Modelagem da resistência à insulina de adipócitos usando fração vascular estromal derivada de tecido adiposo subcutâneo de camundongos

Resumo

Este estudo apresenta um protocolo experimental utilizando fração vascular estromal, derivada do tecido adiposo subcutâneo de camundongo, tratada com dexametasona para simular resistência à insulina. Ao reter a complexidade do tecido adiposo, oferece uma plataforma fisiologicamente autêntica para pesquisa mecanicista.

Resumo

A resistência à insulina no tecido adiposo é uma característica central de distúrbios metabólicos como o diabetes tipo 2, mas muitos modelos in vitro dependem de linhagens celulares imortalizadas que refletem incompletamente a complexidade celular do tecido adiposo nativo. O objetivo desse protocolo é estabelecer um método reprodutível e experimentalmente acessível para modelar a resistência à insulina de adipócitos usando adipócitos primários derivados da fração vascular estromal (SVF) do tecido adiposo subcutâneo de camundongo. O protocolo descreve o isolamento das células SVF por digestão enzimática, sua diferenciação adipogênica em adipócitos maduros carregados de lipídios e a subsequente indução da resistência à insulina usando dexametasona. A resistência à insulina é definida e validada operacionalmente por meio de leituras funcionais e moleculares, incluindo a redução da absorção e consumo de glicose estimulada por insulina, bem como a diminuição da fosforilação das principais proteínas sinalizadoras de insulina na via PI3K-AKT. Ao manter a heterogeneidade celular derivada de SVF, essa abordagem fornece um sistema baseado em células primárias que apoia a investigação da sinalização de insulina adipócita sob condições que se aproximam mais da fisiologia do tecido adiposo do que as linhas celulares convencionais. Este protocolo é destinado a pesquisadores que buscam uma plataforma padronizada para estudar mecanismos de resistência à insulina em adipócitos ou para avaliar intervenções metabólicas, reconhecendo que as leituras refletem respostas de uma cultura mista derivada de SVF, e não de uma população purificada de adipócitos.

Introdução

O diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) tornou-se uma das doenças metabólicas não transmissíveis que mais crescem no mundo, com um número total de pacientes agora ultrapassando 537 milhões e projetando que ultrapasse 783 milhões até 2045^. Suas características fisiopatológicas centrais se manifestam como resistência à insulina (RI) nos tecidos periféricos, acompanhada por disfunção progressiva das células^{β 2}. A essência da RI reside nos efeitos biológicos significativamente reduzidos desencadeados pela insulina fisiologicamente concentrada em órgãos-alvo, levando à redução da absorção de glicose, aumento da glicose hepática e inibição da^{lipólise prejudicada 3}. O tecido adiposo é um dos órgãos-alvo mais críticos da insulina. A obesidade faz com que as células adiposas se tornem insensíveis à insulina, reduzindo a captação de glicose, inibindo a síntese de triglicerídeos, enquanto simultaneamente aumenta a lipólise e libera mais ácidos graxos livres, agravando assim a resistência sistêmica à^{insulina 4,5}.

Em condições fisiológicas, a insulina ativa a via PI3K-AKT para translocar o transportador de glicose 4 (GLUT4) para a membrana celular, promovendo a captação de glicose e a síntese de triglicerídeos nos adipócitos. Simultaneamente, a insulina inibe a atividade da lipase triglicerídea adiposa (ATGL) e da lipase sensível a hormônios (HSL) na superfície das gotículas lipídicas, bloqueando assim a^{lipólise 6}. Quando ocorre a RI, a sinalização prejudicada da insulina enfraquece a inibição da lipólise, levando à liberação massiva de ácidos graxos livres (FFAs) na corrente sanguínea. Isso resulta em uma liberação massiva de FFAs na corrente sanguínea, causando deposição de triglicerídeos ectópicos em órgãos como fígado, músculo esquelético e pâncreas. Isso induz toxicidade nos lábios e inflamação crônica, contribuindo para o início e progressão do^{DT2 7}. Portanto, estabelecer um modelo maduro de adipócitos que reproduza as características da RI in vivo é crucial para elucidar os mecanismos moleculares da RI e desenvolver novas estratégias de intervenção.

