Um método simplificado para a transformação mediada por agrobactérias de Phytophthora palmivora

Resumo

Apresentamos um protocolo simples, eficaz e reprodutível para a transformação mediada por Agrobacterium em Phytophthora palmivora, que também é aplicável a P. capsici.

Resumo

Phytophthora é um gênero de oomicetos que contém numerosos patógenos vegetais destrutivos, entre os quais está a espécie de amplo espectro P. palmivora. A genômica funcional da Phytophthora tem sido limitada pela disponibilidade limitada de métodos de transformação robustos e fáceis de implementar. Entre as abordagens disponíveis, a transformação mediada por Agrobacterium (AMT) é particularmente atraente porque requer equipamentos especializados mínimos e frequentemente produz transformantes estáveis com inserções gênicas de cópia única. A maioria dos protocolos de AMT para transformação fúngica e oomiceta utiliza sais de meio mínimo (MM) em meios de indução e co-cultivo por Agrobacterium . Preparar esses meios normalmente envolve a produção e mistura de múltiplas soluções de estoque, algumas contendo diversos componentes em diferentes concentrações. O processo é demorado e propenso a erros, levando a um sucesso inconsistente na transformação. Aqui, apresentamos um protocolo AMT simplificado, simples e reproduzível para P. palmivora que utiliza meio basal Murashige e Skoog (MS) comercialmente disponível para preparar o meio de indução e co-cultivo do Agrobacterium . Esse protocolo também foi aplicado com sucesso para transformar P. capsici e pode ser aplicado a outras espécies de Phytophthora também.

Introdução

Phytophthora, um gênero de oomicetos, inclui muitos dos patógenos vegetais mais destrutivos do mundo, responsáveis por perdas econômicas^{severas 1,2}. Entre elas, Phytophthora palmivora é um patógeno de amplo espectro de hospedeiros que infecta muitas culturas economicamente importantes, incluindo cacau e^{mamão 3}. É o agente causal mais difundido da podridão da vagem-negra no cacau, uma árvore perene tropical que produz o principal componente da indústria multibilionária do chocolate^. Compreender os mecanismos de patogenicidade molecular desse patógeno destrutivo é fundamental para projetar estratégias novas e eficazes de controle de doenças, e a transformação genética é uma ferramenta essencial para viabilizar tais investigações.

Vários métodos foram desenvolvidos para transformar Phytophthora spp., incluindo bombardeio de^{microprojéteis 7}, transformação de protoplastos mediada por polietilenoglicol e dicloro-cálcio (PEG/_{CaCl 2}⁾ 8,9,10,11, eletroporação de zoósporos 12,13,14 e transformação mediada por agrobactéria (AMT^)15.16. Entre essas abordagens, a AMT oferece vantagens importantes, pois normalmente gera integração gênica de cópia^{única 15,16} e é relativamente fácil de realizar sem a necessidade de equipamentos especializados.

Um protocolo para transformação eficiente de P. palmivora usando AMT já foi desenvolvido^{anteriormente 16}. Com esse método, transformamos com sucesso P. palmivora com múltiplos construtos^17,18. Esse método utiliza meio de indução e co-cultivo de Agrobacterium à base de meio mínimo (MM), que são comumente usados para transformação fúngica e de oomicetos 15,16,19. Embora o protocolo de transformação baseado em MM tenha se mostrado eficaz na geração de transformadores, preparar múltiplas soluções padrão e combiná-las para criar mídia pode ser uma tarefa que consome tempo e é propensa a erros.

Aqui, apresentamos um método muito simplificado para o AMT de P. palmivora, utilizando meio basal comercial Murashige e Skoog (MS) para substituir os componentes do meio à base de sal MM no meio de indução e co-cultivo^{Agrobacterium 16}. Esse método elimina a necessidade de preparar múltiplas soluções químicas de stock, tornando o processo menos demorado e altamente reproduzível. Além disso, essa abordagem parece gerar maior eficiência de transformação em comparação com o método¹⁶ descrito anteriormente, e também é aplicável a P. capsici.

