Artigo de método

Um Modelo Pré-Clínico de Sinovite Utilizando Tecido Sinovial Humano Ex Vivo com Função e Arquitetura Preservadas

DOI:

10.3791/69734

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20 de março de 2026

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1Department of Emergency Medicine, University of Iowa Health Care, 2Interdisciplinary Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 3Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Iowa Health Care, 4Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Office of Research and Development, Iowa City Veterans Affairs Health Care System, 6Department of Internal Medicine, University of Iowa Health Care, 7Iowa State University, 8Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desenvolvemos um sistema transwell ex vivo humano capaz de avaliar alterações inflamatórias agudas, infecciosas e estruturais na sinovia.

Resumo

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A artrite é um estado inflamatório nas articulações que resulta em danos na cartilagem, dor e perda de mobilidade. Avanços recentes em pesquisas sobre artrite demonstram especificamente que a cápsula articular (por exemplo, sinóvia) é uma fonte importante dessa inflamação, mas não existem modelos humanos que repliquem a arquitetura sinovial essencial. Para resolver isso, foi criado o Sistema de Análise Espacial Conjunta, ou JSAS. Sinóvia anterior foi obtida intraoperatório de pacientes submetidos à Artroplastia Total do Joelho (ATC). O Synovium foi dissecado e seccionado em núcleos de biópsia de 3 mm. Os núcleos foram colocados no poço superior de um poço trans de 5 μm ou 0,4 μm com 300 μl de DMEM com 10% de FBS. No poço inferior, 600 μL de meio eram adicionados e trocados a cada 2-3 dias. A viabilidade foi avaliada até 7 dias em condições de incubação hiperóxicas (50%), atmosféricas/padrão (~21%) e fisiológicas (5%). Estímulos no poço inferior incluíram proteína quimioatrativa de monócitos 1 (MCP-1/CCL2), lipopolissacarídeo (LPS), N-acetil cisteína, S. aureus e B. burgdorferi. O meio era armazenado para ELISA, e tecido era armazenado para análise com parafina fixa de formolão (FFPE). Em condições padrão, a sinóvia permaneceu totalmente viável por 3 dias. O estímulo modificou a estrutura e a função do revestimento íntimo e das células sinoviais sub-revestimentas, incluindo a perda da borda residente do macrófago, expansão do subrevestimento, regulação para cima de fibroblastos patogênicos e produção de citocinas IL-1β e TNFα. Células imunes e fibroblastos migraram para a câmara inferior (poros de 5 μm) por análise de citometria de fluxo. O B. burgdorferi móvel migrou para o tecido com o tamanho de poro de 0,4 μm, enquanto o S. aureus não móvel não. Citocinas relevantes foram expressas em quantidade suficiente para o ELISA. O JSAS é um sistema modular capaz de estudar alterações agudas em sinóvios humanos, permitindo a complexidade de estruturas 3D em um modelo pré-clínico, mantendo a estrutura e função biologicamente relevantes.

Introdução

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A artrite afeta mais de 20% de todos os adultos nos EUA e 50% dos maiores de 65 anos com condiçõescrônicas 1. Também é uma das principais causas de deficiência em todoo mundo 2. A artrite inclui não apenas danos à cartilagem, mas também inflamação da cápsula articular ou da sinóvia (por exemplo, sinovite). A sinovite crônica provavelmente é uma fonte importante de citocinas pró-inflamatórias que potenciam danos ósseos e cartilaginosos na osteoartrite e artritereumatoide 3,4. Portanto, compreender as mudanças imunológicas mediadas dentro da sinóvia provavelmente é essencial para desenvolver novas opções terapêuticas e possivelmente preventivas para pacientes com artrite.

O sinovum é uma estrutura organizada composta por duas camadas principais: o revestimento íntimo celular (IntL) e o subrevestimento (SubL). O IntL interage com o fluido sinovial (SF), e o SubL produz componentes de SF e contém estruturasvasculares 5. Dentro do IntL, existem tanto macrófagos quanto sinóviócitos semelhantes a fibroblastos (FLS). Os macrófagos do IntL são células residentes, localmente renovadas por macrófagos intersticiais dentro do SubL6. Esses macrófagos sinoviais residentes (RSMs) são enviesados para M2 pela expressão de CD206 e TREM2, epitelalizados e expressam marcadores de junção apertada. Essa subestrutura do IntL pode ser fundamental para manter funcional e fisicamente a homeostase do espaçoarticular 5,6. Isso foi observado na artrite reumatoide (AR). Por exemplo, quando o IntL quebra, pacientes com artrite reumatoide apresentam sintomas de crise, que desaparecem quando o revestimento sereconstrói 6,7. A remissão espontânea da AR está especificamente associada a MerTK +CD206+ macrófagossinoviais 7. RSMs também foram identificados em SF de pacientes com dor articular aguda, encontrando que a gravidade de doenças infecciosas ou inflamatórias correlacionava-se com a quantidade de RSMs e citocinasinflamatórias 8. Infelizmente, a relação entre as estruturas IntL e SubL, alterações funcionais dos RSMs e FLS, e a produção de mediadores inflamatórios que podem danificar cartilagem e/ou osso é difícil de questionar, especialmente em humanos.