Atualmente, a linhagem celular de fibroblastos embrionários de camundongos 3T3-L1 tornou-se uma ferramenta clássica para estudos in vitro de adipócitos RI devido ao seu curto ciclo de indução e boa reprodutibilidade ^8,9. No entanto, a origem embrionária das células 3T3-L1, seu fundo genético uniforme e a suscetibilidade à deriva fenotípica após passagem prolongada resultam em diferenças significativas no comportamento metabólico em comparação com adipócitos in situ adultos, limitando seu valor médico^{translacional 10,11}. Em contraste, a fração vascular estromal (SVF) isolada do tecido adiposo subcutâneo de roedor é rica em células-tronco adiposas multipotentes (ASCs). Adipócitos maduros diferenciados desses ASCs apresentam características morfológicas, funcionais e transcricionais que se assemelham mais às dos adipócitos brancos nativos do que a amplamente utilizada linhagem celular 3T3-L1. Isso faz dos adipócitos derivados de SVF um modelo complementar para estudar sinalização e resistência à insulina em um contexto que melhor aproxima a complexidade do tecido^{primário 12}.

Esse protocolo é mais adequado para pesquisadores que buscam estudar a ação da insulina em um modelo primário de adipócitos que retenha maior heterogeneidade tecidular do que as linhagens celulares imortalizadas. No entanto, os usuários devem observar que a SVF é uma população mista contendo células endoteliais e imunes; portanto, as leituras refletem o comportamento de uma cultura onde os adipócitos são um componente principal, mas não exclusivo. Esse modelo pode ser menos adequado para estudos que exigem uma população pura e sincronizada de adipócitos.

Este estudo propõe um protocolo para construir um modelo celular resistente à insulina usando adipócitos maduros derivados da SVF. O protocolo detalha todo o processo de isolamento, cultura, diferenciação e indução da resistência à insulina da SVF, imitando com sucesso o estado de resistência à insulina dos adipócitos in vivo. A avaliação do modelo será realizada nos níveis de consumo de glicose, morfologia celular e mecanismos moleculares. Isso fornece uma base técnica para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à resistência à insulina em adipócitos.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Médica de Xinjiang (Aprovação Ética nº: IAGUC-20240228-41).

