Este artigo descreve um estudo sobre a regulação da fibrose fibroblastica pulmonar pela Decocção Wenyang Dingchuan por meio da inibição da polarização dos macrófagos M2.
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Artigo de investigação
Este artigo descreve um estudo sobre a regulação da fibrose fibroblastica pulmonar pela Decocção Wenyang Dingchuan por meio da inibição da polarização dos macrófagos M2.
Estudar os efeitos do Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) na função dos fibroblastos, na remodelação das vias aéreas na asma e no mecanismo subjacente. A IL-4 foi usada para induzir a polarização M2 dos macrófagos RAW264.7, e os macrófagos polarizados foram então tratados com WYDCT para investigar seu efeito sobre fibroblastos pulmonares de camundongo. Células RAW264.7 polarizadas foram submetidas a diferentes tratamentos e depois co-cultivadas com fibroblastos. Foram avaliados os níveis de marcadores M1 e M2, a morfologia celular e a concentração de IL-6. O nível da proteína STAT3 foi analisado. Viabilidade, proliferação, formação de colônias, expressão de PCNA e expressão de fibronectina, COL1A1 e α-SMA foram analisadas usando vários ensaios, incluindo PCR em tempo real, Western blot, CCK-8, Edu, imunofluorescência e ensaios de formação de colônias. O WYDCT reverteu as mudanças morfológicas induzidas por IL-4 nas células RAW264.7, reduziu os níveis dos marcadores M2 (Arg-1, CD206) e IL-6, e diminuiu a expressão de STAT3 nas células RAW264.7, enquanto a suplementação com IL-6 restaurou o efeito do WYDCT nos marcadores M2. Além disso, a WYDCT inibiu a viabilidade e proliferação dos fibroblastos, reduziu a expressão do PCNA e diminuiu os marcadores de fibrose (fibronectina, COL1A1, α-SMA), sugerindo que a WYDCT inibe a viabilidade, proliferação e fibrose dos fibroblastos pulmonares ao suprimir a polarização do Macrófago M2, na qual a via de sinalização IL-6/STAT3 pode desempenhar um papel fundamental.
A asma, também conhecida como asma brônquica, é uma condição inflamatória persistente das viasrespiratórias. Frequentemente associada à exposição a alérgenos, temperaturas frias e irritantes de natureza física e química, essa condição é caracterizada pela infiltração de células inflamatórias, constrição reversível das vias aéreas, secreção de muco ebroncoespasmo 2. Atualmente, há pelo menos 300 milhões de pacientes com asma no mundo todo, e a prevalência está aumentando ano apósterceiro ano. Em 2015, 400.000 pessoas morreram de asma, tornando-se um grave problema globalde saúde 4,5. A China também enfrenta o mesmo problema, com estudos mostrando uma taxa de prevalência de asma de 4,2%, representando aproximadamente 45,7 milhões de pacientes adultos, com taxas de controle menores em comparação compaíses desenvolvidos de 6,7. O bem-estar das pessoas afetadas por essa doença é fortemente comprometido, causando uma carga financeira substancial para as famílias.
A remodelação das vias aéreas é considerada um fator crucial no tratamento da asma, que é difícilde controlar 8. Portanto, o tratamento da asma crônica persistente torna-se um ponto-chave. A prática clínica frequentemente envolve o uso de corticosteroides inalados em combinação com broncodilatadores, que podem aliviar efetivamente os sintomas nospacientes 9. No entanto, esses tratamentos têm certos efeitos colaterais e podem ser menos eficazes na melhoria dos sintomas de alguns pacientes. Além disso, a asma tende a reaparecer após a interrupção do medicamento. Pesquisas mostraram que a ativação dos fibroblastos pulmonares está relacionada à remodelação das vias aéreas durante a progressão daasma 10. Após a ativação, fibroblastos pulmonares passam por transformação fenotípica e secretam proteínas essenciais para impulsionar a deposição da matriz extracelular (ECM) — a característica patológica central da remodelação das vias aéreas. Especificamente, a fibronectina serve como um andaime inicial para a montagem de ECM, promovendo o recrutamento e adesão de outros componentes da matriz; COL1A1 (cadeia α1 de colágeno tipo I) é a principal proteína estrutural da ECM, e seu acúmulo excessivo leva ao espessamento e rigidez da parede das vias aéreas; α-SMA (α-actina muscular lisa) marca a transformação de fibroblastos em miofibroblastos com fortes capacidades contráteis e secretoras, acelerando ainda mais a deposição de ECM e a fibrose das vias aéreas.