Para consultar os mecanismos subjacentes da sinovite em múltiplos contextos clinicamente relevantes, foi desenvolvido um modelo ex vivo humano chamado Sistema de Análise Conjunta do Espaço (JSAS). Esse sistema produz resultados reprodutíveis com elementos modulares para permitir uma avaliação ampla da artrite inflamatória e infecciosa. Este artigo descreve os processos de aquisição de tecido em cirurgias comuns de articulação aberta, como substituição total da articulação, projeto JSAS, a histomorfometria necessária para quantificar alterações estruturais agudas na sinóvia e as respostas funcionais do tecido, incluindo imunofluorescência (FI), RNAscopo e ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA). O JSAS difere dos modelos comuns de in vitro humana por manter as estruturas IntL e SubL, permitindo insights quase in vivo sobre sinovite aguda ou aguda em crônica, que leva a danos na cartilagem. Ao manter a estrutura nativa da sinóvia, é possível dissecar as capacidades intrínsecas do RSM e FLS para amortecer ou perpetuar a inflamação. Como modelo ex vivo , ele não requer diferenciação das células imunes periféricas em macrófagos sinoviais nem simplificação excessiva do sinóvio para apenas 1-2 tipos celulares distintos. Ela difere de modelos animais como a Artrite Induzida por Colágeno (CIA) ao utilizar tecido humano naturalmente doente, permitindo uma avaliação específica do patógeno que é relevante para humanos. Por fim, múltiplas infecções podem ser simuladas, permitindo um modelo de artrite séptica além da osteoartrite e artrite inflamatória. A principal limitação é a cultura por 3 dias em condições padrão antes do início da apoptose.

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Protocolo

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O consentimento do paciente e o protocolo de processamento de tecidos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) local. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Aquisição de tecido e biópsia

  1. Identifique os pacientes pré-operatórios com base nos horários do cirurgião. Recrute pacientes de 18 a 65 anos que estejam passando por cirurgia articular aberta, como artroplastia total do joelho (ATC) ou osteotomia do tubérculo tibial (TTO, também conhecida como Fulkerson), e que não estejam em uso de medicação imunomoduladora sistêmica.
    NOTA: Idealmente, exclua pacientes que tenham feito mais de uma artroscopia ou mais de uma injeção de glicocorticoide, pois esses pacientes apresentaram maior falha intra-operatória na aquisição de tecido do que outras populações devido à fibrose. Dado o risco de transmissão de infecção, adie o recrutamento de pacientes com histórico de Hepatite C ou Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), a menos que seja relevante para os desfechos. Pratique práticas seguras de manuseio em todos os momentos com tecido humano fresco, independentemente do estado de doença infecciosa.
  2. Cirurgiões ortopédicos realizam artrotomia e dissecação como parte do procedimento cirúrgico padrão. Identifique a sínóvia anterior imediatamente proximal ao sulco troclear e utilize eletrocautério para extirpar a sinóvia em bloco, evitando a dissecação do músculo articular do gênero ou próximo aos epicôndilos medial e lateral. A sinorectomia é relativamente neutra para os desfechos da ATC e, em condições inflamatórias, pode ser benéfica 9,10. Passe a sinóvia de forma estéril ao membro da equipe de pesquisa e coloque-a em um recipiente estéril com a solução salina fosfatada (DPBS) fria de Dulbecco sobre gelo.
    NOTA: Interrompa a aquisição de tecido se houver anomalias observadas pela equipe cirúrgica ou se a sinovectomia prejudicar o fechamento ou o resultado cirúrgico. O último, em particular, seria altamente incomum na ATC, já que a excisão de sinóvia pode ser utilizada como procedimento extensível para afrouxar articulações apertadas. A quantidade de excisão depende do tamanho do experimento. É possível obter aproximadamente quatro núcleos de biópsia de 3 mm por cada 1cm 2 de tecido. Em muitos casos, é possível obter 24cm 2 ou mais de tecido. O peso do tecido depende fortemente da dissecação cirúrgica, portanto, não é tão confiável quanto a área de superfície para determinar a adequação para o experimento. A Figura 1 ilustra os passos 1.2-1.7.
  3. Devolva a sinóvia ao laboratório e lave duas vezes em DPBS frio por 10 minutos em um balancim de placa.
  4. Transfira a sinóvia para uma placa de Petri estéril de 10 cm ou maior sob condições estéreis, em um gabinete certificado para biossegurança nível 2 (BSL2). Adicione o meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) frio, estéril e com baixa glicemia, contendo piruvato de sódio e L-glutamina, o suficiente para encher o recipiente até a metade. Identifique o revestimento sinovial pela camada IntL perlada (Figura 2A), em oposição ao lado cauterizado (Figura 2B).
    NOTA: O IntL é frágil. Cuidado para não descascá-la, senão ela se dissociará do subrevestimento (Figura 2A, presa por hemostato). A perescência pode ser alterada por histórico prévio de hemarthrose (aparentando um tom amarelo-alaranjado devido à hemosiderina), IMC alto (coberto por adiposo) ou inflamação (vermelha, friável e vilosidade). É absolutamente essencial identificar corretamente o IntL antes de prosseguir. Examine cuidadosamente sinais de excisão cirúrgica, cautério, sangramento e coagulação para determinar que as seguintes etapas não estão ocorrendo no IntL.
  5. Dissecar o tecido adiposo e estroma extérico do lado cauterizado para isolar a sinovia, mantendo aproximadamente 4-5 mm de profundidade em todas as áreas. Tesouras de íris ou bisturi podem ser usadas conforme a preferência pessoal. Mude o meio da placa de Petri conforme necessário para manter o campo de visão.
    NOTA: O estroma posterior ou tecido adiposo é facilmente removido. No entanto, dificuldade com a dissecação ou a sensação de grande resistência indicam ligamento retido, metaplasia tecidual como deposição inadequada de cartilagem ou corte do IntL.
  6. Uma vez dissecados até a profundidade apropriada, obtenham-se núcleos de biópsia de 3 mm conforme necessário para um mínimo de 2 réplicas técnicas por condição testada. Execute com o revestimento sinovial voltado para a ferramenta de amostra, em vez de encostar a superfície da placa de Petri. Um punção de biópsia de qualidade pode ser usada aproximadamente 10 a 15 vezes antes de precisar ser substituída devido a desbotamento, pois uma punção de biópsia cega pode causar danos na estrutura do revestimento íntimo.
    1. Realize o núcleo com carga perpendicular forte e torção suave. Se isso torcer o tecido, a ferramenta de biópsia ficou opaca e precisa ser substituída. Estabilize com a mão não dominante usando pinças ou hemostáticos.
      NOTA: Núcleos de 3 mm foram usados para maximizar a perfusão de tecidos, assim como o número de núcleos por paciente e garantir réplicas técnicas suficientes para esses experimentos. Núcleos de tamanhos alternativos podem ser usados, mas apenas 3 mm foram testados para esse protocolo.
      NOTA: O excesso de adiposo retido devido à dissecação insuficiente pode fazer o núcleo flutuar no JSAS, o que é subótimo. Se os núcleos flutuarem para a superfície em vez de permanecerem submersos, retorne à dissecação ou escolha um núcleo submerso.
  7. Abra uma segunda placa de Petri e encha com 5-10 mL de meio aquecido (37 °C) com 10% de FBS. Com pinças planas ou sem dentes, transfira os núcleos para esse prato para lavar os detritos com 1-2 segundos de agitação mecânica suave. Não aperte os núcleos com força, pois isso pode danificar o revestimento íntimo.
    NOTA: Pode fazer uma pausa aqui por ≤24 horas ao colocar núcleos de tecido na incubadora na configuração padrão de 37 °C e 5% deCO2.