1. Isolamento SVF

1. Animais experimentais: Use camundongos C57BL/6J com grau SPF de 4 a 6 semanas, pesando entre 9 e 11 g. Aloje-os a 22 ± 2 °C em um ciclo de 12 horas de luz e escuridão com acesso livre a comida e água.
2. Preparação estéril: Autoclave de todos os instrumentos e consumíveis a 121 °C por 30 minutos. Antes da experimentação, borrife o exaustor de fluxo laminar com etanol a 75% e irradie com luz UV por ≥15 minutos. Realize todos os procedimentos dentro de um gabinete de biossegurança Classe II. Use luvas e máscaras estéreis.
3. Colheita de tecido adiposo: Eutanasiar camundongos por inalação de dióxido de carbono seguida de luxação cervical. Imediatamente imerga em etanol 75% por 10 minutos para desinfecção da superfície. Usando tesoura oftálmica estéril, faça uma incisão circular ao longo da linha média do tórax e abdômen. Realize dissecação contundente para expor o tecido adiposo inguinal branco bilateral, localizado na parte interna da coxa e estendendo-se em direção à região testicular em formato de V. Remova cuidadosamente quaisquer linfonodos visíveis. Colete o tecido adiposo em PBS pré-resfriado e realize três enxágues rápidas.
4. Digestão de colagênase: Transferir imediatamente o tecido adiposo lavado para uma placa de cultura estéril e triturar em fragmentos de 1-2 mm³. Adicione 0,2% de colagênase tipo II (dissolvida no PBS da Dulbecco, pH 7,4, pré-aquecida a 37 °C) em volume 1,5 a 2x maior que o do tecido. Incube a 37 °C em um agitador de temperatura constante a 100 rpm por 10 minutos. Inverta suavemente a cada 3 minutos para evitar excesso de digestão.
5. Terminação e filtração: Ao concluir a digestão, adicione um volume igual de meio completo pré-aquecido (DMEM/F-12 + 10% FBS + 1% penicilina-estreptomicina) a 37 °C para terminar a reação. Pipete suavemente 5x-8x usando uma ponta de 1 mL. Filtre através de um filtro de células de 70 μm para remover fragmentos de tecido não digerido e adipócitos maduros.
6. Centrifugação e lavagem: Centrifuge o filtrado a 300 x g por 5 minutos a 25 °C. Descarte cuidadosamente o sobrenadante contendo adipócitos maduros. Ressuspenda o pellet em meio completo. Centrifuge novamente a 300 x g por 5 minutos a 25 °C. Repita essa etapa de lavagem duas vezes para remover colagenase residual e quaisquer adipócitos maduros restantes.
7. Semeadura e cultura: Ressuspenda o pellet final em 1 mL de meio completo. Semente, com uma densidade de 4 amostras de gordura inguinal de camundongos por recipiente de cultura celular de 10 cm. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂. Realize a primeira troca de meio após 24 horas para remover células não aderentes. Subsequentemente, troque o meio a cada 48 horas. Passe as células quando atingirem 80%-90% de confluência.
   NOTA: Não faça passagem nas células quando a confluência ultrapassa 90%, pois as células atingiram a inibição de contato e sua capacidade proliferativa está diminuída.

2. Preparação da solução de trabalho da colagenase tipo II

1. Reagentes e consumíveis: Obtenha colanase tipo II (atividade ≥ 120 U/mg); BSA (≥ livre de ácidos graxos 98%); HEPES; PBS de Dulbecco (contendo Ca²⁺ 1,8 mmol/L, Mg²⁺ 0,9 mmol/L), pH 7,2-7,4; Filtro estéril de baixa ligação proteica de 0,22 μm.
2. Preparação de solução de colagenase tipo II 0,2%: Pese 60 mg de pó de colagênase tipo II, 800 mg de BSA e 48 mg de HEPES em um tubo centrífugo de 50 mL. Dilua para 40 mL com o PBS da Dulbecco. Ajuste o pH para 7,4 ± 0,1 usando 1 M de NaOH ou HCl. Esterilize por filtração através de um filtro de 0,22 μm. Aliquota 5 mL por tubo e armazene a -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
3. Induz diferenciação quando as células atingem 100% de confluência após a passagem. O estado ótimo de diferenciação é indicado por células que apresentam uma morfologia semelhante a um vórtice. Use a solução de indução I nas primeiras 48 horas, depois mude para a solução de indução II (Tabela 1).
4. Confirme a diferenciação bem-sucedida pelos seguintes critérios: no quarto dia de indução, a coloração com vermelho óleo O revela acúmulo de gotículas lipídicas na maioria das células (aproximadamente 50%), acompanhada por um aumento estatisticamente significativo (p < 0,05) na expressão dos principais marcadores de adipogênese.

