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Artigo de método

Gavage Oral em Filhotes de Camundongos Neonatais e Avaliação Funcional da Integridade da Barreira Intestinal Usando Câmaras de Uso

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DOI:

10.3791/69751

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9 de janeiro de 2026

 ,  ,  , 
1INSERM U1149, Center of Research on Inflammation, Université Paris Cité, 2CHRU Nancy, IHU Infiny

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve: (1) entrega oral por gavage de moléculas de teste para camundongos neonatais já no DOL 6; e (2) avaliação ex vivo da função da barreira epitelial do cólon em biópsias desde filhotes DOL 10 até desmame (DOL 20), avaliando a permeabilidade paracelular e transcelular com câmaras de Ussing.

Resumo

Evidências crescentes ressaltam a importância dos primeiros 1.000 dias de vida na formação do eixo intestino-microbioma. Essa janela de vida inicial é fundamental para o estabelecimento de trajetórias fisiológicas de longo prazo e adaptações imunológicas, potencialmente influenciando a suscetibilidade a doenças ligadas à disbiose e à disfunção da barreira. Uma compreensão mais profunda dos mecanismos subjacentes exige uma avaliação abrangente dos principais parâmetros fisiológicos, incluindo a permeabilidade paracelular e transcelular do intestino neonatal. Avaliar esses parâmetros é essencial para elucidar como exposições precoces a moléculas exógenas podem influenciar a integridade intestinal e os resultados de saúde a longo prazo. Portanto, a primeira parte deste artigo descreve a administração oral de moléculas de interesse em filhotes de camundongos já no dia da vida, minimizando o estresse, o risco de lesão e o canibalismo. Agulhas de alimentação lubrificadas e de ponta arredondada de 24 g são usadas para gavage filhotes de camundongos com no mínimo 2,5 g. A segunda parte descreve a avaliação ex vivo da permeabilidade paracelular e transcelular usando ensaios em câmara de Ussing em amostras de cólon de filhotes entre DOL-10 e desmame. Deslizadores sem pinos adaptados para pequenas biópsias são usados em combinação com câmaras de Ussing para montar amostras de cólon neonatal. A sonda paracelular FITC-Dextran 4 kDa e o marcador transcelular peroxidase de raiz-forte 44 kDa Tipo VI são adicionados ao compartimento apical do sistema no início do ensaio. Amostras são coletadas no compartimento basolateral em 0 min, 30 min, 60 min, 90 min e 120 min para quantificar a passagem da sonda. A passagem de ambos os marcadores é quantificada diretamente (FITC) e indiretamente (HRP) por um leitor de placas, calculada usando curvas padrão e expressa como fluxo.

Introdução

A integridade da barreira intestinal desempenha um papel fundamental na manutenção da saúde geral, coordenando a resposta imune mucosa e regulando a permeabilidade seletiva do epitélio intestinal. Esse sistema de barreira controla a passagem de nutrientes enquanto impede a translocação de patógenos, antígenos e toxinas para a circulaçãosistêmica 1. A ruptura crônica dessa interface, associada ao aumento da permeabilidade intestinal, comumente chamada de "intestino permeável", é agora identificada não apenas como consequência, mas também como um fator que impulsiona estados inflamatórios crônicos e uma série de patologiasextra-intestinais 2.

Por exemplo, a função comprometida da barreira intestinal tem sido demonstrada como um componente chave de distúrbios autoimunes e metabólicos, como doença inflamatória intestinal (DII), artrite idiopática juvenil (AII) e diabetes tipo 1 (DT1). Isso destaca o estado da barreira intestinal como um biomarcador-chave, mas também como um alvo terapêutico para prevenir o início dos processos fisiopatológicos o mais cedo possível e para prevenir a progressão da inflamação aguda para um estadocrônico 3,4,5,6.

Nesse contexto, o período neonatal representa uma janela única e altamente sensível de desenvolvimento, durante a qual o estabelecimento e a maturação da interface intestino-microbiota influenciam profundamente a saúde intestinal e sistêmica ao longo davida 7. Neste estágio inicial, o epitélio intestinal e o sistema imunológico apresentam sensibilidade aumentada tanto a fatores endógenos quanto exógenos, passando por crescimento e diferenciação rápidos enquanto se adaptam simultaneamente à colonização microbiana e mudanças na dieta. Perturbações que prejudicam a integridade da barreira intestinal durante essa janela crítica de desenvolvimento podem desempenhar um papel fundamental no surgimento de um amplo espectro de distúrbios agudos e crônicos mais tarde na vida. Essas condições incluem doenças imunomediadas como alergia alimentar, e doenças crônicas mais graves, como DII, AIJ e DT1 7,8,9. Essas doenças ressaltam como os processos fisiopatológicos frequentemente se originam precocemente, já que o início primário geralmente ocorre entre a infância e o início da vidaadulta 10,11. Portanto, compreender os mecanismos que regem a função da barreira intestinal em neonatos é essencial para desenvolver estratégias preventivas e terapêuticas voltadas para reduzir a carga de muitas doenças crônicas.

