O RNA circular ZBTB46 atenua a apoptose e o estresse oxidativo em células endoteliais humanas lesionadas por lipopolissacarídeos ao modular a sinalização ERBB2-AKT

Resumo

A lesão renal aguda associada a sepse (SA-AKI) está associada a taxas consideráveis de mortalidade. Este estudo encontra circZBTB46 reduzida em HUVECs induzidos por LPS ( SA-AKI in vitro). Sua superexpressão aumenta a viabilidade do HUVEC, reduz a apoptose, inflamação e estresse oxidativo em associação com a sinalização ERBB2/AKT, sugerindo um potencial alvo terapêutico relevante para a SA-AKI.

Resumo

Os RNAs circulares são reguladores emergentes das respostas ao estresse, mas seus papéis na lesão endotelial que leva à lesão renal aguda relacionada à sepse permanecem incompletamente definidos. Hipotetizamos que o RNA circular ZBTB46 (circZBTB46) confere proteção endotelial ao engajar a sinalização ERBB2-AKT. Utilizando um modelo baseado em células, no qual células endoteliais da veia umbilical humana foram desafiadas com lipopolissacarídeo, quantificamos a expressão de circZBTB46 e testamos os efeitos de sua expressão forçada na sobrevivência, apoptose, mediadores inflamatórios e homeostase redox. Ensaios de viabilidade celular e citometria de fluxo avaliaram sobrevivência e apoptose. Ensaios imunossorventes ligados a enzimas mediram interleucina-6, fator de necrose tumoral α e interleucina-1β, enquanto espécies reativas de oxigênio, malondialdeído, superóxido dismutase e catalase foram avaliadas como índices de lesão oxidativa e capacidade antioxidante. Para definir o mecanismo, realizamos perfilamento do transcriptoma com análise de enriquecimento por conjuntos gênicos, confirmamos proteínas de via por Western blotting e avaliamos a necessidade usando o inibidor do ERBB2 AG-825. Lipopolissacarídeo suprimido circZBTB46. A superexpressão do CircZBTB46 aumentou a viabilidade, reduziu a apoptose, reduziu citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de oxigênio, diminuiu o malondialdeído e aumentou as atividades de superóxido dismutase e catalase. Análises transcriptômicas e proteicas apoiaram a ativação do eixo ERBB2-AKT, e o bloqueio farmacológico ERBB2 enfraqueceu a citoproteção e reverteu ganhos no equilíbrio redox. Esses achados identificam circZBTB46 como um freio endógeno no dano endotelial induzido por lipopolissacarídeos via sinalização ERBB2-AKT e indicam circZBTB46 como nó mecanicista e potencial alvo terapêutico para lesão renal aguda relacionada a sepse.

Introdução

A sepse, uma cascata inflamatória sistêmica potencialmente fatal iniciada por invasão patogênica, frequentemente culmina em falência^{multiorgânica 1}. Dentro desse contexto crítico, a AKA surge como uma complicação predominante e clinicamente significativa nas unidades de^{UTI 2}. Caracterizada por deterioração abrupta da capacidade de filtração renal concomitante com infecção sistêmica, essa condição apresenta taxas de mortalidade superiores às da IAC não séptica em 38%-42% nas coortes^{clínicas 2}. Aproximadamente 60% dos indivíduos diagnosticados com sepse ou choque séptico são esperados para desenvolver^{SA-AKI 3}. Portanto, a ISA-AKI tornou-se um grande desafio na UTI, contribuindo significativamente para a morbidade e^{mortalidade 4}. Atualmente, o mecanismo do SA-AKI permanece incompletamente compreendido. Embora estudos pré-clínicos tenham envolvido disfunção microcirculatória, alterações no metabolismo celular e desequilíbrios no sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS), disfunção mitocondrial e desregulação inflamatória, o mecanismo fisiopatológico da ACA-SA permanece esquivo, e atualmente há falta de medidas ideais para apoiar o diagnóstico precoce e o manejo contínuo 5,6,7,8 . A SA-AKI apresenta apoptose elevada, estresse oxidativo excessivo e^{inflamação 9}. Dentro desse quadro de pesquisa, o lipopolissacarídeo (LPS) foi empregado em um sistema in vitro para imitar as manifestações da AKI associada à sepse em células endoteliais da veia umbilical, humanas, para exploração preliminar^{do alvo 5}.