A IL-6 é o fator de sinalização citoplasmática mais importante para a ativação da viaSTAT3 11. O aumento da IL-6 ativa a via STAT3. No tecido pulmonar de camundongos asmáticos, a expressão de STAT3 e mRNA e proteína fosforilados aumentam significativamente. A via de sinalização IL-6/STAT3 é um dos alvos para o tratamento da asma. Estudos confirmaram que a ativação da via de sinalização IL-6/STAT3 está associada à inflamação das vias aéreas na asma, e inibir essa via pode reduzir a inflamação das viasaéreas 12,13. IL-6/STAT3 também está associado à polarização M2 dos macrófagos. Estudos estrangeiros demonstraram que a expressão de IL-6 reduz significativamente a ativação do STAT3 a jusante, o que se correlaciona com a redução do número de superfícies tumorais, diminuição da proliferação e redução dos números de macrófagos M2 nofígado 14.
Células imunes conhecidas como macrófagos podem ser categorizadas em fenótipos distintos, a saber, ativação clássica (M1) e ativação alternativa (M2), cada uma cumprindo papéisúnicos 15. Macrófagos M1 podem induzir reações inflamatórias e danos teciduais, enquanto Macrófagos M2 promovem a proliferação celular e facilitam a cicatrização da ferida e a reparação tecidual. Pesquisas mostraram que a remodelação das vias aéreas na asma está associada aos macrófagosM2 16. Experimentos in vitro demonstraram que induzir a polarização M2 de macrófagos com IL-4 aumenta significativamente a capacidade de proliferação de células α-SMA-positivas17. Inibir a polarização dos macrófagos M2 é uma abordagem eficaz para tratar a remodelação das vias aéreas na asma.
A asma pertence à categoria de "Xiao Bing" na medicina tradicional chinesa. Os fatores patológicos de Xiao Bing envolvem principalmente catarro. A produção de catarro resulta de um desequilíbrio entre Yin e Yang nas vísceras, combinado com fatores externos como patógenos exógenos, dieta e condições pós-doença, que afetam o movimento dos fluidos corporais, levando à estagnação e ao acúmulo. Com a contínua exploração dos mecanismos da medicina tradicional chinesa no tratamento da asma, cada vez mais estudos mostraram que a medicina tradicional chinesa tem efeitos significativos no alívio da inflamação das vias aéreas, redução da secreção excessiva de muco e inibição da remodelação das viasaéreas 18,19. Em Xiao Bing, o pulmão é o principal afetado, seguido pelo baço e rins. Pacientes com Xiao Bing apresentam deficiência de qi pulmonar e defesa fraca contra patógenos externos, levando à perda da disseminação do qi pulmonar e a lesões repetidas e prolongadas do yang qi, resultando em deficiência pulmonar de yang. A deficiência de yang leva à circulação anormal dos fluidos corporais, que se condensam em catarro. Em ataques de longo prazo, o catarro frio afeta o yang do baço e dos rins, resultando em um padrão de deficiência de yang pulmão-baço-rim, desequilíbrio de yin e yang, preponderância excessiva ou deficiência da constituição e circulação anormal dos fluidos corporais. O pulmão não consegue dispersar fluidos, o baço não consegue transformar água e essência, e os rins não conseguem vaporizar e transformar fluidos, levando à condensação de catarro e à formação de estase, que se manifesta como asma. Portanto, a deficiência de yang é a causa raiz do Xiao Bing, e a estase do catarro é sua característica. Wen Yang Ding Chuan Tang é composto por 12 ervas medicinais chinesas, incluindo Epimedium (15 g), Ephedra (processada) (10 g), Ginseng (15 g), Astrágalo (15 g), Ginkgo biloba (15 g), Flos Farfarae (15 g), Amargo de Amargo (15 g), Pinellia ternata (processada) (10 g), Schisandra chinensis (10 g), Minhoca (10 g), Persica (10 g) e Alcaçuz (processada) (10 g). Essa fórmula herbal é derivada da formulação modificada do Ding Chuan Tang no livro "She Sheng Zhong Miao Fang" e tem os efeitos de aquecer o yang, reforçar o qi, resolver o catarro, promover a circulação sanguínea e aliviar tosse e asma. A eficácia clínica desse tratamento foi estabelecida, o que motivou investigações experimentais atuais sobre seu mecanismo para tratar a remodelação das vias aéreas na asma.