Nesse contexto, há uma necessidade urgente de ferramentas confiáveis e fisiologicamente relevantes para estudar a integridade da barreira intestinal, mecanismos de doenças crônicas e inflamação, especificamente no ambiente neonatal. Tais ferramentas devem permitir a replicação de ensaios experimentais já comprovados no contexto adulto sem sacrificar precisão e eficácia. Além disso, está se tornando cada vez mais urgente investigar tanto os efeitos de curto quanto de longo prazo de muitos candidatos moleculares de interesse, que se espera que tenham efeitos benéficos ou prejudiciais na homeostase intestinal no contexto neonatal. Entre as ferramentas disponíveis, a administração oral de gavage em filhotes de camundongos neonatos representa um método mais do que confiável para administrar moléculas de interesse em um estágio definido do desenvolvimento. Ele permite investigações controladas sobre os efeitos de diversos compostos bioativos, medicamentos ou metabólitos microbianos na maturação intestinal e na função da barreira.

A primeira parte deste artigo descreve um método para a captura de filhotes de camundongos já no Dia da Vida (DOL) 6, permitindo o estudo de intervenções antes, durante e após a enorme expansão do número de espécies da microbiota intestinal induzida pela diversificação alimentar. Assim, essa técnica possibilita análises longitudinais dos efeitos do tratamento na saúde intestinal à medida que os filhotes crescem e se desenvolvem.

Na segunda parte deste artigo, complementando essa abordagem, a avaliação ex vivo da função da barreira epitelial do cólon usando câmaras de Ussing fornece uma medida sensível e quantitativa das características de permeabilidade. A avaliação da permeabilidade paracelular e transcelular em biópsias de cólon de camundongos neonatais (por exemplo, filhotes do DOL 10) permite a determinação precisa do impacto de vários candidatos-chave na integridade e função da barreira epitelial. O transporte paracelular é um mecanismo essencialmente passivo que ocorre através do espaço intercelular da camada epitelial. Ele permite a passagem de pequenos solutos impulsionados por gradientes eletroquímicos e osmóticos do lúmen para o lado basolateral. Esse mecanismo é regulado principalmente por proteínas da família das junções apertadas, como claudinas e ocludin. O transporte transcelular, em contraste, é um mecanismo ativo, permitindo a absorção de solutos maiores e ocorrendo através das células epiteliais por meio de canais específicos, transportadores e bombas.

O fluoresceína isotiocianato (FITC)-dextrano (4 kDa) sofre predominantemente transporte paracelular devido ao seu tamanho, enquanto a peroxidase de raiz-forte (HRP; 44 kDa) é seletivamente conduzida para o lado basolateral por vias transcelulares. A quantificação desses marcadores não endógenos permite, portanto, uma avaliação distinta da permeabilidade paracelular e transcelular, respectivamente. O ensaio em câmara de Ussing com FITC e HRP preserva a arquitetura do tecido e permite a medição em tempo real da permeabilidade paracelular e transcelular de qualquer segmento do trato intestinal. Essa combinação de gavage neonatal e análise da câmara de Ussing oferece uma estratégia poderosa para estudar como moléculas específicas impactam a função da barreira intestinal tanto de forma imediata quanto por períodos mais longos, informando estratégias para mitigar a inflamação e prevenir doenças crônicas desde os estágios mais iniciais da vida.

Em resumo, este protocolo descreve dois procedimentos experimentais complementares que permitem: (1) administração de moléculas de interesse no período neonatal inicial a filhotes de camundongos (passo 1); (2) avaliação da permeabilidade tanto para quanto transcelular em segmentos do trato intestinal, desde filhotes neonatais até desmamando, utilizando câmaras de Ussing (etapas 2-6).

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as regulamentações nacionais aplicáveis e aprovados pelo Ministério do Ensino Superior, Pesquisa e Inovação da França via a plataforma APAFIS (Número de autorização: APAFIS#23855) e subsídios da Agence Nationale pour la Recherche (ANR): 11-IDEX-0005-02, ANR-24-CE15-7152 e 18-IDEX-0001. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Gavage de filhotes de camundongos neonatais

NOTA: O método a seguir é adaptado de Francis et al.12. Embora o protocolo original permitisse o gavage de filhotes de camundongos já no DOL 2, o gavage não era realizado antes do DOL 6 aqui, pois as exigências técnicas em idades mais precoces tornam o procedimento consideravelmente mais desafiador. Além disso, o uso de filhotes mais jovens complica os estudos, pois aumenta o risco de perda de animais nos primeiros dias de tratamento, exigindo assim coortes maiores.