Protocolo

1. Preparação de soluções de estoque, meios e outros materiais necessários para a transformação

1. Soluções de estoque antibiótico
   1. Preparar soluções de estoque de kanamicina (50 mg/mL), G418 (15 mg/mL) e cefotaxima (100 mg/mL): Dissolva as quantidades adequadas dos antibióticos em água, esterilize as soluções com filtro, prepare alíquotas de 1 mL e armazene-as a -20 °C.
   2. Prepare solução de base de rifampicina (15 mg/mL): Dissolva a quantidade adequada de rifampicina em DMSO, prepare alíquotas de 1 mL, envolva-as em papel alumínio e armazene-as a -20 °C.
      NOTA: Certifique-se de filtrar e esterilizar soluções químicas preparadas em DMSO usando filtros de seringa feitos de materiais compatíveis com DMSO, como Nylon ou PTFE (Teflon).
2. Mídia para crescimento de Agrobacterium
   1. Mídia líquida Luria-Bertani (LB): Para preparar 250 mL de mídia, adicione 6,25 g de pó LB a 250 mL de água, faça o autoclave da solução e armazene em temperatura ambiente (RT).
   2. Meio de ágar LB: Para preparar 250 mL de meio, adicione 6,25 g de pó LB e 3,75 g de ágar a 250 mL de água, autoclave a solução e armazene em RT. Adicione os antibióticos apropriados ao ágar LB derretido antes de preparar as placas. Armazene os pratos suplementados com antibióticos a 4 °C.
3. Mídia para o crescimento e transformação de P. palmivora
   1. Ágar V8 10%: Para preparar 500 mL, adicione 50 mL de suco vegetal original 100% do V8 a 450 mL de água. Depois, adicione 0,5 g de CaCO₃ à suspensão e mexa para misturar bem. Autoclave a solução e despeje em pratos.
      NOTA: Adicione antibióticos apropriados quando necessário. Armazene os pratos suplementados com antibióticos a 4 °C.
   2. Meio líquido Murashige e Skoog (1/2 MS) de meia concentração: Adicione 2,15 g de meio basal Murashige e Skoog (MS) a 950 mL de água, ajuste o pH para 5,6 com 1 N KOH e adicione água até 1 L. Use diretamente para fazer 1/2 MS de ágar (passo 1.3.3), autoclave o restante de 1/2 MS líquido e armazene em RT.
   3. 1/2MS ágar para ágar de co-cultivo agrobactéria-zoósporos (AZCA): Para preparar 600 mL de AZCA, misture 567 mL de 1/2 MS líquido da etapa 1.3.2 com 9 g de ágar. Autoclave a solução e armazene no RT.
   4. 50% de glicerol: Misture 50 mL de glicerol com 50 mL de água, faça o autoclave da solução e armazene em RT.
   5. 1M MES (pH 5,6): Para preparar 200 mL, adicione 39,048 g de hidrato MES a 160 mL de água e ajuste o pH para 5,6 com solução de NaOH. Em seguida, adicione água até 200 mL, esterilize a solução com filtro e armazene em RT em condições escuras.
      NOTA: O MES irá se dissolvendo gradualmente conforme o pH aumenta. Inicialmente, use NaOH 10 N para aproximar o pH de 5,6, o que quase dissolve o pó. Depois, adicione 1 N de NaOH para trazer o pH exatamente para 5,6.
   6. 20% de glicose: Dissolva 10 g de glicose em 40 mL de água, depois adicione água até 50 mL, esterilize a solução com filtro e armazene em RT.
   7. 200 mM Acetosiringona (AS): Dissolva 40 mg de 4'-Hidroxi-3',5'-dimetoxiacetofenona em 1 mL de DMSO (veja a NOTA abaixo da 1.1.2) e cubra a solução com papel alumínio. Faça tudo fresco no dia da transformação.
   8. Meio de indução agrobacterium (AIM): Para preparar 40 mL de meio, adicione 400 μL de glicerol a 50%, 400 μL de glicose a 20%, 1,6 mL de 1 M MES (pH 5,6), 40 μL de 200 mM de AS a 37,6 mL de solução líquida de 1/2 MS (pH 5,6) (preparada no passo 1.3.2) em um tubo estéril de 50 mL. Misture bem a solução, cubra o tubo com papel alumínio e use fresco em algumas horas.
   9. Ágar de co-cultivo agrobactéria-zoósporo (AZCA): Para preparar 600 mL do ágar, adicione 6 mL de 50% de glicerol, 3 mL de glicose a 20%, 24 mL de 1 M MES (pH 5,6), 600 μL de 200 mM de AS para autoclavar e derreter 567 mL 1/2 ágar MS (pH 5,6) (preparado no passo 1.3.3). Despeje a solução em pratos e cubra-os com um pano preto para proteger da luz.
      NOTA: Adicione as soluções químicas a meio ágar derretido de 1/2 MS (passo 1.3.9) quando a temperatura estiver entre 55-60 °C. Desligue as luzes do capô durante os passos 1.3.7-1.3.9, pois o AS é sensível à luz. Realize esses três passos no dia da transformação.
   10. Ágar de Plich: Para preparar 1 L do ágar, em 950 mL de água, adicione 0,5 g_{KH 2}PO₄, 0,25 g de MgSO_{4,7H 2}O, 1 g de L-asparagine, 5 g de glicose, 0,5 g de extrato de levedura, 10 μL de tiamina (100 mg/mL em água, armazenado a 4 °C), 10 mg de β-sitosterol (dissolver em 3 mL de etanol antes de adicionar). Mexa a solução para dissolver todos os ingredientes, depois adicione água para chegar a 1 L. Divida a solução em porções de 500 mL e adicione 7,5 g de ágar a cada 500 mL. Autoclave a solução e adicione os antibióticos apropriados quando a temperatura cair para 55 °C, depois despeje em placas.
   11. Membrana Hybond N+: Corte a membrana com as folhas protetoras em pedaços de 5 cm x 6 cm, envolva as peças em papel alumínio e faça autoclave. Ao colocar a membrana autoclavada sobre o meio AZCA, manusee-a com pinças estériles e descarte as folhas protetoras.