Comparado às terapias farmacológicas atuais para asma, como corticosteroides inalados, agonistas β2 e biológicos baseados em anticorpos monoclonais direcionados a IgE ou IL-5, o Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) oferece uma estratégia terapêutica potencialmente multi-alvo e mais segura. Os corticosteroides convencionais aliviam efetivamente a inflamação das vias aéreas, mas frequentemente estão associados a efeitos colaterais como imunossupressão, desequilíbrio hormonal e recaída na abstinência. Agentes biológicos, embora mais específicos, são caros e limitados a fenótipos específicos da asma. Em contraste, a WYDCT, derivada da teoria da medicina tradicional chinesa de "aquecimento do yang e resolução do catarro", exerce efeitos abrangentes na regulação do equilíbrio imunológico, redução da inflamação das vias aéreas e suprimição da remodelação das vias aéreas, como demonstrado em estudos clínicos eexperimentais 20. Sua composição multicomponente pode modular simultaneamente a polarização dos macrófagos, ativação de fibroblastos e liberação de citocinas, proporcionando uma melhoria mais ampla e potencialmente mais sustentável na patologia da asma.
Neste estudo, o extrato aquático de Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) foi preparado a partir de doze ervas em uma proporção tradicional fixa, concentrado em uma solução final de estoque de 1 g/mL (equivalente a medicamento bruto) e filtrado para uso em cultura celular. O extrato foi aplicado em concentrações de 50, 100 e 200 μg/mL, que foram selecionadas com base em ensaios preliminares de viabilidade celular para garantir a não citotoxicidade mantendo a atividade farmacológica. O modelo in vitro envolveu polarização M2 induzida por IL-4 dos macrófagos RAW264.7 e co-cultura com fibroblastos pulmonares de camundongos (células L929), permitindo avaliar os efeitos paracrinos dos macrófagos na ativação dos fibroblastos e nas respostas relacionadas à fibrose. Esses detalhes fornecem uma estrutura reprodutível para estudos futuros que investiguem as características dose-resposta e as vias mecanicistas da WJDCT na remodelação das vias aéreas.
Com base nos achados acima, especulamos que o Wen Yang Ding Chuan Tang exerce seus efeitos anti-remodelação das vias aéreas na asma ao inibir a polarização M2 dos macrófagos e suprimir a ativação dos fibroblastos.
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Este estudo foi conduzido seguindo diretrizes internacionais, nacionais e institucionais para tratamento humano de animais e em conformidade com a legislação relevante. Especificamente, todos os procedimentos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Comitê de Cuidado Ético Animal do Terceiro Hospital Afiliado do Qiqihar Medical College (AECC-2022-009). Os camundongos eram alojados em condições laboratoriais padrão, com acesso a comida e água de forma espontânea, e todos os esforços eram feitos para minimizar o sofrimento. Critérios de desfecho humanitários foram estabelecidos e monitorados ao longo do estudo.
1. Preparação do extrato WYDCT
As 12 ervas de Wen Yang Ding Chuan Tang foram pesadas segundo a proporção tradicional: Epimedium (15 g), Efedra processada (10 g), Ginseng (15 g), Astrágalo (15 g), Ginkgo biloba (15 g), Flos Farfarae (15 g), Grão de Damasco Amargo (15 g), Pinellia ternata processada (10 g), Schisandra chinensis (10 g), Minhoca (10 g), Persica (10 g), e alcaçuz processado (10 g).
Dez vezes o volume de água destilada foi adicionado, e a mistura foi fervida por 30 minutos. A extração foi repetida duas vezes, e os filtrados foram combinados. O extrato combinado foi concentrado sob pressão reduzida até uma concentração equivalente a um medicamento bruto de 1 g/mL. O extrato foi filtrado através de uma membrana de 0,22 μm, aliquotado e armazenado a −20 °C. As concentrações de trabalho (50, 100 e 200 μg/mL) foram preparadas por diluição imediatamente antes do uso.