  1. Preparação e configuração de soluções Gavage
    1. Pese cada filhote individualmente.
    2. Ajuste a concentração e o volume da solução gavage para que o volume total administrado não exceda 20 μL por grama de peso corporal.
      NOTA: Em condições padrão, filhotes de camundongos raramente pesam menos de 2,5 g no DOL 6.
    3. Lave uma agulha de alimentação de ponta redonda de 24 G, lavando-a cuidadosamente com água deionizada, seguida de 70% de etanol com uma seringa, e depois autoclave.
      NOTA: Recomenda-se usar uma agulha de alimentação separada para cada grupo de tratamento para evitar contaminação cruzada.
    4. Coloque papel toalha limpo em uma bolsa térmica desinfetada ajustada a ~38 °C.
    5. Lave as luvas com etanol 70% antes de abrir as gaiolas para limitar a transferência de odor para os filhotes e reduzir o risco de canibalização.
    6. Transfira a mãe para uma gaiola separada em outro cômodo para limitar o estresse causado pelas possíveis vocalizações dos filhotes.
    7. Esfregue as luvas limpas com materiais de ninho para limitar o risco de transferência de odores externos para os filhotes durante o combate.
    8. Meça o comprimento entre o processo xifoide (extremidade inferior do esterno) e o focinho do filhote para marcar o comprimento máximo de inserção na agulha de alimentação (Figura 1A,B).
  2. Gavage intraesofágico de filhotes de camundongos
    1. Prenda a cabeça da agulha a uma seringa de forma estéril e retire mais do que o volume desejado de solução gavage para administrar todo o volume necessário sem risco de administrar bolhas de ar, pois elas aumentam dramaticamente o risco de aspiração.
    2. Usando o polegar e o indicador da mão não dominante, belisque suavemente a pele entre as escápulas para levantar o filhote.
      NOTA: Não retire muita pele das costas do filhote, pois isso pode induzir sufocamento.
    3. Segure o filhote em posição quase horizontal e insira suavemente a agulha de alimentação na cavidade oral, avançando-a perpendicularmente à faringe até alcançar a parte de trás da garganta (Figura 1C).
    4. Mantendo o mesmo ângulo e profundidade, deslize a agulha para a parte direita ou esquerda da cavidade bucal para evitar a língua.
    5. Ajuste lentamente o ângulo da agulha enquanto inclina suavemente a cabeça do filhote para trás, até que a seringa, a cabeça e as costas fiquem alinhadas, com a cabeça levemente inclinada para trás (Figura 1D).
    6. Sem aplicar pressão, permita que a seringa desça lentamente sob seu próprio peso até que a marca máxima de inserção esteja próxima ou atinja o nível do focinho (Figura 1E).
      NOTA: Se houver resistência, gire suavemente a seringa rolando-a para frente e para trás entre os dedos para facilitar a descida. Se a seringa ainda não avançar, tente ajustar o ângulo de inserção ou reiniciar o procedimento usando uma agulha lubrificada com a solução gavage. A agulha não deve permanecer inserida por mais de 20 segundos para evitar asfixia.
    7. Assim que o ponto máximo de inserção for atingido ou fechado, dispense rapidamente o volume desejado. Se houver resistência durante a dispensação do volume, verifique o alinhamento da seringa-cabeça-recuo e ajuste levemente a profundidade de inserção.
      NOTA: Recomenda-se a dispensação rápida do volume, pois a inserção prolongada da agulha aumenta significativamente o risco de sufocamento, dificuldades e possíveis lesões ao animal.
    8. Após o volume correto ser administrado, retire suavemente a agulha ao longo do mesmo ângulo usado para a inserção.
    9. Coloque o filhote sobre o papel toalha que já foi colocado na bolsa térmica e monitore a recuperação. Um padrão respiratório normal deve voltar em menos de 20 segundos.
      NOTA: A aparição de bolhas pelo focinho ou boca do animal indica aspiração e requer eutanásia imediata em filhotes mais jovens que o DOL 14. A presença de uma quantidade muito pequena de sangue na boca do animal, causada por uma lesão entre a orofaringe e o esôfago, requer monitoramento do animal, mas não eutanásia sistemática. Se a recuperação do filhote estiver incerta, coloque-o de lado. Se não tentar se corrigir, eutanásia imediatamente.
    10. Uma vez confirmada a recuperação do animal, coloque o filhote de volta no ninho e reagrupe-o com sua mãe.
      NOTA: Até o DOL 10, filhotes têm baixa mobilidade e podem permanecer na almofada térmica até que todos os filhotes da gaiola sejam concluídos. Filhotes mais velhos não devem ficar sozinhos no tapete, pois podem tentar escapar.