2. Criação do Sistema Conjunto de Análise Espacial (JSAS)

  1. Prepare o poço inferior do JSAS com 600 μL de DMEM de baixa glicose aquecido (37 °C) com 10% de FBS. Embora a penicilina-estreptomicina a 1% tenha sido testada sem efeitos negativos perceptíveis nesse sistema, antibióticos normalmente não são adicionados ao meio se a esterilidade for adequadamente mantida.
    NOTA: Se for co-cultivado com bactérias ou uma linhagem celular que requer um meio diferente, o poço inferior pode ser um meio diferente. Evite substrato antibiótico se estiver co-cultivando com bactérias.
  2. No poço de fundo, adicione o tratamento da sua escolha. Por exemplo, lipopolissacarídeo (LPS). Para evitar diferenças de osmolaridade, recomenda-se que o volume do tratamento não exceda 2,5% do volume total (por exemplo, ≤15 μL para 600 μL). Amortigue quaisquer mudanças de pH dos tratamentos para manter o pH de 7,0 a 7,4. Caso contrário, utilize os controles do veículo.
  3. Escolha o tamanho do poro transwell de acordo com o resultado experimental desejado (Figura 3).
  4. Adicione 300 μL de DMEM de baixa glicemia com 10% de FBS ao poço trans.
  5. Transfira suavemente os núcleos individuais com pinças estéreis para o meio do transpoço. A orientação do tecido não pode ser controlada; No entanto, a adiposidade e a flutuabilidade natural do tecido estroma fazem com que o revestimento íntimo seja naturalmente virado para baixo na maioria dos núcleos teciduais.
    1. Visualize cuidadosamente os núcleos, pois o processo de amostramento pode prejudicar o revestimento íntimo, e evite usar núcleos que pareçam desgastados no início do experimento. Se o núcleo estiver flutuante, melhore a dissecação e escolha um núcleo alternativo.
      NOTA: Considere uma matriz de colágeno se a orientação do tecido for importante; no entanto, isso impactará o tempo para desenvolver um gradiente químico com o poço do fundo.
  6. Coloque na incubadora a 37 °C e 5% deCO2 pelo tempo desejado.
    NOTA: O prazo mais cedo recomendado para alterações biológicas é de 8 horas. O último período validado para atividade biológica é de 3 dias.

