Artigo de método

Diferenciação e indução do acúmulo de gotículas lipídicas em adipócitos humanos como modelo para estudar a obesidade in vitro

274 vistas

⸱

DOI:

10.3791/69759

⸱

20 de março de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

Neste artigo

Resumo

O protocolo apresentado tem como objetivo desenvolver um modelo celular que imite a obesidade humana. Para isso, células-tronco humanas derivadas do adiposo são diferenciadas em adipócitos, que são engordados usando uma mistura de ácidos graxos selecionados.

Resumo

Alterações relacionadas à obesidade no tecido adiposo alteram os perfis secretores locais e influenciam interações com outras células ao redor, incluindo células cancerígenas. A entrega contínua de nutrientes altera o metabolismo das células de gordura, fazendo com que atuem como um reservatório lipídico. Normalmente, a pesquisa sobre mecanismos da obesidade depende de modelos animais, que, no entanto, não permitem a análise dos processos metabólicos em nível celular. Portanto, há a necessidade de desenvolver um modelo in vitro confiável da obesidade humana que possa ajudar a explorar mudanças na função dos adipócitos obesos em comparação com seus equivalentes magros. Este trabalho apresenta um protocolo para a diferenciação de adipócitos humanos a partir de seus precursores (células-tronco derivadas de adiposos) usando uma mistura de insulina, isobutil-1-metilxantina, dexametasona e indometacina. Subsequentemente, adipócitos diferenciados foram incubados com um conjunto de ácidos graxos, incluindo linoleato, palmitato e oleato, para promover o acúmulo de lipídios. Como resultado, foi alcançado um modelo valioso que imita as células hipertróficas em condições de obesidade, que pode ser usado para estudos adicionais.

Introdução

Acredita-se que a obesidade seja um fator de risco importante para uma ampla gama de doenças, como distúrbios musculoesqueléticos, doenças cardiovasculares, resistência à insulina, síndrome metabólica, diabetes e tipos selecionados decâncer 1. A obesidade é um dos problemas de saúde pública mais perceptíveis e subestimados, com causas que são multielementares. Resumidamente, a obesidade é desencadeada por um desequilíbrio entre as calorias consumidas e gastas, resultando em maior armazenamentode gordura 2. O excesso calórico leva à expansão e disfunção patológica do tecido adiposo (AT), o elemento-chave no controle do corpo sobre a homeostase energética.

Adipócitos são o principal componente celular daAT 3. O principal contribuinte para o crescimento da AT sob condições de obesidade é a hipertrofia celular, ou seja, o aumento do volume de adipócitos por um aumento da quantidade de gordura armazenada no citoplasma na forma de gotículas lipídicas (LDs)4. Mesmo que a obesidade seja um distúrbio patológico complexo, estudos sobre o funcionamento biológico dos adipócitos podem servir como modelo para analisar suas causas e explorar novas estratégias de tratamento. Isso destaca a necessidade de uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares que impulsionam alterações na função dos adipócitos para desenvolver novas estratégias terapêuticas voltadas a doenças relacionadas à obesidade.

Os modelos animais são os mais próximos de refletir condições fisiológicas, o que os torna amplamente utilizados em estudos in vivo sobreobesidade 5. No entanto, tirar conclusões sobre processos biológicos fundamentais no nível celular continua sendo altamente desafiador em um sistema multicamada, que favorece o uso de modelos in vitro de adipócitos. A pesquisa in vitro geralmente se baseia no modelo celular 3T3-L1 do camundongo, que, sob condições apropriadas, adquire um fenótipo6 semelhante ao de um adipócito. No entanto, devido à sua origem, esse modelo não pode ser usado para análises mais complexas, como condições de co-cultura com células humanas, e os resultados nem sempre podem ser diretamente traduzidos em adipócitos humanos. Por todas essas razões, um modelo que imita a obesidade em humanos está sendo pesquisado, e o uso de células-tronco derivadas do adiposo humano (ADSCs) com sua diferenciação subsequente parece ser racional. Portanto, esse modelo é mais adequado para o estudo da hipertrofia de adipócitos humanos in vitro devido à sua baixa complexidade. Ele permite a comparação de parâmetros de um único tipo de cultura celular sob diferentes condições, o que é inatingível in vivo devido à presença de múltiplos tipos celulares no tecido adiposo.