2. Cultura celular e polarização M2
Células RAW264,7 (ATCC, EUA) foram descongeladas e semeadas com uma densidade de 1 × 10⁶ células por recipiente de 10 cm em 10 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. As células foram incubadas a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂ por 24 horas até que a confluência de 80%-90% fosse atingida.
O meio de cultivo foi então substituído por DMEM fresco contendo 20 ng/mL de IL-4, e as células foram incubadas por mais 24 horas para induzir a polarização M2. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS e posteriormente tratadas com extrato de WYDCT (solução de estoque de 10 mg/mL diluída às concentrações finais indicadas) por 24 horas. Para experimentos de suplementação com IL-6, 50 ng/mL de IL-6 foram adicionados durante o tratamento com WYDCT.
Células tratadas com DMSO de 0,1% serviram como controle negativo. A morfologia celular foi examinada sob um microscópio invertido, e imagens representativas foram capturadas.
3. Isolamento e cultura de fibroblastos pulmonares de camundongos
Os ratos eram eutanasiados de acordo com protocolos éticos aprovados. Lóbulos pulmonares foram coletados e colocados na solução salina equilibrada de Hanks fria. Vasos sanguíneos e tecido conjuntivo visíveis foram removidos, e o tecido pulmonar foi reduzido em pequenos pedaços (~1 mm3).
Os fragmentos de tecido foram digeridos em tripsina 0,25% por 40 minutos a 37 °C com agitação suave, seguidos por uma segunda digestão em tripsina 0,25% por 30 minutos. A suspensão celular foi centrifugada a 300 × g por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspenso em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal.
A suspensão foi incubada por 100 minutos para permitir a aderência dos fibroblastos, após o que as células foram centrifugadas novamente a 300 × g por 5 minutos para melhorar a purificação. Fibroblastos purificados foram semeados em placas de cultura apropriadas e incubados a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂ até atingir aproximadamente 80% de confluência.
4. Co-cultura de fibroblastos com meio condicionado
O sobrenadante foi coletado de células RAW264,7 tratadas e centrifugado a 3000 × g por 10 minutos a 4 °C. O meio de cultura de fibroblastos foi substituído pelo meio coletado condicionado por macrófagos. Fibroblastos foram incubados por 24 horas a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂ antes dos ensaios funcionais. Após a incubação, fibroblastos foram colhidos para extração de RNA e proteínas para análises subsequentes qRT-PCR e Western blot.
5. Viabilidade da célula (ensaio CCK-8)
Fibroblastos foram semeados com uma densidade de 5 × 10³ células por poço em placas de 96 poços contendo 100 μL de meio de cultura. As células foram submetidas aos tratamentos indicados por 24 horas. Posteriormente, 10 μL do reagente CCK-8 foram adicionados a cada poço, e as placas foram incubadas por 2 horas a 37 °C. A densidade óptica (OD) foi medida em 450 nm usando um leitor de microplaca. A viabilidade celular foi calculada como (OD_treated / OD_control) × 100%. Todos os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas.
6. Ensaio de formação de colônias
As células foram semeadas com uma densidade de 1 × 10³ por poço em placas de 6 poços, com três poços replicados por condição. As placas foram incubadas por 10 a 14 dias até que colônias visíveis se formassem. As colônias foram tingidas com 0,1% de violeta cristalino por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a coloração, as colônias foram lavadas e fotografadas. O corante ligado foi dissolvido em ácido acético a 30% por 15 minutos, e a densidade óptica foi medida em 590 nm. Três experimentos independentes foram realizados.
7. Ensaio de proliferação de EdU
As células foram tratadas conforme indicado por 24 horas. Posteriormente, 100 μL de 50 μM EdU foram adicionados a cada poço, e as células foram incubadas por 2 horas a 37 °C. As células foram fixadas em paraformaldeído a 4% por 30 minutos e temperadas com 2 mg/mL de glicina por 5 minutos. As células foram permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 em PBS, lavadas e incubadas com solução de coloração Apollo por 30 minutos. Núcleos foram contra-coloridos com Hoechst 33342 (1×) por 30 minutos. Células EdU positivas foram observadas e analisadas usando um microscópio de fluorescência.
8. ELISA para IL-6
O sobrenadante da célula RAW264.7 foi centrifugado a 3000 × g por 15 minutos a 4 °C. Os níveis de IL-6 foram medidos usando um kit Beyotime ELISA conforme as instruções do fabricante. A absorvância foi medida usando um leitor de microplaca, e as concentrações de IL-6 foram calculadas com base em uma curva padrão.