3. Estabelecimento do modelo de resistência à insulina

1. Selecione o quarto dia de diferenciação como ponto de partida para induzir resistência à insulina. Confirme ao microscópio que todas as células apresentam uma transição morfológica de fuso para arredondado, com o citoplasma da maioria das células preenchido com gotículas lipídicas de alto índice de refração.
2. Substitua o meio por meio de indução II contendo 1 μmol/L de Dex e continue a cultura por 48 horas (Tabela 1). Após esse procedimento, considere o modelo de adipócitos resistentes à insulina estabelecido. Note que essas células não apresentam outras alterações morfológicas. Use essas células diretamente para ensaios de captação/consumo de glicose e para a detecção de proteínas da via de sinalização da insulina.
3. Critérios para o estabelecimento bem-sucedido do modelo de resistência à insulina: Após 48 horas de tratamento com dexametasona, confirme que a capacidade de captação de glicose na maioria das células estimuladas com insulina de 100 nM diminui aproximadamente 40%. Além disso, confirme uma redução estatisticamente significativa (p < 0,05) nos níveis de fosforilação das principais proteínas da via de sinalização da insulina.
   NOTA: Este processo requer a adição contínua do meio de manutenção por indução II.

4. Detecção de glicose residual em supernadante em cultura

1. Colete supernadantes de cultura celular no momento designado. Remova as células por centrifugação a 4 °C e 300 x g por 5 minutos.
2. Meça as concentrações de glicose nos supernadantes usando o kit de ensaio GOD-POD (glucose oxidase-peroxidase). Calcule as concentrações usando a fórmula:
   Concentração de glicose (mmol/L) = (A_(amostra) - _{A(em branco))} / (A_(padrão) - _{A(em branco)}) * C_(padrão)
   Consumo de glicose (mmol/L) = Concentração de glicose em meio livre de células (mmol/L) - Concentração de glicose no supernadante celular (mmol/L)
   Consumo Normalizado de Glicose (mmol/mg de proteína) = Consumo de Glicose Bruta (mmol/L) / Concentração Total de Proteína Celular (mg/L)

5. Western blot

1. Estimule as células no ponto de tempo designado com insulina de 100 nM em meio completo por 10 minutos a 37 °C para ativar a via PI3K-AKT. Subsequentemente, adicione 200 μL de tampão de lise celular a cada prato de cultura celular de 3,5 cm. Incube no gelo por 30 minutos. Centrifuge a 13.040 x g por 10 minutos a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Quantifique a concentração de proteína usando a solução de trabalho BCA.
2. Coloque as amostras em um gel SDS-PAGE de 8%. Faça o gel funcionar a 80 V até as amostras chegarem à interface de gel de empilhamento/separação. Aumente a voltagem para 120 V e continue até que as bandas marcadoras estejam totalmente resolvidas. Realize a transferência com corrente constante de 200 mA por 2 horas.
3. Incube a membrana em temperatura ambiente com leite desnatado a 5% ou BSA por 2 horas para bloqueio. Lave a membrana 3 vezes com TBST. Subsequentemente, incube com anticorpos primários durante a noite a 4 °C. Anticorpos primários (Diluição): AKT: 1:1000, p-AKT (Ser473): 1:1000, β-Actina: 1:1000, PI3K p110α: 1:1000, Phospho-PI3K p110: 1:1000, C/EBPα: 1:2000, FABP4: 1:2000.
4. Lave a membrana 3 vezes com TBST. Subsequentemente, incubar com anticorpo secundário conjugado com HRP em temperatura ambiente por 1 hora. Anticorpos secundários (Diluição): IgG-HRP anti-camundongo: 1:5000, IgG-HRP anti-coelho de cabra: 1:5000.
5. Detecte o sinal usando quimioluminescência ECL. Visualize e registre os resultados experimentais usando um imageador Western Blot.
6. Analise os valores em tons de cinza das bandas resultantes usando o software ImageJ.