Nos últimos anos, os RNAs circulares (circRNAs), uma categoria recentemente identificada de moléculas de RNA não codificante, ganharam cada vez mais atenção por seu papel em várias^{doenças 10}. Os CircRNAs possuem uma estrutura circular estável e participam de processos fisiológicos e patológicos celulares atuando como esponjas moleculares para microRNAs (miRNAs), regulando a transcrição gênica ou engajando-se em interações^{proteicas 11}. Investigações indicaram que circRNAs estão criticamente envolvidos na modulação de inflamação, estresse oxidativo e vias apoptóticas, gerando assim um foco crescente em pesquisa sobre suas possíveis implicações em sepse e condições relacionadas, incluindo lesão renal^{aguda 12}. Por exemplo, hsa_circ_0072463 foi identificado como um marcador diagnóstico promissor e alvo terapêutico para^{SA-AKI 13}. Circ_001653 foi relatado como aliviando a SA-AKI por meio do recrutamento do^{BUD13 14}. No entanto, a importância funcional dos circRNAs no SA-AKI permanece amplamente inexplorada.

Este estudo foi projetado para examinar a influência do circZBTB46 na função das células endoteliais, estresse oxidativo e respostas inflamatórias usando um sistema in vitro SA-AKI. Ao construir um modelo HUVEC induzido por LPS, investigamos lesão endotelial sob estimulação endotoxica. Deve-se notar que os HUVECs desafiados por LPS representam um modelo reducionista de estresse endotelial impulsionado por endotoxinas/TLR4, relevante para, mas não equivalente, à fisiopatologia multifatorial da lesão renal aguda associada à sepse. Esse modelo captura principalmente ativação inflamatória mediada por TLR4, estresse oxidativo e respostas endoteliais relacionadas à apoptose, enquanto omite componentes-chave in vivo , como alterações hemodinâmicas, cascatas de complemento e coagulação, padrões moleculares associados a danos e estímulos microbianos heterogêneos. Dentro desse quadro experimental, investigamos se o circZBTB46 alivia o estresse oxidativo e a apoptose induzidos pelo LPS ao modular a via de sinalização ERBB2, protegendo assim a função das células endoteliais. Até onde sabemos, este estudo fornece a primeira evidência que liga o circZBTB46 às respostas endotelial ao estresse no contexto da lesão renal aguda associada a sepse. Ao elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à proteção endotelial mediada pelo circZBTB46, essa pesquisa pode aprofundar a compreensão dos mecanismos patogênicos do SA-AKI e abrir caminho para abordagens terapêuticas inovadoras centradas no circRNA.

Protocolo

Este protocolo descreve os procedimentos experimentais usados para investigar os efeitos da modulação circZBTB46 na sinalização inflamatória, estresse oxidativo e ativação da via ERBB2-AKT em HUVECs.

Cultura celular
As células HUVECs usadas neste estudo foram obtidas de uma fonte comercial. Os HUVECs foram usados como modelo representativo de células endoteliais devido à sua ampla disponibilidade, condições de cultura reprodutível e alta eficiência de transfecção, que facilitam a manipulação genética e a investigação mecanicista das vias de sinalização endoteliais sob estresse^{inflamatório 15,16}. Os HUVECs foram cultivados em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10% (v/v) e um coquetel antibiótico-antimicoótico com concentração de 1%. Todas as culturas celulares foram mantidas sob condições fisiológicas padrão em uma câmara umidificada (37 °C, 5% CO₂), que promoveu a proliferação celular sustentada enquanto preservava >95% de viabilidade, conforme confirmado pelo ensaio de exclusão com azul de tripano. Embora meios específicos endoteliais (por exemplo, EGM-2 ou M199 suplementados com suplementos de crescimento endotelial) sejam comumente recomendados para manutenção a longo prazo do HUVEC, o DMEM foi utilizado neste estudo para garantir consistência entre tratamentos experimentais e compatibilidade com estimulação LPS e ensaios de inibidores farmacológicos. Para os ensaios do inibidor de AG-825, incube HUVECs com DMEM fresco contendo 10 μM de AG-825 por 1 hora. Depois, adicione a solução de LPS aos poços para alcançar uma concentração final de 10 μg/mL e continue a cultura por 24 horas. Para minimizar a deriva fenotípica potencial, os HUVECs foram usados em números de passagens baixos e expostos a condições experimentais baseadas em DMEM apenas para ensaios de curto prazo. Todos os experimentos funcionais foram realizados dentro de janelas de tratamento definidas, em vez de durante cultivos prolongados.