2. Cultivo de P. palmivora

1. Sete a oito dias antes da transformação, cultive o isolado de mamão P1 ¹⁶ de P. palmivora em placas de ágar V8 recém-preparadas, colocando um tampão de ágar de uma cultura de Phytophthora já cultivada (ou do estoque) no centro da placa de Petri.
   NOTA: Para obter uma concentração maior de zoósporos, é importante usar ágar V8 10% recém-preparado e não clarificado.
2. Incube as placas a 25 °C em um ciclo de 12 horas de luz e de 12 horas de escuridade por 7 a 8 dias até a transformação.

3. Preparação de Agrobacterium tumefaciens

1. Três dias antes da transformação, a esteira A. tumefaciens cepa EHA105 transportando pCB301TOR-GFP¹⁶ em uma placa LB de ágar suplementada com rifampicina (15 μg/mL) e kanamicina (50 μg/mL). Incube a placa a 28 °C por 2 dias.
   NOTA: A preparação inicial do Agrobacterium (passo 3.1) pode ser feita uma semana antes da transformação, e as placas podem ser armazenadas a 4 °C após o período de incubação de 2 dias.
2. No dia anterior à transformação, retire uma pequena quantidade de células de Agrobacterium e espalhe-as em uma nova placa LB de ágar, suplementada com antibióticos (conforme descrito no passo 3.1) usando a base inferior e plana de um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL. Para facilitar a espalhação, adicione 20 μL de meio líquido ao centro da placa de ágar LB, misture as células bacterianas com o meio LB e depois espalhe-as uniformemente pela placa. Incube a placa a 28 °C durante a noite por cerca de 16-18 horas.
3. Recolha as células cultivadas durante a noite com uma ponta de pipeta de 1 mL e ressuspenda-as em meio indutor de Agrobacterium (AIM) de 1 mL, pipetando para cima e para baixo. Dilua as células para OD₆₀₀ = 0,4 com AIM em um tubo estéril de 50 mL coberto com folha metálica. Faça no mínimo 5 mL para uso em co-incubação com zoósporos de P. palmivora (passo 5.1).
   NOTA: Um OD₆₀₀ variando de 0,1 a 0,8 permitiria uma transformação bem-sucedida. OD₆₀₀ = 0,4 é rotineiramente utilizado, pois essa concentração produziu a maior eficiência de transformação quando a indução e o meio de co-cultivo de Agrobacterium à base de meio (MM) foram usados para a^{transformação 16}.
4. Incube as bactérias em RT sob condições escuras por 1,5 a 2 horas em um agitador de plataforma com agitação suave (aproximadamente 70 rpm).
   NOTA: Recomenda-se manter as luzes do capuz apagadas durante a etapa 3.3 e afrouxar a tampa do tubo de 50 mL durante a incubação (passo 3.4).