6. Ensaio de coloração por absorção de glicose

1. Prive as células separadamente nos dois pontos de tempo especificados por 12 horas usando RPMI 1640 contendo 1% de FBS para eliminar interferências da glicose basal.
2. Após 10 minutos de estimulação com insulina de 100 nM, adicione 1 mL de solução 1x 2-NBDG em cada poço. Incube a placa a 37 °C por 1 hora, protegida da luz.
3. Lave as células 2 a 3 vezes. Adicione 1 mL de solução de coloração Hoechst pronta para uso em cada poço. Incube a placa a 37 °C no escuro por 10 minutos. Adicione a solução de coloração lentamente ao longo da parede lateral do vaso de cultura, evitando contato direto com a camada celular para evitar o descolamento das células.
4. Lave as células 2 a 3 vezes, depois adicione PBS. Capture imagens fluorescentes das células usando um microscópio de fluorescência invertida.
5. Realize uma análise quantitativa das imagens usando o software ImageJ. Use o ImageJ para separar cada canal, isolando o sinal de absorção de glicose (canal verde) do sinal de fluorescência nuclear (canal azul).
6. Converta todas as imagens em imagens em tons de cinza de 8 bits. Aplique o algoritmo de threshold automático padrão para definir regiões de sinal positivo.
7. Meça a intensidade média de fluorescência dentro dessas regiões designadas. Normalize o sinal de fluorescência de absorção de glicose dividindo a intensidade média de fluorescência do canal verde pela intensidade média correspondente do canal azul.

7. Mancha O de vermelho óleo

1. Dilua a solução de estoque de óleo vermelho com água sem RNase em uma proporção de 3:2. Filtre a solução sequencialmente através de papel de filtro e um filtro de 0,22 μm para preparar a solução de trabalho.
2. Aspire o meio de cultura celular e lave suavemente as células duas vezes com PBS. Adicione 4% de paraformaldeído a cada poço e fixe as células em temperatura ambiente por 30 minutos.
3. Adicione o fixador e lave as células com água duplamente destilada. Adicione 1 mL de solução de trabalho Oil Red O em cada poço. Incube a placa em temperatura ambiente no escuro por 25 minutos.
4. Após a coloração, aspire a solução de tingimento. Lave bem as células com água destilada para remover artefatos de fundo e manchas. Adicione 1 mL de água destilada para cobrir as células. Capture imediatamente imagens de campo claro usando um microscópio invertido.

8. BONECO

1. Dilua a solução original do BODIPY com água estéril em uma proporção de volume 1:200 para preparar a solução de trabalho.
2. Lave as coberturas das células com PBS estéril. Adicione 30 μL de solução de paraformaldeído a 4% em cada capa e fixe em temperatura ambiente por 30 minutos.
3. Aspire o fixador e lave 3 vezes com PBS. Adicione 30 μL de solução de trabalho BODIPY a cada cobertura de célula. Incube em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos.
4. Lave as capas 3 vezes com PBS. Adicione 30 μL de verniz DAPI a cada capa de cobertura. Incube em temperatura ambiente no escuro por 10 minutos para marcar os núcleos celulares.
5. Lave as capas mais três vezes com PBS. Prossiga com a montagem: Adicione 10 μL de meio de montagem anti-descolorimento sobre uma lâmina limpa do microscópio. Usando pinças, inverta suavemente o revestimento celular (lado da célula para baixo) sobre o meio de montagem. Deixe o suporte secar no escuro.
6. Capture imediatamente imagens usando um microscópio confocal de varredura a laser.

9. Análise estatística

1. Cada experimento incluiu três réplicas biológicas. Analise dados usando o software GraphPad Prism 10.0. Apresentar dados quantitativos, atendendo aos critérios para distribuição normal como média ± desvio padrão (média ± SD). Para dois grupos que satisfazem normalidade e homogeneidade de variância, aplice-se o teste t das amostras independentes. Para múltiplos grupos, realize ANOVA unidirecional, p < 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

10. Segurança e descarte de resíduos

1. Manuseio de tecidos animais
   1. Realize todos os procedimentos envolvendo células primárias em um gabinete de biossegurança Classe II sob condições estéreis.
   2. Classifique todos os resíduos de tecido animal, órgãos não utilizados e consumíveis contaminados como resíduos bio-perigosos. Coloque esses resíduos em sacos biohazard designados, processe por autoclave e, finalmente, descarte.
2. Manuseio da Dexametasona
   1. Use luvas, máscaras médicas e jalecos ao pesar pó de Destreza. Realize a preparação da solução dentro de uma exaustão química.
   2. Colete os resíduos contaminados com Dex separadamente e descarte-os como resíduos químicos.
3. Manuseio de materiais bio-perigosos
   1. Desinfete minuciosamente as superfícies de trabalho e o interior dos armários de biossegurança com 70% de etanol antes que os procedimentos experimentais possam começar.
   2. Certifique-se de que todos os resíduos líquidos gerados pela cultura celular sejam autoclavados para torná-los não infecciosos antes do descarte.

