem-sucedida 18}. A regeneração nervosa ocorre dentro da bainha neural formada pelos SCs progenitores, que formam faixas de Bunger, através das quais os axônios regeneram¹⁹. O toco axônico então estende filópódios para iniciar a reinervação¹⁴. Após a reinervação, a pré-sinapse pode se regenerar completamente, desde que as tSCs reinvistam no^{NMJ 20}.

A morfologia mitocondrial varia significativamente entre os tipos celulares, conformando-se à função^{do tecido 21}. Relatos de tecidos hepáticos sugerem que as mitocôndrias são mais compactas e esféricas, enquanto as da substância branca do cérebro são mais alongadas e^{tubulares 22}. Após o desafio, como em condições de envelhecimento e estresse oxidativo, as mitocôndrias nesses tecidos apresentam um fenótipo semelhante ao de um donut. No entanto, em osteoblastos, a formação e fragmentação de donuts mitocondriais foram associadas ao aumento da secreção de mitocôndrias e vesículas derivadas de mitocondrias, e à maturação dos^{osteoblastos 23}. Embora as redes mitocondriais dos músculos esqueléticos tenham sido amplamente examinadas em múltiplas espécies, permanecem limitações na imagem das redes mitocondriais a partir das tSCs do sistema nervoso periférico. Esses são difíceis de capturar em seus ambientes nativos, pois a ultraestrutura celular é significativamente alterada após o isolamento, e esses tecidos são difíceis de atacar com corante in vivo sem carregar também o músculo esquelético correspondente.

Técnicas de imagem usadas para capturar a morfologia mitocondrial em sistemas vivos podem ser categorizadas como microscopia óptica ou^{eletrônica 5}. Com a microscopia tradicional de captura de luz, corantes podem marcar células vivas, células fixas podem ser imunomarcadas e mitocôndrias podem ser geneticamente^{marcadas 5,24}. A imagem de células vivas normalmente requer incubação das células por 20 a 60 minutos antes da análise de fluorescência. Os corantes são direcionados para as mitocôndrias por meio do potencial membranar e, portanto, podem ser alterados sob condições de potencial membranar^{alterado 5}. Capturar a morfologia mitocondrial das tSCs dentro do músculo esquelético por meio da carga de corante é teoricamente possível; no entanto, isso exigiria imagens de tecidos inteiros e técnicas detalhadas de marcação. Em particular, captura mitocôndrias dentro de estruturas intactas, sem interferência da marcação dos músculos esqueléticos. Para superar essas limitações, a coloração fluorescente mitocondrial foi usada para marcar músculos esqueléticos vivos em camundongos saudáveis e distróficos, seguida pela marcação das mitocôndrias da tSC para imagens in vivo e in situ. O músculo tibial anterior (TA) foi selecionado para otimizar a imagem do músculo esquelético devido à sua localização anatômica superficial, volume de injeção bem caracterizado e dispersão^miofascial 25,26,27, além da adequação para medições funcionais concomitantes. O músculo glúteo máximo (GM) foi selecionado para imagem por TC com base em seu procedimento estabelecido^de injeção ^28,29, sua arquitetura fina, que minimiza a fluorescência de fundo, e o posicionamento ventral superficial das junções neuromusculares entre a GM e o glúteo médio, permitindo a rotulagem preferencial das tSCs antes das fibras musculares esqueléticas.

Protocolo

Macho adulto DBA/2J [Wild-type (WT)] 000671 IMSR_JAX de seis meses (n=3) e D2.B10-DMD^D2.mdx/J [D2.mdx (mdx)] (RRID: IMSR_JAX:013141), enquanto macho e fêmea adultos de três a cinco meses (n=8) B6; D2-Tg(S100-EGFP)^1Wjt/J (S100B) (RRID: IMSR_JAX:005621) [também combinado com WT dado que não há diferenças em relação ao DBA] foram usados de uma colônia contínua de camundongos mantidos pelo pesquisador. O fluxo de trabalho experimental geral para injeções de TA e GM, processamento de tecidos e imagem está resumido na Figura 1. Um D2 adicional. Mdx mouse foi doado pelo investigador para imagem de TC no mdx (n=1). Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Texas A&M University (AUP 2022-0215) e foram realizados de acordo com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição⁾³⁰. A eutanásia foi realizada por luxação cervical sob uma overdose anestésica de isoflurano.