4. Liberação dos zoósporos

1. Após 1 h de incubação com Agrobacterium tumefaciens (passo 3.4), inunde uma placa de P. palmivora de 7-8 dias com 10 mL de água pré-resfriada a 4°C, remova as bolhas de ar na superfície do meio batendo suavemente com a ponta de uma pipeta, e incube a placa a 4 °C por 15 minutos, seguida por 15 minutos em RT sob luz.
2. Transfira suavemente os zoomósporos liberados (cerca de 7-8 mL) para um tubo centrífugo estéril de 15 mL com uma pipeta, sem perturbar micélios e esporângios.
3. Para medir a concentração do zoósporo, transfira parte da suspensão do zóósporo (por exemplo, 20 μL) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e dilua-o 10 vezes com água (180 μL H₂O para zoósporos de 20 μL). Faça vórtice no tubo por 1 minuto para encapsular os zoósporos e facilitar a contagem, e depois conte o número de zósporos ao microscópio usando um hemaicitômetro. Multiplique o número contado por um fator de 10 para determinar a concentração da suspensão do zoósporo preparada no passo 4.2.
   NOTA: A concentração de zoósporos é medida para calcular a eficiência da transformação. Normalmente utilizamos concentrações que variam de 1,5 × 10⁶ a 5 × 10¹⁶ zoosporos por mL, com sucesso na transformação.

5. Co-incubação de Agrobacterium e zoósporos

1. Adicione 5 mL de Agrobacterium (preparado no passo 3.4) a 5 mL de suspensão de zoósporos (preparado no passo 4.2) em um tubo estéril de 50 mL coberto com papel alumínio. Misture e incube suavemente o tubo em RT por 2 horas no escuro. Mantenha a tampa frouxa e não sacuda o tubo durante a co-incubação.
2. Durante o período de coincubação (passo 5.1), prepare as placas AZCA (passo 1.3.9). Quando o meio solidificar, coloque uma peça de membrana Hybond ^N+ esterilizada (preparada na etapa 1.3.11) em cada placa AZCA e mantenha as placas no escuro.
3. Após 2 h de co-incubação entre Agrobactéria e zoósporo (passo 5.1), espalhe 300 μL da mistura em cada membrana ^{Hybond N+} colocada sobre as placas AZCA (passo 5.2) com a ponta de uma pipeta, deixando as margens livres do líquido.
4. Deixe a mistura secar ao ar por cerca de 10 minutos no capuz, deixando as placas de Petri descobertas. Cubra as placas assim que a solução na membrana parar de fluir.
   NOTA: Durante os passos 5.1-5.4, mantenha as luzes do capô apagadas. Se necessário, use luzes ao adicionar e espalhar a mistura nas membranas (passo 5.3).
5. Após secar ao ar, incube as placas a 25 °C no escuro por 2 dias.