Figura 1
Figura 1: Gavage de filhote de camundongo recém-nascido no DOL 10. A distância entre o focinho e o processo xifoide é medida (A), permitindo marcar o comprimento máximo de inserção na agulha de alimentação (B). A agulha de alimentação é inserida na parte esquerda ou direita da cavidade oral (C). Uma vez alcançada a parte de trás da garganta, o ângulo da agulha é ajustado até que a seringa, a cabeça e as costas do animal estejam alinhadas (D). A agulha é deixada deslizar suavemente para baixo sem resistência até que a marca máxima de inserção esteja quase atingida ou atingida (E). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Eutanásia de cachorro neonatal e coleta de cólon

  1. Realizar a eutanásia utilizando o método apropriado exigido pela legislação nacional.
    NOTA: Recomenda-se a decapitação de filhotes até o DOL 10 e a luxação cervical de filhotes com idade superior ao DOL 10. Eutanásia com CO2 ou anestésicos não é recomendada, pois os filhotes apresentam grande tolerância a esses métodos.
  2. Coloque o animal eutanasiado sob um microscópio binocular.
  3. Aplique 70% de etanol no abdômen do animal.
  4. Usando pinças, belisque a pele abdominal e o peritônio subjacente e faça uma grande incisão transversal abdominal usando tesouras finas (perpendiculares ao eixo rostral-caudal) sem cortar o intestino.
  5. Insira delicadamente a tesoura fina na incisão e estenda o corte lateralmente através do peritônio em ambos os lados.
  6. Usando pinças e tesouras finas, corte as partes superior e inferior do peritônio, desde a região torácica até a região pélvica inferior (Figura 2A).
  7. Identifique a parte distal do cólon e faça uma incisão paralela ao seu eixo, em direção ao reto.
  8. Faça uma incisão na porção terminal/retal do cólon para mobilizá-lo.
  9. Puxe suavemente o cólon e prosiga em direção ao ceco, removendo possíveis pedaços de tecido conjuntivo ou adiposo.
  10. Liberte o cólon do abdômen cortando na junção ileocecal, acima do ceco (Figura 2B).
  11. Descarte o ceco e os primeiros milímetros do cólon proximal, depois colete uma ou duas amostras do cólon proximal que sejam maiores que o tamanho da abertura do controle deslizante de Ussing (Figura 2C).
    NOTA: É recomendável garantir duas biópsias de grande porte, pois o cólon neonatal é extremamente frágil e pode ser facilmente rasgado, lacerado ou perfurado durante a limpeza e a montagem.
  12. Com a tesoura fechada, remova suavemente o conteúdo fecal da biópsia achatada aplicando leve pressão e deslizando da extremidade proximal para a distal.
  13. Coloque a peça do cólon esvaziada em um buffer KRB gelado.

Figura 2
Figura 2: Dissecação do cólon do filhote DOL 10. A epiderme e o peritônio do filhote são cortados e abertos em dois passos para evitar uma incisão involuntária do cólon, até que a totalidade da cavidade abdominal fique exposta (A). O cólon é liberado do abdômen por um primeiro corte da seção distal/retal, seguido por um segundo corte acima do ceco (B). Os milímetros iniciais do cólon proximal são descartados, e uma a duas amostras de cólon maiores que o tamanho da abertura dos deslizadores de Ussing são coletadas (C). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Ensaio de permeabilidade do cólon usando biópsias de camundongos em câmaras de Ussing