1. Preparação de solução de trabalho de coloração mitocondrial fluorescente de 2 μM

1. Suspenda a coloração mitocondrial (50 μg) em 322 μL de dimetil sulfóxido (DMSO) conforme as instruções do fabricante para preparar uma solução de estoque de 200 μM.
2. Para preparar 30 mL de solução de trabalho de 2 μM, transfira 300 μL de solução estocada de 200 μM para 29,7 mL de soro fisiológico estéril. Misture bem.
3. Aliquota 250 μL da solução de trabalho de 2 μM em tubos de microcentrífuga e armazenada a -80 °C até o uso.
   NOTA: Nenhuma degradação detectável do sinal foi observada após 3 anos de armazenamento a -80 °C.

2. Preparo de corantes e animais

1. Descongele uma alíquota congelada 15 minutos antes da experimentação. Extraia a solução em uma seringa de insulina de 30 G, 1 cc.
2. Anestesie o animal com isoflurano. Aplique pomada oftálmica, raspe o local da injeção e mantenha a temperatura corporal usando uma lâmpada de aquecimento com uma sonda de temperatura posicionada entre o animal e a fonte de calor.
3. Limpe o local da injeção raspada com álcool isopropílico 70%.

3. Administração e função do corante mitocondrial do músculo tibial anterior (TA)

1. Administração de corantes TA
   1. Injete 50 μL de coloração mitocondrial 2 μM no músculo TA direito de camundongos anestesiados WT e D2.mdx.
   2. Insira a agulha no tendão distal em direção ao joelho e pressione o êmbolo enquanto retira a agulha ao longo do caminho da injeção.
   3. Incube o contraste in vivo por 1 hora antes da dissecação.
2. Medições da função muscular TA
   1. Após 45 minutos de incubação do contraste, anestesie o camundongo usando isoflurano (indução de 2%–3%, manutenção de 1,5%–2% em oxigênio).
   2. Expor cirurgicamente o músculo TA esquerdo enquanto preserva os tecidos ao redor. Amarre o tendão distal à viga de carga do sistema de teste muscular.
   3. Enfaixe o músculo exposto com uma lâmpada de laboratório e irriga a 3 mL min⁻¹ com 0,9% de soro fisiológico estéril aquecido a 40 °C. Mantenha a temperatura muscular em 32 °C usando uma lâmpada de calor.
   4. Posicione eletrodos de fio de platina/irídio sobre a barriga muscular para estimulação direta.
   5. Conecte o feixe de carga a um micrômetro e ajuste o comprimento ótimo (L₀) usando contrações de espasmo (T_w) a 1 Hz. Grave L₀ com um calibre digital.
   6. Induza contrações tetânicas máximas (P₀) três vezes a 140 Hz, com 60 segundos de descanso entre as contrações. Registre o valor de força mais alto (g). Obtenha dados usando o sistema de função muscular com softwares de pesquisa.
3. Processamento de tecidos TA
   1. Após a incubação, isole e disseque o músculo TA antes da eutanásia.
   2. Coloque feixes isolados de fibras musculares em paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente por 15 minutos enquanto estimula suavemente as fibras sob um estereoscópio.
      ATENÇÃO: O paraformaldeído é tóxico e deve ser manuseado em um exaustor químico enquanto se usa o equipamento de proteção individual adequado (jaleco, luvas e proteção ocular).
   3. Adicione a coloração permanente de ácido nucleico celular a uma concentração final de 5–10 μg/mL para marcar os núcleos.
   4. Lave as amostras três vezes em soro salino tamponado com fosfato (PBS) por 5 minutos cada para remover o excesso de corante.
   5. Desidrate sequencialmente em 50%, 75% e 100% de etanol por 5 minutos cada.
   6. Incubar amostras sequencialmente em soluções de limpeza de tecidos I e II por 30 minutos cada em temperatura ambiente, utilizando volume suficiente para submergir completamente o tecido.
   7. Coloque feixes de TA desobstruídos sobre uma cobertura e achate suavemente usando um bloco de vidro (2,5 cm × 2 cm × 1 cm; massa 7,8 g)²⁶.

4. Imagem de amostras de músculo TA

1. Imageie amostras musculares com um microscópio confocal para obter seções ópticas tridimensionais (3D) de alta resolução.
2. Adquira imagens Z-stack a uma profundidade de aproximadamente 100 μm para músculo usando uma lente objetiva com ampliação de 63x (N.A. 1.40).
3. Use o software confocal do sistema de imagem com comprimento de onda de excitação de 646 nm para fornecer a maior clareza com o menor fundo possível.
4. Adquira imagens usando o modo de deconvolução, empregando parâmetros "System Optimized" com passos de 1 μm.
   NOTA: Para combater a desidratação e o fotobranqueamento, transfira os tecidos para a solução de limpeza de tecidos II e coloque-os em uma capa de cobertura. Coloque duas gotas de solução de limpeza 2 diretamente sobre o tecido antes da imagem.