6. Seleção de transformadores resistentes a G418

1. Após 48 horas de coincubação (passo 5.5), transfira as membranas ^{Hybond N+} de cabeça para baixo usando pinças esterilizadas para placas de ágar Plich suplementadas com G418 (30 μg/mL) e cefotaxima (100 μg/mL). Ao posicionar as membranas nas placas, não as arraste na superfície do meio.
   NOTA: A concentração de G418 para seleção de transformantes para cada isolado de P. palmivora deve ser determinada, pois diferentes níveis de sensibilidade são observados para diferentes isolados. Para isso, coloque um tampão de micélio de 0,5 cm de diâmetro no centro das placas de ágar de Pich, complementado com uma série de concentrações de G418 em incrementos de 5 μg/mL, começando do zero. Prepare três placas replicantes para cada concentração. Incube as placas a 25 °C por 7 dias. Identifique a menor concentração de G418 que iniba completamente o crescimento do isolado de Phytophthora e utilize-a para a seleção de transformantes.
2. Use a base plana de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para pressionar e deslizar suavemente sobre a superfície da membrana, garantindo que ela esteja em contato próximo com o meio. Observe a parte inferior das placas para verificar a presença de bolhas de ar entre a membrana e o meio. Esprema suavemente a bolha de ar, se houver, usando a base plana do mesmo tubo de microcentrífuga.
3. Incube as placas em um ciclo de 12 horas de luz e de 12 horas de escuridão a 25 °C por 2-3 dias.
4. Após 3 dias de incubação, remova as membranas usando pinças estéreis e continue incubando as placas nas mesmas condições. As membranas podem ser removidas após 2 dias se houver colônias visíveis nas placas.
   NOTA: Os transformantes normalmente aparecem entre 1 e 3 dias após a remoção da membrana, mas algumas colônias podem aparecer mais tarde. Para obter mais transformantes, monitore as placas por cerca de uma semana após a remoção das membranas.
5. Transfira os transformantes para placas de ágar V8 a 10% com a mesma concentração de G418 ou uma concentração reduzida em 30%.

Resultados

Seguindo esse protocolo, realizamos dois experimentos independentes para transformar P. palmivora usando A. tumefaciens EHA105 portando pCB301TOR-GFP¹⁶. Como esperado, a co-incubação de zoósporos com Agrobacterium resultou em colônias resistentes a G418 em placas de ágar Plich suplementadas com 30 μg/mL de G418, enquanto nenhuma colônia foi observada em placas controle sem infecção por Agrobacterium (Figura 1A). O número de transformantes resistentes a G418 por 10⁷ zoósporos produzidos a partir desses dois experimentos foi 55 e 50, respectivamente (Tabela 1), o que é quase o dobro do maior número (27 ± 5) anteriormente obtido usando o protocolo¹⁶ anterior.

Transformadores verdadeiros foram verificados por dois métodos: primeiro, a observação da fluorescência da GFP usando um microscópio de fluorescência, e segundo, a amplificação por PCR de um fragmento de 550 bp do gene EGFP usando Taq 2X Master Mix (NEB) com o par de primers EGFP-F2 (5'- GACGTAAACGGCCACAAGTTC-3') e EGFP-R2 (5'-GGGTGCTCAGGTAGTGGTTG-3'). No experimento (Exp) 1, 15 dos 18 transformadores resistentes ao G418, e no Exp 2, 17 dos 21 transformantes apresentaram fluorescência GFP (Tabela 1, Figura 1B). Para os sete transformadores resistentes a G418 que não apresentaram fluorescência em ambos os experimentos, três foram confirmados como verdadeiros transformantes por PCR (Figura 1C). No total, a taxa de verdadeiros transformadores foi estimada em 90%.

Além disso, também conseguimos transformar com sucesso um isolado de abóbora P. capsici , PC2024-14sz, usando A. tumefaciens EHA105 portando pCB301TOR-GFP, seguindo o protocolo com uma pequena modificação na preparação das suspensões de zósporos (o período de incubação a 4 °C após inundar uma placa de P. capsici com 7 dias com água pré-resfriada foi estendido para 30 minutos). O número de transformadores resistentes a G418 (30 μg/mL) por 10⁷ de um único experimento foi 13. Nove transformantes foram observados sob um microscópio de fluorescência, e todos produziram fluorescência (Arquivo Suplementar 1), sugerindo que são verdadeiros transformantes.