  1. Preparação do ensaio
    1. No dia anterior ao dia do experimento Ussing. Para garantir condições ideais de ensaio, recomenda-se a preparação de várias soluções no dia anterior ao experimento. Essas soluções são preparadas conforme instruído na Tabela 1.
      NOTA: as tabelas a seguir indicam os valores exigidos para 12 câmaras Ussing, com KRB 10x em grande excesso para permitir a aliquotação.
      NOTA: A solução KRB 10x pode ser armazenada a 4 °C por até 6 a 12 meses.
    2. No dia do experimento, 30 minutos antes da eutanásia dos animais:
      1. Prepare 400 mL de buffer KRB, conforme instruído na Tabela 2.
        NOTA: O KRB 10x, a água desionizada e o bicarbonato devem ser pré-misturados e bolhados usando gás carbogênio (95%O2; 5% CO2) por 15 minutos antes de adicionar CaCl2 para evitar precipitação.
      2. Usando um sistema de carbogênio (95%O2; 5% CO2), faça bolhas no tampão KRB fresco por 15 minutos.
      3. Divida os 400 mL do tampão KRB em dois e prepare 200 mL de Krebs-Glicose, 200 mL de Krebs-Mannitol e a solução HRP conforme descrito na Tabela 3.
    3. Configuração do sistema Ussing
      1. Pré-aqueça o sistema Ussing a 37 °C.
      2. Pré-montar as câmaras da seguinte forma:
        1. Levante as travas de cada ranhura.
        2. Coloque as câmaras em suas ranhuras sem apertar o sistema.
        3. Insira os dois tubos de fornecimento de gás em cada parte das câmaras.
        4. Introduza os quatro eletrodos nas aberturas frontais (se disponíveis - não coberto aqui) ou sele as quatro aberturas usando cones de 200 μL preenchidos com cola antes do experimento.
        5. Coloque bandejas sob as câmaras antecipando possíveis vazamentos.
      3. Montagem de tecido
        1. Seque levemente a amostra de cólon previamente limpa com papel toalha para remover o excesso de umidade.
        2. Coloque o pedaço de cólon sob uma lupa e insira delicadamente uma das lâminas de tesoura fina na parte luminal para cortá-la (Figura 3A).
          NOTA: O corte pode ser feito em um único movimento assim que as tesouras estiverem totalmente inseridas. A seção do cólon usada deve ser o mais reta possível, evitando torção.
        3. Usando pinças finas, monte o tecido na parte branca do controle deslizante mantendo a parte luminal para cima, em direção ao operador. O tecido deve estar desprovido de vestígios de gordura, fezes, rugas, perfurações e lacerações, e deve cobrir amplamente a abertura (Figura 3B).
        4. Feche o deslizador sob o microscópio binocular e verifique se há possível deslocamento do tecido. Uma leve deformação do tecido deve ser visível quando pressão é aplicada ao slider, o que indica que o slider está firmemente fechado.
          NOTA: Instale os controles deslizantes na câmara de Ussing (Figura 4) e inicie a etapa de equilíbrio individualmente assim que estiver pronta, para evitar a desidratação da amostra.
        5. Mantendo uma leve pressão no controle deslizante para mantê-lo fechado, insira o deslizador na câmara de Ussing, garantindo que o lúmen (parte transparente do deslizante) fique voltado para a esquerda.
        6. Feche ambos os trincos e aperte o parafuso localizado à direita até que a câmara fique hermética e o controle deslizante não possa se mover.
      4. Configuração final e balanceamento
        1. Adicione 4 mL de Krebs-Mannitol ao compartimento esquerdo (apical) da câmara.
        2. Adicione 4 mL de Krebs-Glicose ao compartimento direito (basolateral) da câmara.
        3. Coloque um pequeno pedaço de parafilme entre os dois compartimentos para evitar contaminação cruzada.
        4. Abra a entrada de gás (95%O2 / 5%CO2) e ajuste a saída entre 1-2 bolhas/s.
        5. Elimine quaisquer bolhas grandes localizadas no tecido ou no sistema usando uma pipeta Pasteur.
        6. Deixe o sistema equilibrar por até 20-30 minutos.
        7. Prepare a solução FITC 4kDa + HRP + Mannitol, conforme descrito na Tabela 4.
  2. Iniciando o ensaio de permeabilidade do cólon
    1. Uma vez atingido o equilíbrio do sistema, substitua-se 200 μL de Krebs-Mannitol do compartimento apical (à esquerda) por 200 μL de solução FITC 4Kd + HRP + Mannitol e inicie imediatamente um temporizador. Lave a ponta fazendo suaves subas e descidas no compartimento e descarte a ponta entre cada câmara.
    2. Para cada câmara, colete 2 x 100 μL (duplicados) do compartimento basal (direito) e deposite os volumes em uma placa preta de 96 poços. Cubra a placa com papel alumínio para evitar a fotodegradação do FITC presente na placa.
    3. Substitua imediatamente os 200 μL previamente coletados por 200 μL de Krebs-Glicose fresca.
    4. Repita os passos (2) e (3) a cada 30 minutos até atingir o ponto de tempo de 2 horas, para obter os pontos de tempo: T0, T30, T60, T90 e T120.
    5. Sele a placa com papel alumínio para evitar a fotodegradação do FITC e prossiga para a quantificação do FITC.
MgCl2 1M
MW (g/mol)Volume Final = 20 mLConcentração final
milli-Q H2OLevar ao volume final
MgCl2, 6H2O203.34,066 g1 M
KRB 10X
MW (g/mol)Volume Final = 1LConcentração final
milli-QH 20Levar ao volume final
NaCl58.4470 g1.198 M
KCl74.553,4 g45,6 mM
Na2HPO4 ,2H 2O177.991 g5,62 mM
NaH 2PO4,2H 2O156.012,3 g14,7 mM
MgCl2 1M5 mL5 mM
Bicarbonato 750 mM
MW (g/mol)Volume Final = 250 mLConcentração final
milli-Q H2OLevar ao volume final
NaHCO38415,75 g750 mM
CaCl2 2M
MW (g/mol)Volume Final = 50 mLConcentração final
milli-Q H2OLevar ao volume final
CaCl211111,098 g2 M

Tabela 1: Preparação da solução no dia anterior ao experimento de Ussing.