Resultados

Células SVF isoladas do iWAT de camundongos C57BL/6J apresentaram suspensão pontuada na semeadura inicial em placas de cultura. Aproximadamente 40% das células completaram a fixação primária após 18 horas de semeadura; no quinto dia após a semeadura, as células estavam totalmente espalhadas, com confluência atingindo 95% (Figuras 1A,B). Quando as células atingiam a confluência e apresentavam uma disposição característica semelhante a um vórtice, o meio de diferenciação era s...

Discussão

Pesquisas extensas indicam que modelos baseados em células de SVF oferecem valor único na simulação de características patológicas do tecido adiposo. No entanto, o longo ciclo de construção desses modelos, que normalmente requer aproximadamente 14 dias para isolamento de tecido, cultura primária, diferenciação induzida e tratamento com Dex, representa desafios para a continuidade experimental e a estabilidade do estado celular. Para enfrentar esses desafios, este estudo adotou e otimizou...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,22 & mu; Filtro M	Biosharp	BSF-XS-0232-01
2-NBDG	Beyotime	S0561M
3-Isobutil-1-metilxantina	Sigma	15879
4% de poliformaldeído	Biosharp	BL1278A
70 & mu; Filtro de células M	Biosharp	BS-70-CS
Anti-AKT	Proteintech	10175
Anti-C/EBPα	Abclone	AB40764
Anti-FABP4	Tecnologia de Sinalização Celular	ANOS 2120
Anti-pAKT (Ser473)	Proteintech	28731
Anti-PI3K	Bioss	10657R
Anti-pPI3K (p110)	Bioss	6417R
Anti-β-ACTIN	Proteintech	60008
Kit de Ensaio de Proteína BCA	Thermo Fisher	23225
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
BSA	Sigma	A7030
Fatias de escalada celular Biosharp & nbsp;	Biosharp	BS-14-RC
Prato de Cultura Celular, 100mm x 20mm	Corning	430167
Prato de Cultura Celular, 35mm x 10mm	Corning	430165
Solução DAPI	Solarbio	28718-90-3
Dexametasona	Sigma	D2915
DMEM/F-12	Gibco	C11330500BT
Dulbecco' s PBS	Cytiva	SH30264.02
Tubo de Eppendorf	Corning	MCT-175-C
FBS	Life-iLab	AC03L0555
Microscópio de fluorescência	Leica	DMi8
Glicose oxidase-peroxidase	Nanjing Jiancheng	F006-1-1
IgG-HRP anti-camundongo	Beijing Zhongshan Jinqiao	ZB-2305
IgG-HRP anti-coelho de bode	Beijing Zhongshan Jinqiao	ZB-2301
GraphPad Prisma	Versão 10.0.0	/
Hepes	BioFroxx	1112GR025
Hochest	biosharp	BL803A
ImageJ	Versão 1.54p	/
Insulina	Solarbio	18040
Microscópio confocal de varredura a laser	Nikon	Ti-E
Antidesbotamento do Meio de Montagem	Solarbio	S2100
Solução de coloração de O. vermelho óleo	Sigma	O0625-25G
Penicilina-Estreptomicina	hyclone	SV30010
RIPA Buffer	Thermo Fisher	89901
Rosiglitazone	Sigma	R2408
RPMI 1640	VivaCell	C3010-0500
Leite em Pó Desnatado	BioFroxx	1132GR500
TBS Buffer	Solarbio	T1060
Colagénase tipo II	Sigma	C6885