3. Desmontagem experimental e análise

  1. Para histologia, utilize pinças estéreis e sem dentes para transferir tecido para 3-5 mL de formalina tamponada neutra (NBF) para análise com formalina fixada e parafina embutida (FFPE). Armazene no NBF por 3 a 7 dias antes de embedding e seccionamento.
    1. Não deixe o tecido repousar por longos períodos, pois isso piora a autofluorescência. Realizar análise histológica, incluindo coloração por hematoxilina e eosina (H&E)11 para histomorfometria, imunofluorescência (IF)12 e/ou RNAscópio com FI13 conforme métodos padrão.
      NOTA: Cuidado para não perfurar o transwell com fórceps ao remover o tecido. Seja extremamente cuidadoso ao transferir o core, ou o revestimento íntimo pode se dissociar. Coloque suavemente o núcleo em fixador e não agite. O NBF deve ser usado dentro de uma exaustão química certificada, deve ser descartado de acordo com as diretrizes locais de saúde e segurança ambiental (EHS) e não pode ser despejado em pias. O tecido humano não utilizado do experimento é colocado em excesso de água sanitária a 10% por 30 minutos, depois colocado em contenção secundária conforme os requisitos locais do EHS e, em seguida, descartado em caixas de biohazard rotuladas para incineração. A solução de água sanitária pode ser despejada na pia se aprovada pelo EHS local. Siga as diretrizes locais, que podem variar de acordo com a instituição.
  2. Incorporar réplicas técnicas no mesmo bloco FFPE. Use fitas cassete com filtro para evitar perda de amostra. Seção no eixo longitudinal com espessura de 5 μm. Coloque três seções seriadas em um slide (Figura Suplementar 1).
  3. Imagem H&E de slides em 10x e 40x usando microscopia de campo claro. Identifique o IntL como a camada celular organizada na interface entre o tecido e o espaço vazio.
    1. Adquira 3 seções representativas de 10x e 10 seções representativas de 40x em pelo menos 2 réplicas técnicas por condição de tratamento, mantendo o IntL no campo de visão. Capture imagens como TIFFs de alta resolução. Realize análise histomorfométrica:
    2. Realize medições no ImageJ/FIJI. Primeiro, defina a escala usando o menu Analisar → Definir Escala. A Escala Set exige o uso de uma lâmina de calibração registrada em cada microscópio respectivo em cada objetivo. Primeiro, use a ferramenta de linha reta para criar uma linha de comprimento conhecido com base na imagem do slide de calibração. Atribua a escala globalmente.
      NOTA: A 10x, a escala é 3 px/μm. A 40x, a escala é 12 px/μm.
    3. Meça a espessura SubL usando as imagens 10x com a ferramenta linha reta. Meça a espessura como uma profundidade de prumo da superfície IntL até o fundo do SubL (μm). Após desenhar cada linha, use o atalho de teclado m para medir o comprimento da linha.
      1. Faça uma média mínima de 5 medições para cada imagem 10x (Figura 4A,B). A transição entre o tecido SubL e o estroma é demarcada por uma transição para áreas menos organizadas e menos celulares contendo colágeno e adiposo (Figura 4B). Bissecar o ponto de transição entre compartimentos tecidos.
    4. Para medições 40x da espessura IntL, celularidade IntL, integridade IntL e celularidade SubL, comece abrindo o TIFF 40x no Adobe Photoshop (ou qualquer editor de imagens similar). O IntL é definido como uma camada de ~1-5 células de espessura, organizada em uma camada celular distinta na interface entre o tecido e o espaço vazio (por exemplo, fluido sinovial) (Figura 4C).
    5. Crie uma nova camada. Selecione a ferramenta Laço Poligonal . Usando um clique do mouse para iniciar o laço, bem como as flexões de ancoragem na linha, divida a transição entre o IntL e o SubL ao longo de toda a imagem. Depois, continue o laço logo fora do IntL, no espaço vazio.
      1. Feche o laço com um duplo clique. Inverta a área selecionada (selecione → inverso), depois preencha o espaço com preto usando a ferramenta balde de tinta . Isso cobrirá todas as áreas que não são o IntL. Salve essa imagem como um JPG de alta resolução representando o IntL, depois oculte a camada.
    6. Crie uma nova camada. Em configurações de laço poligonal, selecione a característica de interseção , que só seleciona onde a área do novo laço e as áreas antigas do laço se cruzam. Laço ao redor da camada de sublining clicando pelo meio do IntL, pelas bordas esquerda e direita da imagem até a tela de fundo, e então divida a transição entre SubL e tecido acelular atrás dela.
      1. Se a parte inferior do SubL exceder as dimensões da imagem 40x, basta selecionar a tela de fundo ao redor da borda restante. Novamente, selecione o inverso dessa área como acima, depois use a ferramenta balde de tinta para preencher com preto. Salve esta imagem como um JPG de alta resolução representando o SubL. Salve esta imagem em camadas como PSD para referência futura.
        NOTA: Eritrócitos são comuns nesses slides e podem interferir nas futuras medições de contagem celular. Se houver grandes áreas de vasculatura, use a ferramenta de laço poligonal, a ferramenta de pincel ou outras ferramentas preferidas para criar máscaras em uma camada separada cobrindo essas áreas.