9. Imunofluorescência
Fibroblastos foram fixados em acetona pré-resfriada por 10 minutos e lavados três vezes com PBS. As células foram permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 por 10 minutos e bloqueadas com 1% de BSA em PBS por 30 minutos. As células foram então incubadas com um anticorpo primário contra PCNA (1:100) durante a noite a 4 °C. Após lavagem três vezes com PBS, as células foram incubadas com um anticorpo secundário conjugado com FITC (1:200) por 1 hora em temperatura ambiente. Os núcleos foram contra-coloridos com DAPI, lavados e imagados usando um microscópio de fluorescência.
10. qRT-PCR
O RNA total foi extraído usando reagente Trizol (Beyotime, China) de acordo com o protocolo do fabricante. A transcrição reversa foi realizada com o Kit de Síntese de cDNA usando 2 μg de RNA e primers aleatórios. As reações PCR foram preparadas em um volume de 20 μL contendo 10 μL de SYBR Green Master Mix, 0,5 μL de cada primer específico de gene (concentração final 0,5 μM) e 1 μL de molde de cDNA. Os primers utilizados incluíam CD16, iNOS, Arg-1, CD206, fibronectina, COL1A1, α-SMA e GAPDH (sequências fornecidas).
As condições de ciclo térmico consistiram em uma desnaturalização inicial a 95 °C por 5 minutos, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 30 s, 60 °C por 30 s e 72 °C por 30 s. A análise da curva de fusão foi realizada de 60 °C a 95 °C em incrementos de 0,5 °C para verificar a especificidade da amplificação.
Análise de Dados: A expressão relativa foi calculada usando o método 2^−ΔΔCT e normalizada para GAPDH. Os espoletadores eram os seguintes: CD16 (mouse): 5′- AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG-3′ e 5′- TGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG-3′, iNOS (mouse): 5′-TGCTCCCCAGGAGATGTTGT-3′ e 5′-TGGTCTGGTAGGCTGTAGGG-3′, Arg-1 (mouse): 5′- GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGG-3′ e 5′- GGTGGCTTTGCTGTGTGTC-3′-3′ ��, CD206 (rato): 5′- GGCTTCTATGAGCTGGGTGA-3′ e 5′- CTGGGCTTCTGTGTGTTGTTGTT-3′, fibronectina (rato): 5'-CGTGTGAAGGTGTTTCTGC-3' e 5'-GAGGTCACAGTGTCTTGCT-3', COL1A1 (camundongo): 5'-CCCTGGACACCTGGCTTTTT-3' e 5'-GCGGGTCCCCTTCTCTCTC-3', α-SMA (camundongo): 5'-CTGGAACAGCACAGCTTCTC-3' e 5'-GGGACATAGCAGCTTCTC-3', GAPDH (rato): 5′- TGTGTCCGTCGTGGATCTGA -3′ e 5′- CCTGCTTCACCCCTTTGAT-3′.
11. Western blot
As células foram lisadas usando inibidores de protease contendo tampão RIPA. As concentrações de proteína foram determinadas por meio de um ensaio de BCA. Para o SDS-PAGE, 60 μg de proteína foram carregados em cada faixa de um gel de poliacrilamida a 10% e separados a 120 V por 1,5 a 2 horas. As proteínas foram transferidas para uma membrana PVDF usando um método de transferência úmida a 100 V por 1 hora. Após o bloqueio com leite desnatado 5% em TBS-T por 1 hora em temperatura ambiente, a membrana foi incubada com anticorpos primários (diluição 1:1000) durante a noite a 4 °C. Após lavagens com TBS-T, a membrana foi incubada com anticorpos secundários conjugados com HRP (diluição 1:5000) por 1 hora em temperatura ambiente. Após lavagens adicionais, as bandas proteicas foram detectadas usando um reagente quimioluminescência ECL e analisadas com um sistema de imagem quimioluminescência. As intensidades das bandas foram quantificadas usando o software ImageJ, e os níveis de proteína foram normalizados para GAPDH como controle interno.