5. Carga de corante e imagem do músculo tSC GM

1. Use camundongos S100β para identificação específica fluorescente de tSCs.
2. Realize uma pequena incisão na pele acima do músculo GM. Injete 75 μL de uma coloração mitocondrial fluorescente vermelho distante de 2 μM abaixo do GM, antes do fechamento da^{ferida 25}.
3. Feche a ferida e deixe o corante incubar por 45 minutos para marcar seletivamente as células de lata sem marcar significativamente as fibras musculares subjacentes.
4. Disseca os músculos GM e imediatamente coloque-os em soro fisiológico gelado a 0,9%. Corte rapidamente o excesso de gordura e tecido conjuntivo.
5. Transfira os GMs dissecados para uma capa de cobertura para imagem.
6. Somente se estiver usando camundongos D2.mdx, adicione o corante receptor fluorescente de acetilcolina (AChR) em diluição 1:500 ao banho de microdissecação. Incube o tecido por 30 minutos para visualizar os componentes pós-sinápticos da junção neuromuscular (NMJ).
7. Use essa abordagem de marcação dupla para diferenciar mitocôndrias pós-sinápticas de mitocôndrias específicas para tSC.
   ATENÇÃO: Limite a dissecação e limpeza do GM a no máximo 10 minutos antes de ser colocado em uma capa para imagem, minimizando as alterações morfológicas após a dissecação. Esse limite de tempo é crítico para minimizar as mudanças morfológicas pós-dissecação e a degradação mitocondrial.
8. Realizar microscopia confocal para obter seções ópticas tridimensionais (3D) de alta resolução.
9. Adquira imagens Z-stack a uma profundidade aproximada de 16 μm para tSCs usando uma lente objetiva com ampliação 20x (N.A. 0,75). Adquira imagens representativas em alta resolução de tSCs individuais usando uma lente objetiva com ampliação de 63x.
10. Implemente procedimentos de montagem para minimizar a desidratação dos tecidos e o fotobranqueamento durante a sessão de imagem.
    ATENÇÃO: Transfira os tecidos em soro para um coverslip, garantindo que o lado ventral fique voltado para baixo para microscopia invertida.
11. Aplique 2 μL de meio de montagem geral na superfície dorsal do GM.
12. Achate suavemente o tecido usando um bloco de vidro calibrado (2,5 cm × 2 cm × 1 cm; massa 7,8 g) para garantir um plano de imagem uniforme.

6. Microscopia de feixe de íons focados

1. Realizar microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focados (FIB-SEM) de acordo com protocolos^{previamente estabelecidos 26}.
   1. Aplique FIB-SEM especificamente para confirmar e visualizar novas características morfológicas identificadas durante a imagem confocal.

7. Análise de imagens

1. Amostras de músculo TA
   1. Realizar análise quantitativa de seções ópticas confocais (1 μm) de varreduras TA (aproximadamente 75–112 μm de espessura) utilizando software de análise de imagem impulsionado por IA.
      NOTA: Realize múltiplas sessões de treinamento supervisionadas antes da segmentação automatizada para melhorar a adaptação do algoritmo.
   2. Importar seções ópticas individuais (Z-slices) para ensinar o software a reter informações pixeladas representando corante mitocondrial branco, excluindo o fundo preto.
   3. Desenvolva máscaras de imagem para revisão pelo pesquisador, garantindo análise e precisão de alta qualidade.
   4. Separe as pilhas de imagens 3D em seções ópticas únicas após otimização por algoritmo.
   5. Selecione a cada quinta fatia Z de cada imagem 3D para análise, com cada ponto de dados representando a média dessas seções individuais por amostra.
   6. Quantifique a morfologia mitocondrial para derivar métricas de distribuição espacial e conectividade de rede.
   7. Padronize limiares de intensidade, configurações de detecção de bordas e calibração do tamanho dos voxels em todas as amostras para minimizar a variabilidade experimental.
2. TSCs em amostras GM
   1. Montar seções ópticas de 1 μm em pilhas Z (aproximadamente 6–25 μm de espessura) e separar as imagens em canais de cor individuais usando software de análise de imagem 2D.
   2. Calibre o software usando barras de balança e aplique limiar para otimizar a visualização das mitocôndrias tSC com interferência mínima de fundo.
   3. Realize binarização e remova ruído de fundo para isolar as mitocôndrias ou tSCs para a medição de área e contagem de partículas.
   4. Salve imagens binárias para garantir o processamento consistente e realize todos os experimentos de imagem sob condições idênticas para garantir a reprodutibilidade entre réplicas biológicas.