Transfecção celular
Para elucidar o papel biológico do circZBTB46, plasmídeos de superexpressão (oe-circZBTB46) e construtos de controle negativos correspondentes (oe-NC) foram sintetizados e validados pelo GenScript. Os HUVECs foram semeados em placas de 6 poços com uma densidade de 1 x 10⁵ células/poço e cultivados durante a noite até atingir ~70%-80% de confluência no momento da transfecção. Para cada poço, 2,5 μg de DNA plasmídico (oe-circZBTB46 ou oe-NC) foi diluído em 125 μL de meio sérico reduzido e misturado com 2,5 μL do reagente P3000 (Tubo A). Paralelamente, 3,75 μL de Lipofectamina 3000 foram diluídos em 125 μL de meio sérico reduzido (Tubo B). O tubo A e o tubo B foram então combinados, suavemente misturados e incubados em temperatura ambiente por 15-20 minutos para permitir a formação de complexos (volume complexo final: 250 μL/poço). Os complexos foram adicionados gota a gota às células em meio completo sem antibióticos. Após 6 horas de incubação a 37 °C, 5% de CO₂, o meio de transfecção foi substituído por meio de crescimento fresco completo. As células foram cultivadas por 48 horas antes dos ensaios subsequentes. Todos os procedimentos seguiram as instruções do fabricante.

Modelo induzido por LPS
Para gerar um modelo in vitro SA-AKI, HUVECs (5 x 10 células^{de 5} células/poço) transfectados com oe-circZBTB46 ou NC foram semeados em placas de 96 poços e mantidos por 24 horas até que a confluência de 80% fosse atingida. Após isso, essas células passaram por tratamento com LPS a 10 μg/mL por 24 horas. HUVECs sem tratamento com LPS serviram como grupo controle.

qRT-PCR
A extração total de RNA dos HUVECs utilizou um reagente comercial. A transcrição reversa para síntese de cDNA foi realizada com o kit comercial de reagentes. A PCR quantitativa (qPCR) foi executada em triplicado usando um Sistema de PCR em Tempo Real junto com uma mistura master. As quantidades de expressão dos genes-alvo foram calibradas contra U6, com análise realizada pelo método 2^{−ΔΔCT 17,18}. Para análise de expressão de circRNA, o RNA nuclear pequeno de U6 foi usado como referência interna para normalização, pois é comumente empregado para quantificar pequenos RNAs não codificantes e tem sido relatado como apresentando expressão relativamente estável em condições experimentais in vitro de curto prazo. As sequências de instruções aplicadas neste estudo são listadas da seguinte forma:

circZBTB46-Ataque: 5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'

circZBTB46-Reverso: 5'-CGCCTCTTCTACAGACTGGG-3'

U6-Atacante: 5'-TGCTATCACTTCAGCAGCA-3'

U6-Reverso: 5'-GAGGTCATGCTAATCTTCTCTCTG-3'.

Ensaio CCK-8
A viabilidade dos HUVECs foi avaliada usando CCK-8 comprados comercialmente. Resumidamente, as células foram semeadas em uma placa de 96 poços, e as células passaram por cultura de adesão por 24 horas. Após isso, 10 μL de solução de CCK-8 foram adicionados a cada poço, e as células foram ainda incubadas a 37 °C por 2 horas. Um leitor de microplacas foi empregado para medir a densidade óptica (OD) em um comprimento de onda de 450 nm. Observações preliminares demonstraram que 10 μg/mL de LPS diminuíram significativamente a viabilidade dos HUVECs, levando à seleção dessa concentração para processos experimentais subsequentes.