Preadipócitos humanos e células-tronco derivadas do adiposo isolados da AT são os exemplos mais comuns para estudar a disfunção dessetecido 6. Essas células, após a diferenciação, são um modelo atraente para modular os níveis de LD nos adipócitos por meio de engorda adicional. No entanto, há relativamente poucos estudos que examinem a hipertrofia em célulashumanas 7,8,9, e a maioria usa apenas um tipo de ácido graxo (FA) para induzir o acúmulo de LD.

Esse protocolo propõe suplementar adipócitos humanos com uma mistura de FAs (palmitato, oleato e linoleato) para imitar ambientes de obesidade. Isso permite a obtenção de uma ferramenta baseada em adipócitos humanos sobrecarregados de lipídios, que pode ser diretamente comparada às células adiposas controle (ingênuas). Esse modelo pode ser posteriormente usado para estudar as mudanças fenotípicas e funcionais entre adipócitos normais e hipertróficos, ou, se necessário, experimentos com condições de cocultura.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Use técnicas estéreis para realizar todas as etapas do protocolo em um exaustor de cultura celular de fluxo laminar. Consulte a Tabela de Materiais para detalhes sobre todos os reagentes e equipamentos. O protocolo de diferenciação descrito abaixo é adequado para células-tronco humanas derivadas do adiposo e pode diferir entre outros tipos celulares e sua origem. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de ADSCs para diferenciação

  1. Preparar o meio de crescimento dos ADSCs (ADSCs GM): Suplemente o Meio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, contendo 1 g/L de glicose com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de glutamina e antibióticos - solução antimicótica (100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B).
  2. Aqueça a solução GM dos ADSCs, soro salino tamponado com fosfato (PBS) e tripsina/EDTA a 37 °C.
    NOTA: Os ADSCs são obtidos de fontes comerciais. Use as células nas passagens iniciais. Múltiplas passagens levam a uma diminuição do potencial de diferenciação dosADSCs 10.
  3. Remover assepticamente o GM dos ADSCs dos ADSCs que crescem em um frasco T75 dedicado para cultura celular.
  4. Lave o GM residual dos ADSCs enxaguando o recipiente de cultura celular com 5 mL de PBS.
  5. Remova todo o volume de PBS do frasco.
  6. Adicione 2 mL de tripsina/EDTA ao recipiente de cultura e incube a 37 °C até que as células se soltem. Monitore esse processo com um microscópio invertido.
    NOTA: Tocar o prato de cultura acelera o descolamento celular.
  7. Bloqueie a atividade de tripsina adicionando 6 mL de GM de ADSCs novos.
  8. Reloque todo o volume de suspensão celular do prato de cultura para um tubo apropriado para centrifugação.
  9. Centrifuge as células a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente (RT).
  10. Remova o sobrenadante.
  11. Suspenda as células em 2 mL do GM recém-adicionado dos ADSC.
  12. Calcule a densidade e viabilidade celular com um hemocitômetro ou um contador automático de células.
    NOTA: A viabilidade celular pode ser avaliada usando coloração com corante azul tripano.
  13. Semeie as células no número desejado de poços, 15.000 células/poço, placa plástica de 96 poços em 100 μL do meio de crescimento do ADSCs.
    NOTA: Células semente sempre em duplicado para obter adipócitos destinados ao controle e incubação em condições de FAs. Dependendo do tipo de experimento, os ADSCs podem ser semeados em diferentes tipos de pratos ou recipientes plásticos. A densidade recomendada de semeadura é de 30.000 a 60.000 células porcm2. Dependendo do número de células necessárias para as análises subsequentes ou experimentos posteriores, ajuste o formato do prato de cultivo celular para placas de 6 ou 12 poços.
  14. Cultive as células a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.
  15. Quando as células atingirem 100% de confluência (tipicamente 24-48 horas após a placagem), induzir sua diferenciação em adipócitos seguindo as instruções abaixo.
    NOTA: É importante atingir um alto nível de confluência celular antes da indução da diferenciação. Em outros casos, pode afetar a eficiência da diferenciação. Se para células placadas levar mais de 48 horas para atingir alta confluência, troque o meio a cada 3-4 dias para o meio de crescimento do ADSC fresco.