    7. No FIJI, abra a imagem da máscara  IntL. Meça a espessura IntL (μm) em média de pelo menos 5 medições sobre a imagem 40x usando a ferramenta linha reta, como nos passos 3.3.2-3.3.3.
    8. Meça o comprimento total (μm) do IntL usando a ferramenta de linha segmentada. Depois, meça apenas o comprimento das áreas intactas, também com a ferramenta de linha segmentada (Figura 4D,E). Seções IntL que não estão intactas são demarcadas por lacunas entre células, aparência devorada por traças e quebra ou descamação de IntL do tecido.
      1. Calcule a % de borda intL intacta em como (intL intacto/total IntL)*100. Isso deve ser comparado com os mesmos controles de pontos de tempo para compensar qualquer artefato de seccionamento.
    9. Meça a cellularidade do IntL usando a imagem da máscara IntL. Primeiro, transforme para 8 bits (Tipo → Imagem → 8 bits). Depois, limite (Imagem → Limiar) para minimizar o ruído e maximizar a identificação da célula. No menu de limiar, desmarque fundo escuro e use o botão inferior para ajustes.
      1. Determinar manualmente o limiar por imagem, auxiliado pelo desaparecimento do ruído (por exemplo, artefato de fundo) mantendo o número original de corpos nucleares. Compare frequentemente entre a imagem original para manter a fidelidade. Quando o ruído é minimizado (falso positivo), mas o sinal de hematoxilina é maximizado (verdadeiro positivo nuclear), é apropriado definir o limiar (Figura Suplementar 2).
        NOTA: O limite será consistente em uma única varredura de slides, mas variará entre as varreduras e também entre quaisquer imagens individuais de 10x ou 40x. Também varia entre os lotes de H&E, pois a profundidade da cor provavelmente não será consistente. Assim, macros simples são inadequados se houver diferenças em qualquer uma das seguintes categorias entre imagens: paciente, lote H&E, espessura da seção, condições de iluminação (brilho da luz do ambiente ou microscópio/temperatura de cor), software usado para adquirir a imagem, microscópio usado para adquirir a imagem e uso de algoritmos de balanço de branco ou balanceamento de cor. Esta lista não é exaustiva. Usando o microscópio AmScope T390B-3M com câmera e software compatíveis, com luz máxima no microscópio em uma sala pouco iluminada, utilizando ajustes automáticos de balanço de branco, 10 imagens aleatórias 40x abrangendo 3 pacientes, o limiar variou de 96 a 182, com uma média de 137. Essa ampla faixa reflete as diferenças nos histogramas subjacentes de 8 bits, não a inconsistência do usuário. Assim, garantir a fidelidade visual entre a imagem original e a imagem de limiar é essencial, não o número exato do limiar. Automar esse processo está fora do escopo típico de um cientista de laboratório e exigiria programação de um profissional de análise de imagens.
    10. Use Analisar Partículas (Analisar → analisar partículas) com tamanho celular de 8-150μm2 para identificar e contar núcleos como substituto do número celular. Selecione máscaras sobrepostas nas configurações para visualizar as células identificadas, novamente comparando com a imagem original. Como o IntL é principalmente uma estrutura linear, não volumétrica, normalize esses 100 μm de comprimento IntL (por exemplo, #cells/100 μm). Isso representou em média aproximadamente 13,19 células (intervalo 5,4-21,9, DS 3,9) células por 100 μm em tecido sinovial recém-recolhido.
      NOTA: A faixa de 8-150μm 2 foi determinada com base na Escala de Conjunto e na comparação visual iterativa da imagem com limiar com a imagem original. Os limites determinados empiricamente pelo conjunto de dados correspondem a suposições de forma baseadas em macrófagos com diâmetro celular que pode variar de aproximadamente 8-20μm 14,15. Tamanhos maiores foram excluídos, pois isso frequentemente representava múltiplos núcleos discretos em proximidade sendo lidos como uma única célula.
      NOTA: Fluxos de trabalho semelhantes podem ser estabelecidos, por exemplo, no QuPath.
    11. Abra a máscara SubL com os eritrócitos excluídos (Figura 4G). Realize transformação de 8 bits, limite e Analise Partículas conforme mencionado nos passos 3.3.9-10. Como o SubL é uma camada volumétrica, normalize o número de células contadas para 100μm 2 da área do SubL (por exemplo, medição de áreas não mascaradas) (Figura 4H).
  4. Para análise de citometria de fluxo de células migratórias no poço de fundo, centrifuge a 300 x g a 4 °C por 10 minutos e mantenha a pastilha celular no gelo. Espere ~20.000 células migratórias vivas por núcleo de biópsia de 3 mm em 24 horas. Métodos de citometria de fluxo já foram publicadosanteriormente 8.
  5. Para ELISA, centrifuge o meio à velocidade máxima (>5000 x g) por 5 minutos a 4 °C para pelletar quaisquer células ou detritos de células. Armazene na temperatura desejada. Métodos ELISA já foram publicadosanteriormente 8.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otimização das condições de cultura de oxigênio