Buffer KRB (400 mL)
VolumeConcentração final
KRB 10X40 mL1X
H2O (mili-Q)352 mL
Bicarbonato 750 mM8 mL15 mM
CaCl2 2M240 μL1,2 mM

Tabela 2: Preparação do buffer KRB no dia do experimento Ussing.

Krebs-Glicose/Mannitol (200 mL cada)
Volume final = 200 mLConcentração final
KRB BufferLevar ao volume final
Glicose360 mg10 mM
ou
Mannitol364 mg10 mM
Solução HRP
Volume final = 1480 μLConcentração final
Krebs-MannitolLevar ao volume final
HRP13 mg8,8 mg/mL

Tabela 3: Preparação das soluções de glicose de Krebs/manitol e HRP no dia do experimento de Ussing.

Solução FITC 4kDa + HRP + Mannitol
Para 12 câmarasVolumeConcentração final
HRP (8,8mg/ml)1345 μL
Krebs-Mannitol1155 μL
FITC 4Kd166,6 mg16,66 mM

Tabela 4: Preparação da solução FITC 4 kDa + HRP + manitol no dia do experimento de Ussing.

Figura 3
Figura 3: Montagem de uma amostra de cólon de um filhote DOL 9. Uma lâmina de um par fino de tesouras é inserida no segmento luminal da amostra para cortá-la em um único movimento (A). A amostra aberta é montada na abertura deslizante de Ussing com o lado luminal voltado para o operador (B). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4
Figura 4: Imagem de câmaras de Ussing totalmente preparadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Avaliação da permeabilidade paracelular do cólon por meio da quantificação do FITC

  1. Preparação para os padrões FITC
    1. Dilua a solução de FITC 4Kd + HRP + Mannitol em Krebs-Glucose para preparar as diluções padrão descritas na Tabela 5 e na Figura 5.
    2. Deposite 2 x 100 μL (duplicado) de cada diluição padrão de n°1 a n°7 na placa. Sele a placa com papel alumínio para proteger da luz até que a leitura da placa comece.
  2. Aquisição de dados: Usando um leitor de placa, ajuste o comprimento de onda da excitação para 485 nm e a emissão para 535 nm, e leia a placa o mais rápido possível.
    NOTA: É recomendado ler a placa tanto com ganho ótimo quanto com ganho definido manualmente para facilitar a comparação de valores entre placas e permitir a interpolação dos dados caso um erro tenha sido cometido durante diluições padrão.
  3. Armazenamento de placas: Uma vez que os dados de quantificação FITC tenham sido armazenados, armazene-se as placas seladas com papel alumínio a 4 °C durante a noite se a quantificação de HRP for realizada nos dias seguintes, ou congeladas a -80 °C para armazenamento mais longo.

Figura 5
Figura 5: Representação visual da preparação padrão de diluições do FITC. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diluições padrão FTIC
N°1234567
Diluição1:10000 da solução de estoque FITC1:2 de diluição nº11:2 de diluição n°21:10 de diluição nº 11:2 da diluição nº 41:2 da diluição nº 5
Krebs-Glucose
FITC (μM)1.660.830.4150.1660.0830.04150

Tabela 5: Preparação das diluições padrão FITC no dia do experimento Ussing.