12. Análise estatística
Os dados foram analisados usando o SPSS 17.0. As variáveis contínuas foram expressas como média ± desvio padrão (DS). Comparações entre dois grupos foram realizadas usando um teste t não pareado, enquanto comparações entre múltiplos grupos foram realizadas usando ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc LSD. Um valor p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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Os efeitos da WYDCT na polarização M2 das células RAW264.7 de macrófagos
Observamos a morfologia celular do RAW264.7 usando um microscópio óptico. Como mostrado na Figura 1A, a estimulação da IL-4 fez as células se alongarem, resultando em uma forma mais alongada e semelhante a um fuso em comparação com as células não tratadas. Além disso, as células estimuladas por IL-4 apresentaram granularidade citoplasmática aumentada e adesão aumentada ao sub...
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O objetivo deste estudo foi explorar o impacto da WYDCT na atividade dos fibroblastos e na remodelação das vias aéreas na asma, bem como os mecanismos subjacentes. Os achados atuais demonstram que a WYDCT pode inibir a polarização M2 dos macrófagos RAW264.7, o que posteriormente afeta a viabilidade, proliferação e fibrose dos fibroblastos pulmonares de camundongo. Além disso, a via de sinalização IL-6/STAT3 desempenhou um papel fundamental na mediação desses efeitos.
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Agradecemos sinceramente a todos os parceiros que contribuíram para este projeto de pesquisa. Esse trabalho foi apoiado pelas Despesas Operacionais de Pesquisa Científica Básica da Universidade na Província de Heilongjiang em 2022 (nº 2022-KYYWF-0827), pelo qual somos gratos.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente de Hibridização Apollo 643 | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | C10371-2 | |
| Arginase-1 (E4U1I) mouse mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 43933T | |
| Kit de determinação de concentração de proteínas BCA | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | P0012 | |
| BeyoBlot HRP Combinado com Rato Anti-Coelho Nativo IgG (H+L) | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | A0210 | |
| Incubadora de dióxido de carbono | Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd. | HF240 | |
| CD206/MRC1 (E6T5J) XP® Corpo de coelho | Cell Signaling Technology, Inc. | 24595T | |
| Kit de Contagem de Células-8 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0037 | |
| COL1A1 (E8F4L) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 72026T | |
| Dimetil Sulfóxido | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | ST038-100ml | |
| DMEM médio com alto teor de açúcar | Companhia Biológica de Grand Island | 11965092 | |
| EDU | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | ST067-250mg | |
| Fcγ RIII/CD16 (F6K6G) Coelho mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 71345T | |
| Soro fetal para panturril | Companhia Biológica de Grand Island | A5256701 | |
| Fibronectina/Anticorpo FN1 & nbsp; | Cell Signaling Technology, Inc | 63779S | |
| FITC-IgG Anti-Camundongo Conjugado (H+L) | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | A0568 | |
| Instrumento de PCR quantitativa de fluorescência | Yarui Biotechnology Co., Ltd. | MA-6000 | |
| Hoechst 33342 Solução de Coloração de Células Vivas (100X) | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C1029 | |
| iNOS (E1W4J) Coelho mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 70706SF | |
| Microscópio invertido | Guangzhou Mingmei Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MI52-N | |
| LRRK2 T1348N mut RAW 264.7 | ATCC | SC-6005 | |
| Tamponador de Permeabilização por Mmunotinação (com Triton X-100) | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | P0096-100ml | |
| Mouse IL-6 ELISA Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | PI326 | |
| Células de Fibroblastos do Pulmão do Camundongo | Wuhan Procell Life Technology Co., Ltd. | CP-M006 | |
| PCNA (PC10) Mouse mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 2586T | |
| Penicilina-estreptomicina | Companhia Biológica de Grand Island | 15140148 | |
| Murina recombinante IL-4 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | P5916-5 & mu; g | |
| Murine recombinante IL-6 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | P5925-10 e mu; g | |
| Instrumento de marcador enzimático Redu | Ciências da Vida Rayto | RT-6100 | |
| Stat3 (124H6) MAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 9139T | |
| supino superclean | Jinan BioBase Biotech Co., Ltd. | BBS-SDC | |
| SynGAP-& alpha; 2 (E4Y6I) Coelho mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 56927T | |
| Thermo Fisher Scientific RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher | 89901 | |
| Trizol (reagente de extração de RNA total) | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | R0016 | |
| Anticorpo β-Actin | Cell Signaling Technology, Inc. | 4967S |
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