A perfusão fisiológica dos tecidos é aproximadamente 6%-8% de oxigênio, enquanto as condições padrão de incubação para cultura celular estão nos níveis de oxigênio atmosférico (~21%)16. Comparativamente, a hiperoxigenação pode melhorar a viabilidade da cultura celular ou sertóxica 17. A utilização adequada do JSAS exigiu a determinação precoce da viabilidade do tecido sinovial; port...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse trabalho demonstrou capacidades do JSAS, especificamente a manutenção do tecido sinovial vivo com arquitetura sinovial intacta e funcionalmente responsiva. Houve morte celular mínima até 72 horas de cultivo na maioria das condições de incubação. Para avaliar as mudanças microscópicas da estrutura sinovial, foi descrito um sistema histológico único de medição, quantificando alterações estruturais do IntL e do SubL. Tais mudanças indicam uma sinovite aguda ou aguda ou crônica. Essa qu...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não há conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo não seria possível sem a generosidade dos pacientes que doaram seus tecidos e a habilidade de nossos colegas da cirurgia ortopédica, que estão dispostos a adquirir tecido com segurança em nome do trabalho. O K.I.C. conta com o apoio do NIAMS K08 AR084605, e o C.P.P. é apoiado pelo Programa de Desenvolvimento de Carreira de Assuntos de Veteranos [IK2BX004532]. Este grupo reconhece o uso da Instalação Central de Pesquisa em Microscopia da Universidade de Iowa, um recurso central apoiado pelo Vice-Presidente de Pesquisa da Universidade de Iowa, e pela Faculdade de Medicina Carver. Os dados da citometria de fluxo foram obtidos na Instalação de Citometria de Fluxo, que é uma instalação central de pesquisa do Carver College of Medicine / Centro Abrangente de Câncer Holden na Universidade de Iowa. A instalação é financiada por taxas de uso e pelo generoso apoio financeiro do Carver College of Medicine, do Holden Comprehensive Cancer Center e do Iowa City Veteran's Administration Medical Center. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada por: o Centro Nacional de Recursos de Pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número 1 S10 OD034193-01; e o Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número P30CA086862.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10 cm Petri dishesCorningCLS430167
23srRNA RNAscope probeACD/Biotechne468211
24 well platesLife Sciences3524
3 mm biopsy punchesIntegra12460406
50 mL conicalsN/A
70% ethanol (for sterilization)N/A
Borrelia burgdorferiATCC35210 must be utilized in the late exponential phase for maximum pathogenicity
BSK-HSigma-AldrichB8291
CD68 antibodyInvitrogen14-0688-821:1000
CO2 tank (standard conditions)N/A
Dulbecco's Phosphate buffered saline (Ca-/Mg-)Thermofisher14190144
fetal bovine serumBiotechneS11150Heat inactivated Lot: F22100
forceps (non-toothed)N/A
hemostatN/A
Humidified cell incubator (standard conditions)N/A
Hypoxia incubatorN/A
hypoxia tank (5% O2, 5% CO2, remainder N2, physiologic conditions)N/A
IL-4 antibodyThermofisherMA5-424701:100
iNOS antibodyThermofisherPA1-0361:100
Iris scissorsN/A
LipopolysaccharideSigma-AldrichL2630
low glucose DMEM (+Sodium pyruvate, +L-glutamine)Life Technologies11885084
MMP9 antibodyThermofisherMA5-327051:1000
Modular incubator chamber (hyperoxic conditions)Emrbient, IncMIC-101
Monocyte chemoattractant protein 1Peptrotech300-04-20UG
N-acetyl cysteineSigma-AldrichA9165Must be made fresh for each experiment and buffered in equimolar sodium bicarbonate to a pH of 7-7.4
OPG ELISAMilliporeRAB04841:1 dilution
Oxygen tank with liter per minute flow regulatorN/A
PDPN antibodyInvitrogen14-9381-821:100
Propidium IodideThermofisherJ66764.MC
RNAscope multiplex fluorescent V2 assayACD/Biotechne323100
sRANKL ELISAMyBioSourceMBS2626241:1 dilution
Staphylococcus aureus USA 300 MRSAATCCBAA-1717
SYBR GreenThermofisherS756310,000X stock
TNF antibodyThermofisherPA5-198101:100
transwell inserts - 0.4 um sizeMillicellPICM01250
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Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fallon, E. A., et al. Prevalence of diagnosed arthritis - United States, 2019-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 72 (41), 1101-1107 (2023).
  2. Allen, K. D., Thoma, L. M., Golightly, Y. M. Epidemiology of osteoarthritis. Osteoarthritis Cart. 30 (2), 184-195 (2022).
  3. Alivernini, S., Firestein, G. S., Mcinnes, I. B. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. Immunity. 55 (12), 2255-2270 (2022).
  4. Mathiessen, A., Conaghan, P. G. Synovitis in osteoarthritis: Current understanding with therapeutic implications. Arthritis Res Ther. 19 (1), 18(2017).
  5. Culemann, S., Grüneboom, A., Krönke, G. Origin and function of synovial macrophage subsets during inflammatory joint disease. Adv Immunol. 143, 75-98 (2019).