Figura 1: Transformação de P. palmivora usando A. tumefaciens EHA105 portadora de pCB301TOR-GFP. (A) Aparição de transformantes resistentes a G418 de P. palmivora em ágar de Plich suplementado com 30 μg/mL de G418. (B) Detecção da expressão de GFP sob microscópio de fluorescência em uma cepa representativa de transformante e P. palmivora wild-type (WT). As imagens foram tiradas tanto em canais de fluorescência de campo claro (BF) quanto GFP. (C) Amplificação por PCR de EGFP a partir de quatro transformantes com fluorescência detectável de GFP e sete sem fluorescência de GFP. O par universal de primers ITS4/ITS5²⁰ foi usado para amplificar a região interna do espaçador transcrito (ITS) para verificar a integridade do DNA. Transformantes sem fluorescência GFP são destacados em texto em negrito e sublinhado. Abreviações: M = NEB 100 pb escada de DNA; WT = isolado P1 do tipo selvagem P. palmivora ; N = PCR de controle negativo usando H₂O como modelo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Experimento	OD600 de Agrobacterium	Concentração de zoósporos (/mL)	Volume do zoósporo (mL)	Número de transformantes resistentes a G418	Número de transformadores com sinal GFP detectável (Detectado / Observado)	Número de transformantes resistentes a G418/ 107 zoósporos
1	0.4	1,8 x 106	4.3	43	15/18	55
2	0.4	2,9 x 106	4.6	67	17/21	50

Tabela 1: Eficiência da transformação mediada por agrobactérias de P. palmivora usando A. tumefaciens EHA105 portando pCB301TOR-GFP.

Arquivo Suplementar 1: Expressão de GFP sob microscópio de fluorescência em P. capsici do tipo selvagem (WT ) e um transformador representativo gerado usando A. tumefaciens EHA105 portando pCB301TOR-GFP. As imagens foram tiradas tanto em canais de fluorescência de campo claro (BF) quanto GFP. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este protocolo utiliza meio basal Murashige e Skoog de meia concentração (1/2 MS) para substituir componentes de sais de meio mínimo (MM) que são comumente usados em meios de indução e co-cultivo por Agrobacterium para transformação de oomicetos e fungos. Preparar meios à base de sal MM requer a produção de múltiplas soluções de stock a partir de diversos produtos químicos individuais e depois combinar essas^{soluções 19}. 1/2 MS também contém muitos componentes químicos; no entanto, como o MS está amplamente disponível comercialmente como pó pré-misturado, a preparação do médio é simplificada para dissolver o pó em água. Essa modificação reduz significativamente o tempo de preparação da mídia e minimiza o potencial de erro humano. Além disso, o protocolo melhora a eficiência da transformação, gerando um número maior de transformadores em comparação com o método^{AMT 16} descrito anteriormente. Também é eficaz para transformar P. capsici e provavelmente aplicável a outras espécies de Phytophthora . Reforçando ainda mais sua potencial de aplicabilidade mais ampla, o meio à base de esclerose múltipla já foi usado anteriormente para co-cultivar cepas de Agrobacterium tumefaciens expressando AtVIP1 (proteína interagente VirE2 de Arabidopsis thaliana 1) e zoósporos de P. infestans , possibilitando a transformação bem-sucedida de P. infestans²¹.

É importante notar que esse protocolo pode gerar uma baixa porcentagem de falsos positivos. Entre 39 transformadores resistentes a G418 testados por observação de fluorescência com GFP ou PCR, quatro não apresentaram nem fluorescência nem amplificação de EGFP (Tabela 1, Figura 1C). Como a integração parcial do T-DNA durante a transformação mediada por Agrobacterium não é incomum^22,23, é possível que apenas a porção do T-DNA contendo o gene NPTII do plasmídeo pCB301TOR-GFP¹⁶ tenha sido integrada ao genoma de P. palmivora. Alternativamente, os falsos positivos podem resultar de contato insuficiente entre a membrana e o meio seletivo, permitindo a fuga da seleção G418. Garantir que a membrana permaneça em contato total com o meio (passo 6.2) é, portanto, essencial.