Citometria de fluxo
Inicialmente, os HUVECs foram destacados com tripsina livre de EDTA de acordo com procedimentos padrão. De acordo com as diretrizes do fabricante para o Kit de Ensaio de Apoptose Annexin V-APC/PI, as suspensões de células foram centrifugadas a 1.000 x g por 5 minutos a 4 °C, após dissociação enzimática. As células em pellets foram então lavadas 2 vezes com PBS gelado sob condições idênticas e ressuspensas em 100 μL de tampão de ligação 1x. Cada amostra foi tratada com 5 μL de conjugado Annexin V-FITC e 5 μL de solução de coloração com iodeto propidiano (PI), seguida por uma incubação de 10 minutos no escuro, à temperatura ambiente (20-25 °C). Por fim, 400 μL de tampão de ligação 1x foram adicionados a todas as amostras, e a apoptose foi analisada em 1 hora usando um citometro de fluxo. Os eventos foram inicialmente bloqueados pelo FSC/SSC para excluir detritos. Para análise de apoptose, portas de quadrantes foram então aplicadas no gráfico Annexin V-FITC vs PI usando controles apropriados (não corados e controles de coloração única/compensação) para definir populações vivas (Annexin V^-/^PI-), apoptóticas precoces (Annexin V⁺/PI^-), apoptóticas tardias (Annexin V⁺/PI⁺) e necróticas (Annexin V^-/PI⁺). O mesmo modelo de portão e limites foram aplicados em todas as amostras.

Ensaio ELISA
As concentrações de fatores inflamatórios — fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-1β (IL-1β) — no supernadante de HUVECs cultivados foram medidas usando kits ELISA comercialmente disponíveis. Especificamente, foram usados o Kit ELISA TNF-α Humano, o Kit ELISA IL-6 Humano e o Kit ELISA IL-1β Humano conforme as instruções do fabricante. Para cada ensaio, 50 μL de sobrenadante de cultura celular não diluída eram carregados por poço. Curvas padrão foram geradas usando as diluições seriais fornecidas (TNF-α: 0-1000 pg/mL; IL-6: 0-500 pg/mL; IL-1β: 0-200 pg/mL). Após a amostra e a adição padrão, as placas foram incubadas a 37 °C por 90 minutos, seguidas por cinco lavagens com tampão de lavagem. O anticorpo de detecção conjugado com biotina foi então adicionado e incubado a 37 °C por 60 minutos. Após outra etapa de lavagem, estreptavidina-HRP foi adicionada e incubada a 37 °C por 30 minutos. Após uma lavagem final, o substrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionado e incubado a 37 °C no escuro por 15 minutos. A reação foi interrompida com solução de parada, e a absorvância foi imediatamente medida em 450 nm com comprimento de onda de referência de 630 nm. Cada amostra e padrão foi analisado em duplicado, e todos os experimentos incluíram três réplicas biológicas independentes. Os níveis de marcadores de estresse oxidativo — malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) — no sobrenadante foram avaliados usando o MDA ELISA Kit, SOD ELISA Kit e CAT ELISA Kit, respectivamente, seguindo os protocolos^{fornecidos 19, 20 e 21}. Para ensaios MDA e SOD, 40 μL de sobrenadante foram usados por poço sem diluição; para CAT, as amostras eram diluídas 1:10 com buffer de ensaio antes do carregamento. Curvas padrão foram preparadas de acordo com as especificações do kit (MDA: 0-60 nmol/mL; SOD: 0-100 U/mL; CATA: 0-100 U/mL). As etapas de incubação foram realizadas da seguinte forma: MDA - 60 min a 37 °C; SOD - 60 min a 37 °C; GATO - 30 min a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes entre as etapas principais da incubação. O desenvolvimento da cor foi alcançado adicionando os respectivos substratos e incubando a 37 °C (MDA: 15 min; Tempo de descanso: 20 min; CAT: 15 min). A absorção foi registrada em 450 nm para SOD e CAT, e em 532 nm para MDA. Todas as medições foram realizadas em poços duplicados e repetidas em três réplicas biológicas independentes.