5. Avaliação da permeabilidade transcelular do cólon por meio da quantificação HRP

  1. No dia anterior ao dia da quantificação HRP:
    1. Garantir condições ideais no dia do ensaio; A preparação de várias soluções é necessária no dia anterior ao experimento. Essas soluções são preparadas conforme descrito na Tabela 6.
      NOTA: As tabelas a seguir indicam as quantidades necessárias para uma placa de 96 poços. Os padrões HRP podem ser aliquotados e armazenados a -20 °C ou -80 °C por até vários meses. Devido à instabilidade, use apenas tampões novos de carbonato/bicarbonato.
    2. Após a preparação da solução de anticorpos anti-HRP, recubra imediatamente uma microplaca Clear 96-poço Clear Flat Bottom High Binding com 100 μL por poço. Embrulhe em papel alumínio e incube durante a noite a 4 °C.
  2. No dia do ensaio de quantificação HRP:
    1. Prepare o buffer de bloqueio de 5% de BSA conforme descrito na Tabela 7.
    2. Descarte o conteúdo da placa e lave com 280 μL de PBS Tween 4 vezes, com 1 minuto de agitação a 350 rpm entre cada lavagem.
    3. Adicione 200 μL de buffer de bloqueio BSA a cada poço.
    4. Sele a placa com papel alumínio e incube em um shaker a 500 rpm por no mínimo 1 hora. Enquanto isso, descongele e dilua as amostras (1:10 ou 1:50) e prepare as diluições padrão conforme descrito na Tabela 8.
    5. Descarte o conteúdo da placa e lave com 280 μL de PBS Tween 4 vezes, com 1 minuto de agitação a 350 rpm entre cada lavagem.
    6. Adicione 50 μL de amostras padrão ou diluídas, fele a placa e incube a 300 rpm por 1 hora em RT.
    7. Durante a incubação, leve os reagentes QuantaBlu para RT e prepare a solução de trabalho conforme descrito na Tabela 9.
    8. Descarte o conteúdo da placa e lave com 280 μL de PBS Tween 4 vezes, com 1 minuto de agitação a 350 rpm entre cada lavagem.
    9. Adicione 100 μL de Solução de Trabalho QuantaBlu a cada poço em RT ou 37 °C (1,5-90 min, 30 min em média).
      NOTA: O progresso do ensaio pode ser seguido pelo aparecimento de uma forte fluorescência azul sob uma fonte de luz UV.
    10. Adicione 100 μL de Solução QuantaBlu Stop a cada poço para interromper a atividade da peroxidase. Sele a placa e incube por 10 minutos em RT sob agitação a 350 rpm.
    11. Usando um leitor de placa, ajuste o comprimento de onda da excitação para 315 nm e a emissão para 470 nm. Leia a placa o quanto antes.
      NOTA: É recomendado ler a placa tanto com ganho ótimo quanto com ganho definido manualmente para facilitar a comparação de valores entre placas e permitir a interpolação dos dados caso um erro tenha sido cometido durante diluições padrão. Alternativamente ao kit de substrato QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase, outros substratos de peroxidase como a tetrametilbenzidina podem ser usados (medidos em 450 ou 650 nm com ou sem o uso de solução de parada, respectivamente), mas o uso dessa alternativa tem o custo de menor sensibilidade.
Solução BSA
MW (g/mol)Volume Final = 12,7 mLConcentração final
Milli-Q H2OLevar ao volume final
BSA664301,27 g100 mg/mL
Krebs-Glicose + BSA
MW (g/mol)Volume Final = 30 mLConcentração final
Krebs-GlucoseLevar ao volume final
Solução BSA60 μL0,2 mg/mL
PBS Tween
MW (g/mol)Volume Final = 500 mLConcentração final
PBS 1XLevar ao volume final
Pré-adolescente-20500 μL0.1%
Carbonato de sódio sol.
MW (g/mol)Volume Final = 3,22 mLConcentração final
Milli-Q H2OLevar ao volume final
Na2CO3105.9934,13 mg0,1 M
Bicarbonato de sódio sol.
MW (g/mol)Volume Final = 12,7 mLConcentração final
Milli-Q H2OLevar ao volume final
NaHCO384106,68 mg0,1 M
Buffer de revestimento pH 9,6
Volume Final ≈ 11 mL
Carbonato de sódio sol.2,58 mL
Bicarbonato de sódio sol.Adicione até pH = 9,6 (~8,4 mL)
Padrão HRP de 10 μM
Concentração inicialVolume final = 5 mLConcentração final
Krebs-GlucoseLevar ao volume final
Solução HRP8,8 mg/mL50 μL0,088 mg/mL
Solução BSA100 mg/mL10 μL0,2 mg/mL
Padrão HRP de 1,5 nM
Concentração inicialVolume final = 15 mLConcentração final
Krebs-GlucoseLevar ao volume final
Padrão HRP de 2,0 μM0,088 mg/mL2,25 μL13,2 ng/mL
Solução BSA0,2 mg/mL3 μL40 ng/mL
Solução de anticorpos anti-HRP
Concentração inicialVolume final = 10 mLConcentração final
Amortecedor de revestimentoLevar ao volume final
Anticorpo anti-HRP5,6 mg/mL8,93 μL5 μg/mL

Tabela 6: Preparação da solução no dia anterior ao experimento HRP.

Buffer de bloqueio BSA
Concentração inicialVolume Final = 25 mLConcentração final
PBS 1X12,5 mL
Solução BSA100 mg/mL12,5 mL50 mg/mL

Tabela 7: BSA bloqueando a preparação do buffer no dia do experimento HRP.

PadrãoKrebs-Glicose + BSAPadrão HRP de 1,5 nMFmol HRP/50 μL
Em branco1000 μL0 μL0
1993,75 μL6,25 μL0.09375
2987,5 μL12,5 μL0.1875
3975 μL25 μL0.375
4950 μL50 μL0.75
5900 μL100 μL1.5
6850 μL150 μL2.25
7800 μL200 μL3
8700 μL300 μL4.5
9600 μL400 μL6
10400 μL600 μL9
11200 μL800 μL12

Tabela 8: Preparação padrão de HRP no dia do experimento HRP.