8. Imunohistoquímica

1. Inglobar amostras do músculo TA esquerdo em composto de temperatura de corte ideal (OCT) para avaliar a área da seção transversal (CSA).
   1. Amostras em seção com espessura de 10 μm usando criostato ajustado a -17°C e coletadas em lâminas de microscópio.
   2. Seções transversais musculares de tingimento para laminina para identificar bordas de miofibras usando anticorpo primário antilaminina de coelho (1:400) e anticorpo secundário anti-coelho de coelho rodamina (1:400).
   3. Monte as lâminas usando um meio de montagem apropriado antes da imagem.
2. Imagem de lâminas usando um microscópio confocal selecionando aleatoriamente 2–3 regiões de interesse (580 x 580 μm) por amostra com um objetivo de 20x (N.A. 0,75).
3. Valores médios por região por músculo e analisar aproximadamente 400 miofibras por seção do músculo TA.
4. Use um software semiautomático de segmentação muscular para determinar a CSA (μm²) mascarando as miofibras.

9. Análise estatística

1. Reporte os dados resumidos como média ± erro padrão da média (S.E.M.).
2. Realize análise estatística usando um software estatístico dedicado, utilizando testes t de Student paramétricos e não pareados para determinar a significância entre diferenças médias de grupos.
3. Realizar regressões lineares simples sobre CSA e força muscular a partir dos músculos TA, utilizando esses como marcadores da patologia da DMD para comparar a morfologia mitocondrial do músculo TA e dos tSCs GM.
4. Avalie os coeficientes de correlação de Pearson r para determinar a correlação entre a patologia da DMD e a patologia mitocondrial. Defina significância estatística como P ≤ 0,05.

Resultados

Redes mitocondriais apresentaram reduções esperadas na conectividade
Imagens representativas 3D fluorescentes de varreduras confocais musculares TA em dois grupos, WT e mdx, são apresentadas (Figura 2). Em comparação com o grupo WT, a conectividade mitocondrial parece reduzida em camundongos mdx em comparação com o WT (Figura 2A–D). Um número maior de pequenos fragmentos mitocondriais foi obs...

Discussão

A localização das mitocôndrias dentro das estruturas celulares, assim como sua morfologia, correlaciona-se com a saúde mitocondrial e a demanda^{metabólica 21}. Dada a relevância clínica da saúde mitocondrial, aliada à cinetica respiratória divergente e morfologias de diferentes tipos celulares, um método de microscopia confocal de fácil aplicação para avaliação de morfologias mitocondriais em tSCs foi desenvolvido após a primeira avaliação do método no músculo esque...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3-in-1 Whole Animal System	Aurora Scientific, Ontario, Canada	1300A	Muscle funciton system with analysis software
AIVIA	Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA	15	AI driven image analysis software
anti-laminin	MilliporeSigma	L9393-.2mL	myofiber boarder label
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:005621	S100β
Cryostar NX50 Cryostat	Epredia, Kalamazoo, MI, USA	https://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50	Cryostat
D2.B10-DMDD2.mdx/J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:13141	D2.mdx
DBA/2J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:00671	WT
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	BP231-100	Mitochondrial stain reconstitution reagent
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Cell-permeant nucleic acid stain
ImageJ/Fiji	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	SCR_002285	2D analysis software
Invitrogen ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Fisher Scientific, Hampton, NJ, USA	P36941	Mounting medium
KimWipe	Kimberly-Clark, Irving, TX, USA	06-666A	Laboratory wipes
Leica LAS_X software	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	SCR_013673	Confocal software
MitoView Fix 640	Biotium	70075-50ug	Far-red fluorescent mitochondrial stain
NIS-Elements Advanced Research software	Nikon, Melville, NY, USA	SCR_014329	Cross sectional area analysis software
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA	#SP15-100	General mounting media
Prism 9 software	GraphPad Software, La Jolla, CA, USA	RRID: SCR_002798	Statistical analysis software
Rhodamine (TRITC)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	AP132RMI	Secondary antibody
Stellaris 5 White Light Confocal Microscope and corresponding deconvolution software	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	158301313:158201310:158004752: 158301312:158301314:158401100: 158209011:158301130:158204510: 158301120:158401140:158204511: 15500332:15506428:15506517:155 13859:15521522:15525226:155252 32:15525314:15555009:15555017: 15555046:27100022:155933660: 155933666:155933668:158000640 :158002407:158003150:158004141 :158004201:158004421:158004423 :158200681:158202140:158203114: 158203200:158203220:158204201: 158204510:158204709:158301200: 9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP _CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_ LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C	Confocal microscope
SZ61	Olympus, Breinigsville, PA, USA	sz61	Stereo microscope
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA	23-730-571	Optimal cutting temperature compound
Visikol I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1-30	Tissue clearing solution 1
Visikol II	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H2-30	Tissue clearing solution 2
α-bungarotoxin 552	Biotrend, Koln, Germany	00014	Acetylcholine receptor dye