2. Indução da diferenciação adipogênica

  1. Prepare meio de diferenciação (DM): Suplemente o meio DMEM/F12 com 10% de FBS, 2 mM de glutamina, antibióticos - solução antimicótica (100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B), 5 μg/mL de insulina, 0,5 mM de 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX), 5 μM de dexametasona, e 200 μM de indometacina.
    NOTA: Prepare o DM apenas no volume necessário para uso direto. Não guarde por muito tempo e sempre use DM recém-preparado. Antes do uso, aqueça o DM em banho-maria a 37 °C. IBMX e indometacina podem precipitar se forem adicionados ao meio em temperatura inferior a 37 °C. Para solubilizá-la, aqueça o líquido em banho-maria a 37 °C.
  2. Remova e descarte assépticamente todo o volume do meio dos ADSCs confluentes.
    NOTA: O meio de crescimento do ADSC deve ser removido completamente antes de adicionar DM.
  3. Adicione cuidadosamente 100 μL/poço de DM às células que crescem em uma placa de 96 poços.
    NOTA: Não deixe as células secarem ao trocar o meio.
  4. Incube as células em uma incubadora a uma temperatura de 37 °C, 5% de CO2 por 7 dias.
  5. Remova e descarte todo o volume de DM dos ADSCs.
  6. Adicione cuidadosamente 100 μL/poço de DM fresco às células que crescem em uma placa de 96 poços.
  7. Incube as células na incubadora a uma temperatura de 37 °C, 5% deCO2, pelos próximos 7 dias.
    NOTA: O progresso da diferenciação adipogênica pode ser detectado pela observação em campo claro das vacúolas lipídicas que aparecem nas células induzidas.

3. Engorda dos adipócitos

  1. Prepare meio de cultivo de adipócitos suplementado com FAs: suplemente o meio DMEM/F12 com 10% de FBS, 2 mM de glutamina, antibióticos - solução antimicótica (100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B), 0,33 mM de linoleato, 0,17 mM de palmato e 0,17 mM de oleato.
  2. Prepare meio de cultivo de adipócitos controle: suplemente o meio DMEM/F12 com 10% de FBS, 2 mM de glutamina, antibióticos - solução antimicótica (100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B), 0,44% de albumina sérica bovina (BSA) e 0,26% de etanol (estes dois últimos compostos também foram usados como solventes de FAs).
    NOTA: Prepare o controle e suplemente com meios de cultura de adipócitos FAs apenas no volume necessário para uso direto. Não armazene por muito tempo e sempre use mídia recém-preparada. Antes do uso, aqueça o substrato em banho-maria a 37 °C.
  3. Após um total de 14 dias de diferenciação, remova cuidadosamente e descarte todo o volume de meio DM dos adipócitos diferenciados em uma placa de 96 poços.
  4. Adicione cuidadosamente 100 μL/poço de meio de cultura de adipócitos suplementado com FAs a metade dos poços com células crescendo em uma placa de 96 poços.
  5. Adicione cuidadosamente 100 μL/poço de meio de cultura de adipócitos controlados na segunda metade dos poços, com células crescendo em uma placa de 96 poços.
    NOTA: Não deixe as células secarem ao trocar o meio.
  6. Incube as células a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 pelas próximas 48 horas.
  7. Após 48 horas, use as células de controle e as células incubadas com FAs para experimentos subsequentes.
    NOTA: Neste estágio, adipócitos engordados alcançados podem ser usados para múltiplos fins experimentais, como coloração celular, análise do metabolismo celular ou co-cultura com outros tipos celulares.