QuantaBlu Solução Funcional
Volume Final = 12 mL
Solução de Substrato QuantaBlu10,8 mL
Solução de Peróxido Estável QuantaBlu1,2 mL

Tabela 9: Preparação da solução de trabalho QuantaBlu no dia do experimento HRP.

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Resultados

Quantificação padrão de curvas e concentrações de poços
O valor médio dos blanks foi subtraído de cada poço da placa. Com valores de absorção no eixo Y e concentrações no eixo X, uma curva padrão foi criada usando a função "Interpolate a curva padrão" do GraphPad Prism. Se todos os pontos padrão estiverem alinhados, o modelo "Linha" oferece os melhores resultados. Alternativamente, o modelo "Sigmoidal, 4 PL, X é concentração" oferece grande flexibilidade e precisão com interpolação padrão de curvas nã...

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Discussão

A gavage oral permite a administração repetida de uma dose luminal precisa e definida em camundongos neonatais individuais. Em contraste, a alimentação voluntária, embora uma alternativa viável, requer um tempo estendido de administração por animal para entregar uma quantidade menor de composto com precisão dedosagem reduzida 12. Além disso, o gavage oral acomoda volumes maiores do que os possíveis por via injetável, facilitando doses totais maiores em co...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi realizado com apoio financeiro do ANR-11-IDEX-0005-02 Laboratoire d'excellence INFLAMEX, um prêmio da Fondation de l'avenir (2025, AP-RM-24-012), e bolsas ANR Diab1GUT (ANR-24-CE15-7152). O estudo foi conduzido no contexto do consórcio INFIBREX e contou com o apoio do plano de investimentos "France 2030", lançado pelo governo francês e implementado pela Université Paris Cité sob seu programa IdEx "Iniciativa de Excelência" (ANR-18-IDEX-0001). Agradecemos com gratidão à Plataforma Técnica da Câmara Ussing do Centro de Pesquisa em Inflamação pelo apoio inestimável, e estendemos agradecimentos especiais a Alexandra Willemtz e Maude Le Gall por sua assistência especializada. Também gostaríamos de expressar nossa sincera gratidão à Plataforma de Instalações Animais do Centro de Pesquisa em Inflamação pelo apoio essencial, com agradecimentos especiais a Isabelle Renault e Guillaume Anselmet.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x DPBS SEM Ca & Ca MgDulbeccos14200091
Anticorpo anti-HRPNordic BiositeGTX10183Peroxidase de Raiz-Forte Monoclonal de Camundongo [2H11]
Lupa binocularOlympus SZ61Não é necessário especificar.
Placa preta de 96 poços com fundo planoThermoFisher Scientific137101As placas devem ser pretas e adaptadas às leituras de fluorescência. A tampa deve ser retirada durante a leitura.
BSAMerckA4503
Camundongos C57BL/6JRio Charles632C57BL/6J 
CaCl2Merck2382
Encadernação Transparente de Fundo Plano Alto com 96 PoçosCorning9018
D-(+)-glicoseMerckG8270 
HO destilado
D-MannitolMerckM4125
Pinças FinasFST11445-12
Tesoura FinaFST14058-09
FITC-Dextran 4KdFD4Laboratórios TdBSensível à fotodegradação.
Bolsa térmicaMinerve20 031 01
HRPMerckP8375
MgCl2, 6H2OMerckM2670 
Milli-Q H2O
Sistema de Uso P2300 EasyMount & CâmarasInstrumentos fisiológicosEM6-C-CESistemas, câmaras e sliders devem ser todos compatíveis.
P2306 Ussing Chamber SliderInstrumentos fisiológicosPI-P2306Diferentes modelos de deslizantes estão disponíveis para diferentes tamanhos e tipos de tecidos.
Kit de substrato de peroxidase fluorogênica QuantaBluThermoFisher Scientific15169
Agulhas de Alimentação Reutilizáveis Ponta RedondaFST18061-24Calibre 24, ponta de 1,25mm de diâmetro, ponta redonda. Deve ser lavado com água estéril, etanol a 70% e autoclavado antes do uso.
Bicarbonato de sódioMerckS6297
Carbonato de sódioMerckS7795
EspectrofotômetroTECAN Spark 10MUm leitor de placas com aquisição superior é necessário se forem usadas as placas pretas 137101.
Pré-adolescente-20MerckP7949

Referências

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  3. Sorini, C., et al. Loss of gut barrier integrity triggers activation of islet-reactive T cells and autoimmune diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (30), 15140-15149 (2019).
  4. An, J., et al. The role of intestinal mucosal barrier in autoimmune disease: a potential target. Front Immunol. 13, 871713(2022).
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  20. Gleeson, J. P., et al. The enhanced intestinal permeability of infant mice enables oral protein and macromolecular absorption without delivery technology. Int J Pharm. 593, 120120(2021).
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