Sequenciamento de RNA
O RNA total foi extraído dos HUVECs usando reagentes comerciais conforme as instruções do fabricante. A pureza e concentração de RNA foram avaliadas usando um espectrofotômetro medindo a absorvância em 260 nm e 280 nm (A260/A280), e a integridade do RNA foi avaliada com um bioanalisador. Apenas amostras de RNA com Número de Integridade de RNA (RIN) ≥ 7 foram usadas para preparação subsequente da biblioteca. O RNA ribossomal foi removido durante a preparação da biblioteca usando um procedimento padrão de depleção de rRNA realizado por uma empresa comercial. Quando indicado, o tratamento com RNase R foi aplicado antes da construção da biblioteca para digerir seletivamente RNAs lineares e enriquecer espécies circulares de RNA. A fragmentação de RNA foi então realizada sob condições de temperatura elevada, seguindo o protocolo padrão do manual do Kit de Preparação de Biblioteca de RNA para gerar fragmentos de RNA de tamanho adequado. As bibliotecas de sequenciamento foram preparadas usando o RNA Library Preparation Kit de acordo com as instruções do fabricante e sequenciadas em uma plataforma Illumina usando uma estratégia de sequenciamento de extremidades pareadas com comprimento de leitura de 150 bp (PE150). A profundidade do sequenciamento era suficiente para suportar a análise em todo o transcriptoma. As leituras de sequenciamento bruto foram processadas usando procedimentos padrão de controle de qualidade para remover sequências de adaptadores e leituras de baixa qualidade. Leituras limpas foram alinhadas ao genoma de referência humano, e os níveis de expressão gênica foram quantificados conforme^22,23. Genes diferencialmente expressos (DEGs) entre HUVECs com superexpressão circZBTB46 e HUVECs tratados com NC sob estimulação LPS foram identificados usando métodos estatísticos estabelecidos. A análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) foi realizada para identificar vias de sinalização associadas à superexpressão do circZBTB46. Os genes foram classificados com base na expressão diferencial entre grupos experimentais. Conjuntos de genes selecionados do Banco de Dados de Assinaturas Moleculares (MSigDB) foram usados para análise de enriquecimento. A significância do enriquecimento foi avaliada com base na pontuação normalizada de enriquecimento (NES) e na taxa de falsas descobertas (FDR), com FDR < 0,25 considerada estatisticamente significativa. O sequenciamento de circRNA e todas as análises bioinformáticas associadas foram terceirizados.

Identificação de DEGs
Para triar os DEGs, os níveis de expressão entre dois grupos distintos foram contrastados via o pacote de software DESeq (2012) R. Os limiares para significância estatística foram definidos como p < 0,05 com um |log2FC| valor superior a 0,58. O mapa de calor foi gerado pelo pacote Pheatmap R, e o gráfico do vulcão usou o pacote Goplot2 R para desenho.

Análise de enriquecimento funcional
Análises de enriquecimento GO e KEGG derivadas de transcrições lineares foram realizadas usando a plataforma online EnrichR, e o Bubble Chart foi desenhado com base no pacote GOplot R. O software GSEA foi utilizado, baseado na matriz de expressão e nos arquivos do conjunto de genes fornecidos pelo banco de dados MSigDB, com parâmetros de análise definidos (por exemplo, número de permutações e métodos estatísticos). O enriquecimento dos conjuntos de genes foi avaliado usando a pontuação de enriquecimento normalizado (NES), valor P e valor FDR, proporcionando uma exploração aprofundada das funções e potenciais mecanismos biológicos dos genes expressos diferencialmente.

Western blot
A proteína total foi extraída dos HUVECs (aproximadamente 1 x 10⁶ células) usando tampão de lise RIPA suplementado com inibidores de protease e fosfatase. A concentração de proteína foi determinada com um Kit de Quantificação de Proteínas BCA. Quantidades iguais de proteína (20 μg por pista) foram resolvidas por eletroforese em géis de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida a 10% (SDS-PAGE) a 80 V por 30 minutos, seguidos por 120 V por 60 minutos. Posteriormente, proteínas foram transferidas para membranas de polivinilideno fluoreto (PVDF) usando um sistema de transferência úmida a 100 V por 90 minutos a 4 °C. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado em soro sorológico tampão Tris-buffer, com 0,1% Tween-20 (TBST) por 1 hora em temperatura ambiente, seguida de incubação com anticorpos primários diluídos no mesmo tampão bloqueador (tipicamente 1:1000 para proteínas-alvo e 1:5000 para GAPDH) a 4 °C durante a noite. Os principais anticorpos utilizados foram os seguintes: ERBB2, p-AKT, AKT e GAPDH. Após a incubação, as membranas foram lavadas 3 vezes (10 min por lavagem) com TBST e depois incubadas com um anticorpo secundário IgG anti-coelho conjugado com peroxidase de raiz-forte (HRP) (1:5000 em buffer bloqueador) por 1h em temperatura ambiente. Após três lavagens adicionais de TBST (10 min cada), as bandas proteicas foram visualizadas usando um Kit de Substrato Western Blotting de Quimioluminescência Aprimorada (ECL) e imagens com um Sistema de Imagem. As intensidades das bandas foram quantificadas usando software.

Análise estatística
Avaliações estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism 10. Os dados são exibidos como meios ± erro padrão das médias (SEMs). Um valor-p < 0,05 foi definido para indicar significância estatística.