4. Manchas de gotículas lipídicas

  1. Prepare meio de cultura de adipócitos: suplemente o meio DMEM/F12 com 10% de FBS, 2 mM de glutamina e antibióticos - solução antimicótica (100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B).
  2. Diluir o corante fluorescente para corar LDs em meio de cultura de adipócitos em uma diluição de 1:1000.
  3. Remova e descarte todo o volume do meio de cultivo de adipócitos controle e do meio de cultura de adipócitos suplementado com FAs de células crescendo em uma placa de 96 poços.
  4. Adicione cuidadosamente 50 μL/poço de meio de cultura de adipócitos com corante fluorescente.
    NOTA: Não deixe as células secarem ao trocar o meio.
  5. Incube células a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 por 15 minutos.
  6. Lave o corante de fluorescência substituindo-o pelo meio de cultura de adipócitos de 100 μL/poço.
  7. Aquisição de imagem no canal de detecção de fluorescência verde (Ex 427 nm/Em 585 nm) com o microscópio fluorescente.
    NOTA: Este é o protocolo para coloração de células vivas. A coloração também pode ser realizada após a fixação de formaldeído das células.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

O método aqui descrito permite a diferenciação de ADSCs humanos em adipócitos maduros, seguida por um acúmulo aumentado de lipídios, imitando as células hipertróficas observadas em condições de obesidade. O curso temporal da diferenciação dos ADSCs humanos é mostrado na Figura 1. No dia 0, quando as células atingem 100% de confluência (Figura 1A), os ADSCs apresentam morfologia alongada e em forma de fuso. Neste momento, o proto...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O protocolo atual é um procedimento replicável em duas etapas para a diferenciação dos ADSCs, seguido pela incubação com FAs para alcançar um modelo celular que imita a obesidade. A etapa crítica para determinar sua eficácia é o número de passagens de ADSCs após seu isolamento. Múltiplas passagens levam a uma diminuição do potencial de diferenciação dessascélulas 10.

Durante a diferenciação de adipócitos, os ADSCs são deslocados de célu...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores afirmam que não possuem interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

O artigo foi financiado pelo Centro Nacional de Ciência, Polônia, com bolsas recebidas por Dorota Nowak (OPUS 22, nº 2021/43/B/NZ3/01458) e Aleksandra Simiczyjew (SONATA, 2020/39/D/NZ5/02330).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)MerckI5879
0,25% tripsina/0,05% EDTA pH 7,2IITD PAN, Wrocfigure-materials-1aw, Polônia20-500
Placa de 96 poçosTermodinâmica130188
Solução antibiótica antimicoléticaSigma-AldrichA5955
Albumina Sérica Bovina (BSA)Sigma-AldrichA3294
Contador de célulasN/AN/A
CentrífugaN/AN/A
DexametasonaSigma-AldrichD4902
Eagle Médio Modificado (DMEM) de DulbeccoIITD PAN, Wrocfigure-materials-2aw, Polônia10-500contendo 1 g/L de glicose
Médio Eagle Modificado da Dulbecco: Mistura Nutritiva F12Gibco11320-033
EtanolChempur113964200#1L
Soro fetal bovino (FBS)GibcoA5256701
hADSC Células-Tronco Humanas Derivadas do AdiposoLonzaPT-5006
IncubadoraN/AN/A
IndometacinaSigma-AldrichI8280-5G
InsulinaSigma-AldrichI9278
Microscópio invertidoN/AN/A
L-glutaminaSigma-Aldrich25030-024
Ácido linoleico sal de sódioSigma-AldrichL8134
LipidSpot fluorescenteBiotium70065
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Termodinâmica10010023
Soduim oleateSigma-AldrichO7501
Soduim palmatoSigma-AldrichP9767
Frasco de cultura celular T75Termodinâmica130190
Azul de tripanSigma-Aldrich95896HJ