Esse protocolo pode ser ainda mais simplificado. Por exemplo, o MES em meio indutivo Agrobacterium (AIM) e ágar de co-cultivo Agrobacterium-zoósporo (AZCA) pode potencialmente ser omitido. O MES é comumente usado como agente tampão em experimentos de bioquímica e biologia molecular para manter um pH estável; no entanto, preparar uma solução MES de 1 M em pH 5,6 leva tempo suficiente e aumenta o custo. Em AMT de plantas, como manjericão^{doce 24} e mamão²⁵, foram usados meios semelhantes de indução e co-cultivo de Agobacterium à base de EM, sem MES, sugerindo que o MES pode não ser essencial para a transformação de P. palmivora . Experimentos adicionais são necessários para confirmar que a omissão do MES não compromete a eficiência da transformação.

No geral, esse protocolo simplificado oferece uma plataforma prática e acessível para manipulação genética rotineira de P. palmivora, P. capsici e, potencialmente, outros oomicetos. Ele apoia uma ampla gama de estudos fundamentais, alguns com potencial translacional, incluindo marcação fluorescente de patógenos para acompanhar a dinâmica da infecção, marcação de proteínas para examinar a localização subcelular e análises funcionais por meio de mudanças direcionadas na expressão gênica ou sequências codificantes de proteínas. Quando combinado com a edição genômica baseada em CRISPR, espera-se que o protocolo acelere a dissecação dos mecanismos de patogenicidade e a identificação dos principais fatores de virulência nesses patógenos destrutivos. Os insights resultantes, por sua vez, permitirão o desenvolvimento de novas estratégias de controle de doenças baseadas em mecanismos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	VWR	525-1126
4'-Hidroxi-3',5' dimetoxiacetofenona	TCI	D2666	Acetosiringona (AS)
Tubo de 50 mL	Greiner Bio-one	227261
Etanol Absoluto	Biorreagentes Fisher	BP28184
Agar	Biorreagentes Fisher	BP1423-500
Papel alumínio
Membrana Hybond-N+ (30 cm e vezes 3 m)	Cytiva	RPN303B
Carbonato de cálcio	Sigma-Aldrich	239216-500G	CaCO3
Cefotaxima sal de sódio	Termo-Química Científica	AAJ6269006
D-(+)-glicose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
Kit Microbiano DNeasy PowerLyzer	Qiagen	12255-50
Pinças
Microscópio de fluorescência	Zeiss		Microscópio de fluorescência ZEISS Axioscope 5 com conjunto de filtro 38 HE
G418 sulfato	Termo-Química Científica	AC329400010
Glicerol	Sigma-Aldrich	911046-1L
Hemacitômetro (Linha Brilhante)	Hausser Scientific
Sulfato de kanamicina	Santa Cruz Biotecnologia	SC-257635
L-Asparagina anidro	MP Biomédicos	ICN10079425
LB Broth, Miller	Biorreagentes Fisher	BP1426-2
Sulfato de magnésio heptahidratado	Sigma-Aldrich	63138-250G	MgSO4· 7H2O
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M2933-100G
Médio Basal Murashige e Skoog	Sigma-Aldrich	M5519-50L
Placa de Petri (100 mm x 15 mm)	VWR	25384-342
Dihidrofosfato de potássio	Sigma-Aldrich	1370391000	KH2PO4
Rifampicina	Santa Cruz Biotecnologia	SC-200910
Taq 2X Master Mix	NEB	M0270L
Cloridrato de tiamina	Sigma-Aldrich	T4625-5G
Espectrofotômetro UV-Visível	Fisher Scientific	14-385-355
V8 Original 100% Suco de Vegetais	Companhia de Sopas Campbell
Vórtice	Fisher Scientific	14-955-163
Água			Grau de Biologia Molecular, purificado usando o sistema de purificação de água Mill-Q
Extrato de Levedura	ACROS	611805000	Atualmente disponível pela Thermo Scientific Chemicals
β-Sitosterol	Sigma-Aldrich	85451-100G