Resultados

Análise qRT-PCR da expressão circZBTB46 em um modelo in vitro SA-AKI
Esse conjunto de experimentos foi conduzido para testar a hipótese de que a expressão do circZBTB46 é alterada sob estimulação LPS e que a modulação do circZBTB46 afeta a viabilidade das células endoteliais e a apoptose em um modelo in vitro de SA-AKI. Inicialmente, a expressão de ci...

Discussão

Durante a sepse, padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), como LPS liberados por patógenos, ativam receptores semelhantes a Toll (por exemplo, TLR4), iniciando uma resposta inflamatória^{sistêmica 26}. Esse processo desencadeia a secreção de múltiplos mediadores pró-inflamatórios, como TNF-α, IL-6 e IL-1β, resultando em uma tempestade de^{citocinas 27}. Simultaneamente, o LPS danifica diretamente as células endoteliais vasculares, resu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AG-825 (Inibidor de ErbB2)	MedChemExpress	HY-10197	10 & mu; M de bloqueio de caminho
Bioanalisador Agilent 2100	Agilent	G2939BA	Integridade do RNA (RIN≥ 7)
Anticorpo AKT	Proteintech	60203-2-IG	WB (1:15000)
Kit de Apoptose Annexin V-APC/PI	Elabscience	E-CK-A327	Detecção de apoptose
Antibiótico-Antimicoótico	Gibco	15240062	Concentração de 1%
Kit de Quantificação de Proteínas BCA	Beyotime	P0012	Concentração de proteínas
CAT ELISA Kit	MEIMIANA	MM-0897H2	Enzima antioxidante
CCK-8 Kit	Dojindo	CK04	Ensaio de viabilidade celular
CircRNA seq	Fuzhou Huarong Kehui Biotechnology Co., Ltd.	PE150	Sequenciamento de circRNA e todas as análises bioinformáticas associadas
Citômetro de Fluxo CytoFLEX	Beckman Coulter	B53000	Análise de apoptose
DMEM	Gibco (Invitrogen)	11965092	Meio de cultura celular
Kit de Substrato ECL	Millipore	WBKLS0100	Detecção de proteínas
Anticorpo ERBB2	Sino Biological	100271-T32	WB (1:10000)
Soro Bovino Fetal (FBS)	Indústrias Biológicas	04-001-1ACS	Suplemento de 10% (v/v)
Anticorpo GAPDH	Proteintech	60004-1-IG	WB (1:50000)
HUVECs	Sistema Procell	CP-H082	Fonte da linhagem celular
IL-1 e beta; ELISA Kit	MEIMIANA	MM-0181H2	Fator inflamatório
IL-6 ELISA Kit	MEIMIANA	MM-0049H2	Fator inflamatório
Illumina NovaSeq 6000	Illumina	20012850	Sequenciamento de RNA
Lipofectamina 3000	Invitrogen	L3000008	Reagente de transfecção
LPS (E. coli O111:B4)	Sigma-Aldrich	L2630	10 & mu; g/mL para o modelo SA-AKI
MDA ELISA Kit	MEIMIANA	MM-2037H2	Marcador de estresse oxidativo
NanoDrop 2000	Thermo Fisher	ND-2000	Quantificação de RNA
Kit de Biblioteca de RNA NEBNext Ultra II	NEB	E7770S	Preparação da biblioteca RNA-seq
plasmídeo oe-circZBTB46	GenScript	Síntese personalizada	Vetor de superexpressão circZBTB46
Plasmídeo OE-NC	GenScript	Síntese personalizada	Vetor de controle negativo
Anticorpo p-AKT (Ser473)	Proteintech	66444-1-IG	WB (1:1200)
PrimeScript RT Reagent Kit	Takara	RR047A	Síntese de cDNA
Membranas PVDF	Millipore	IPVH00010	Transferência de Western blot
Sistema QuantStudio 5	Thermo Fisher	A28137	PCR em tempo real
Ribonuclease R	Lucigen	RNR07250	Remoção de rRNA
Buffer de Lise RIPA	Beyotime	P0013B	Extração de proteínas
RNAiso Plus	Takara	9109	Extração total de RNA
SOD ELISA Kit	MEIMIANA	MM-25469H2	Enzima antioxidante
TB Green Premix Ex Taq	Takara	RR420A	reagente qPCR
TNF-&alfa; ELISA Kit	MEIMIANA	MM-0122H2	Fator inflamatório