Referências

  1. Lin, X., Li, H. Obesity: Epidemiology, pathophysiology, and therapeutics. Front Endocrinol. 12, 706978(2021).
  2. Wen, X., et al. Signaling pathways in obesity: Mechanisms and therapeutic interventions. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 298(2022).
  3. Sharma, S., Muthu, S., Jeyaraman, M., Ranjan, R., Jha, S. K. Translational products of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: bench to bedside applications. World J Stem Cells. 13 (10), 1360-1381 (2021).
  4. Guerreiro, V. A., Carvalho, D., Freitas, P. Obesity, adipose tissue, and inflammation answered in questions. J Obes. 2022, 2252516(2022).
  5. Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 140-162 (2018).
  6. Ruiz-Ojeda, F. J., Rupérez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. Cell models and their application for studying adipogenic differentiation in relation to obesity: A review. Int J Mol Sci. 17 (7), 1040(2016).
  7. Małodobra-Mazur, M., et al. Metabolic differences between subcutaneous and visceral adipocytes differentiated with an excess of saturated and monounsaturated fatty acids. Genes. 11 (9), 1-16 (2020).
  8. Ishaq, A., Tchkonia, T., Kirkland, J. L., Siervo, M., Saretzki, G. Palmitate induces DNA damage and senescence in human adipocytes in vitro that can be alleviated by oleic acid but not inorganic nitrate. Exp Gerontol. 163, 111798(2022).
  9. Berger, E., Géloën, A. Insulin prevents fatty acid induced increase of adipocyte size. Adipocyte. 11 (1), 510-528 (2022).
  10. Eom, J., et al. Visualization and quantification of mesenchymal cell adipogenic differentiation potential with a lineage specific marker. J Vis Exp. (133), e57153(2018).
  11. Pietraszek-Gremplewicz, K., et al. Response of primary human adipocytes to fatty acid treatment. J Cell Mol Med. 29 (10), e70622(2025).
  12. Zhu, D., Shi, S., Wang, H., Liao, K. Growth arrest induces primary-cilium formation and sensitizes IGF-1-receptor signaling during differentiation induction of 3T3-L1 preadipocytes. J Cell Sci. 122 (15), 2760-2768 (2009).
  13. Rosen, E. D., et al. PPARγ is required for the differentiation of adipose tissue in vivo and in vitro. Mol Cell. 4 (4), 611-617 (1999).
  14. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  15. Styner, M., Sen, B., Xie, Z., Case, N., Rubin, J. Indomethacin promotes adipogenesis of mesenchymal stem cells through a cyclooxygenase independent mechanism. J Cell Biochem. 111 (4), 1042-1050 (2010).
  16. Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation: activation of CREB rescues adipogenesis from the arrest caused by inhibition of prenylation. J Biol Chem. 276 (30), 28430-28435 (2001).
  17. Inthanon, K., Sririwichitchai, R., Davies, N. M. Rapid screening of adipogenic responses to EGCG in non-induced L929 adipocytes using image-based analysis compared to the conventional 3T3-L1 method. J Appl Pharm Sci. 15 (5), 138-148 (2025).
  18. Abbasi, K., Mehdizadeh, A., Hamishehkar, H., Nouri, M., Darabi, M. Fatty acid composition of lipid fractions in white- and brown-like adipocytes derived from human mesenchymal stem cells. Adipocyte. 14 (1), 2566481(2025).
  19. Pieters, V. M., et al. A three-dimensional human adipocyte model of fatty acid-induced obesity. Biofabrication. 14 (4), 045009(2022).
  20. Watt, M. J., Hoy, A. J., Muoio, D. M., Coleman, R. A. Distinct roles of specific fatty acids in cellular processes: implications for interpreting and reporting experiments. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302, 1-3 (2012).
  21. Alsabeeh, N., Chausse, B., Kakimoto, P. A., Kowaltowski, A. J., Shirihai, O. Cell culture models of fatty acid overload: problems and solutions. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1863 (2), 143-150 (2018).
  22. Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-induced changes in adipose tissue microenvironment and their impact on cardiovascular disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Diferencia o de Adip citosModelo de ObesidadeObesidade In VitroTecido AdiposoIncuba o com cidos GraxosC lulas Tronco Derivadas do Tecido AdiposoReservat rio Lip dicoAdip citos Hipertr ficos

Artigos relacionados