  6. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572 (7771), 670-675 (2019).
  7. Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nat Med. 26 (8), 1295-1306 (2020).
  8. Cyndari, K. I., Scorza, B. M., Zacharias, Z. R., Pessôa-Pereira, D., Strand, L. Resident synovial macrophages in synovial fluid: Implications for immunoregulation. Clin Immunol. 271, 110422(2024).
  9. Kooner, S. S., Clark, M. The effect of synovectomy in total knee arthroplasty for primary osteoarthritis: A meta-analysis. J Knee Surg. 30 (4), 289-296 (2017).
  10. Lipina, M., et al. Arthroscopic synovectomy of the knee joint for rheumatoid arthritis. Int Orthop. 43 (8), 1859-1863 (2019).
  11. Rosas, L., Mora, A. L., Rojas, M. Osu tristate sennet H&E staining of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue sections. protocols.io. , (2023).
  12. Biologicals, N. Immunofluorescent IHC staining of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue protocol. , https://www.novusbio.com/support-by-application/Fluorescent-IHC-Staining-of-FFPE-Tissue (2025).
  13. Rnascope multiplex fluorescent reagent kit v2 with sample preparation and pretreatment. , Advanced Cell Diagnostics Inc. https://acdbio.com/rnascope-multiplex-fluorescent-v2-assay (2022).
  14. Fakoya, A. O., Naeem, A., Pierre, L. Statpearls. 20235, Treasure Island (FL). Internet (2024).
  15. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. Am Rev Respir Dis. 126 (2), 332-337 (1982).
  16. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15 (6), 1239-1253 (2011).
  17. Pilarek, M., Grabowska, I., Ciemerych, M. A., Dąbkowska, K., Szewczyk, K. W. Morphology and growth of mammalian cells in a liquid/liquid culture system supported with oxygenated perfluorodecalin. Biotechnol Lett. 35 (9), 1387-1394 (2013).
  18. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Curr Issues Mol Biol. 42, 473-518 (2021).
  19. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  20. Arvikar, S. L., Steere, A. C. Lyme arthritis. Infect Dis Clin North Am. 36 (3), 563-577 (2022).
  21. RNAscope multiplex fluorescent reagent kit v2 user manual. , Advanced Cell Diagnostics Inc. Newark, CA. (2022).
  22. Feng, J., Wang, T., Zhang, S., Shi, W., Zhang, Y. An optimized SYBR Green i/pi assay for rapid viability assessment and antibiotic susceptibility testing for Borrelia burgdorferi. PLoS One. 9 (11), e111809(2014).
  23. De Buys, M., Moodley, K., Cakic, J. N., Pietrzak, J. R. T. Staphylococcus aureus colonization and periprosthetic joint infection in patients undergoing elective total joint arthroplasty: A narrative review. EFORT Open Rev. 8 (9), 680-689 (2023).
  24. Ross, J. J. Septic arthritis of native joints. Infect Dis Clin North Am. 31 (2), 203-218 (2017).
  25. Kwon, H. -K., Yu, K. E., Lee, F. Y. Construction and evaluation of a clinically relevant model of septic arthritis. Lab animal. 52, 11-26 (2022).
  26. Carrel, M., Perencevich, E. N., David, M. Z. USA300 methicillin-resistant Staphylococcus aureus, United States, 2000-2013. Emerg Infect Dis. 21 (11), 1973-1980 (2015).
  27. Parlet, C. P., Brown, M. M., Horswill, A. R. Commensal staphylococci influence Staphylococcus aureus skin colonization and disease. Trends Microbiol. 27 (6), 497-507 (2019).
  28. Bünter, J. P., et al. Wild-type AGR-negative livestock-associated MRSA exhibits high adhesive capacity to human and porcine cells. Res Microbiol. 168 (2), 130-138 (2017).
  29. Patel, H., Rawat, S. A genetic regulatory see-saw of biofilm and virulence in MRSA pathogenesis. Front Microbiol. 14, 1204428(2023).
  30. Soong, G., et al. Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus adaptation to human keratinocytes. mBio. 6 (2), e00289-e00315 (2015).
  31. Ni, F., Zhang, Y., Peng, X. Correlation between osteoarthritis and monocyte chemotactic protein-1 expression: A meta-analysis. J Orthop Res. 15, 516(2020).
  32. Tsai, P. H., Liou, L. B. Effective assessment of rheumatoid arthritis disease activity and outcomes using monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and disease activity score. Int J Mol Sci. 25 (21), 11374(2024).
  33. Boyce, B. F., Xing, L. Biology of rank, rankl, and osteoprotegerin. Arthritis Res Ther. 9 (Suppl 1), S1(2007).
  34. Asano, T., et al. Soluble RANKL is physiologically dispensable but accelerates tumour metastasis to bone. Nat Metab. 1 (9), 868-875 (2019).
  35. Kanzaki, H., et al. Soluble RANKL cleaved from activated lymphocytes by tnf-α-converting enzyme contributes to osteoclastogenesis in periodontitis. J Immunol. 197 (10), 3871-3883 (2016).
  36. Zahan, O. M., Serban, O., Gherman, C., Fodor, D. The evaluation of oxidative stress in osteoarthritis. Med Pharm Rep. 93 (1), 12-22 (2020).
  37. Ozcamdalli, M., et al. Comparison of intra-articular injection of hyaluronic acid and N-acetyl cysteine in the treatment of knee osteoarthritis: A pilot study. Cartilage. 8 (4), 384-390 (2017).
  38. Kim, H. R., Kim, K. W., Kim, B. M., Lee, K. A., Lee, S. H. N-acetyl-l-cysteine controls osteoclastogenesis through regulating Th17 differentiation and RANKL production in rheumatoid arthritis. Korean J Intern Med. 34 (1), 210-219 (2019).
  39. He, T., et al. Efficacy of n-acetylcysteine as an adjuvant therapy for rheumatoid arthritis: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Br J Hosp Med (Lond). 85 (11), 1-16 (2024).
  40. Tsikas, D., Mikuteit, M. N-acetyl-l-cysteine in human rheumatoid arthritis and its effects on nitric oxide (NO) and malondialdehyde (mda): Analytical and clinical considerations. Amino Acids. 54 (9), 1251-1260 (2022).
  41. Yeh, Y. T., Liang, C. C., Chang, C. L., Hsu, C. Y., Li, P. C. Increased risk of knee osteoarthritis in patients using oral N-acetylcysteine: A nationwide cohort study. BMC Musculoskelet Disord. 21 (1), 531(2020).
  42. Kaneko, Y., et al. Oral administration of N-acetyl cysteine prevents osteoarthritis development and progression in a rat model. Sci Rep. 9, 18741(2019).
  43. Coleman, M. C., et al. Sci Transl Med. 10 (427), eaan5372(2018).
  44. Drehmer, D., et al. Nitric oxide favours tumour-promoting inflammation through mitochondria-dependent and -independent actions on macrophages. Redox Biol. 54, 102350(2022).
  45. Fang, F. C., Vázquez-Torres, A. Reactive nitrogen species in host-bacterial interactions. Curr Opin Immunol. 60, 96-102 (2019).
  46. Winyard, P. G., et al. Measurement and meaning of markers of reactive species of oxygen, nitrogen and sulfur in healthy human subjects and patients with inflammatory joint disease. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1226-1232 (2011).
  47. Xue, M., et al. Endogenous MMP-9 and not MMP-2 promotes rheumatoid synovial fibroblast survival, inflammation and cartilage degradation. Rheumatology (Oxford). 53 (12), 2270-2279 (2014).
  48. Piacenza, L., Zeida, A., Trujillo, M., Radi, R. The superoxide radical switch in the biology of nitric oxide and peroxynitrite. Physiol Rev. 102 (4), 1881-1906 (2022).
  49. Dikalov, S. I., Mayorov, V. I., Panov, A. V. Physiological levels of nitric oxide diminish mitochondrial superoxide. Potential role of mitochondrial dinitrosyl iron complexes and nitrosothiols. Front Physiol. 8, 907(2017).
  50. Krenn, V., et al. Grading of chronic synovitis: A histopathological grading system for molecular and diagnostic pathology. Pathol Res Pract. 198 (5), 317-325 (2002).
  51. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Vet Pathol. 52 (5), 819-826 (2015).
  52. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. J Orthop Surg Res. 11, 19(2016).
  53. Felson, D. T., et al. Essential fatty acids and osteoarthritis. Arthritis Care Res (Hoboken). 76 (6), 796-801 (2024).
  54. Jarraya, M., et al. Prevalence of intra-articular mineralization on knee computed tomography: The multicenter osteoarthritis study. Osteoarthritis Cartilage. 31 (8), 1111-1120 (2023).
  55. Rai, M. F., Cai, L., Zhang, Q., Townsend, R. R., Brophy, R. H. Synovial fluid proteomics from serial aspirations of ACL-injured knees identifies candidate biomarkers. Am J Sports Med. 51 (7), 1733-1742 (2023).
  56. Rivellese, F., et al. Rituximab versus tocilizumab in rheumatoid arthritis: Synovial biopsy-based biomarker analysis of the phase 4 R4RA randomized trial. Nat Med. 28 (6), 1256-1268 (2022).
  57. Paggi, C. A., Teixeira, L. M., Le Gac, S., Karperien, M. Joint-on-chip platforms: Entering a new era of in vitro models for arthritis. Nat Rev Rheumatol. 18 (4), 217-231 (2022).
  58. Li, Z. A., et al. Synovial joint-on-a-chip for modeling arthritis: Progress, pitfalls, and potential. Trends Biotechnol. 41 (4), 511-527 (2023).
  59. Thompson, C. L., et al. Human vascularised synovium-on-a-chip: A mechanically stimulated, microfluidic model to investigate synovial inflammation and monocyte recruitment. Biomed Mater. 18 (6), acf976(2023).
  60. Thangadurai, M., Sethuraman, S., Subramanian, A. A 2d inflammatory co-culture model for investigating synovial fibroblast and macrophage interactions in rheumatoid arthritis. Sci Rep. 15 (1), 30105(2025).
  61. Rosso, F., Rossi, R., Cottino, U., Bonasia, D. E. Tibial tubercle osteotomy for patellofemoral malalignment and chondral disease provided good outcomes: A systematic review. J ISAKOS. 7 (2), 78-86 (2022).
  62. Kleuskens, M. W. A., Van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. An ex vivo human osteochondral culture model. J Orthop Res. 39 (4), 871-879 (2021).
  63. Schwab, A., et al. Ex vivo culture platform for assessment of cartilage repair treatment strategies. ALTEX. 34 (2), 267-277 (2017).

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