Quantificação por PCR em tempo real do DNA bacteriano do complexo vermelho e status periodontal em portadores removíveis de próteses parciais

Resumo

A reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) foi usada para quantificar o DNA de bactérias do complexo vermelho em portadores removíveis de dentaduras parciais (DPR). Este estudo promete uma abordagem inovadora para futuras estratégias de tratamento com próteses implantais para esses pacientes, considerando o papel dessas bactérias no desenvolvimento da periimplantite.

Resumo

A inserção de dentaduras parciais removíveis (DPR) na cavidade oral está associada a alterações na microflora oral ao longo do tempo. No entanto, há escassez de literatura que examine a presença de bactérias do complexo vermelho (CCR) nesses pacientes. Dado o papel estabelecido da RCB no desenvolvimento de periodontite, peri-implantite e várias doenças sistêmicas, investigar o impacto das DPR nessas bactérias é crucial. Este estudo tem como objetivo quantificar a carga subgingival dos dentes de pilar de RCB-Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola-in em pacientes parcialmente edêtulos reabilitados com DPR, utilizando reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR). Um objetivo secundário foi avaliar o status periodontal dos dentes de pilares e não pilares e determinar as correlações entre a carga microbiana e os índices periodontais clínicos.

Trinta participantes que necessitavam de RPDs foram inscritos. O ácido desoxirribonucleico (DNA) foi isolado de amostras bacterianas obtidas dos dentes do pilar antes (T0) e 3 meses após a inserção (T3). A quantificação do RCB foi realizada via RT-PCR e expressa como "Lg (equivalentes genômicos/amostra)". Parâmetros clínicos — índice de placa (PI), índice gengival (IG), profundidade de sondagem (PD) e mobilidade dentária (TM) — foram registrados para dentes de abutamento e não abutement em ambos os momentos.

Os dentes do pilar demonstraram aumentos estatisticamente significativos nas cargas de RCB em todas as três espécies-alvo de T0 a T3: P. gingivalis (1,99 ± 2,01 vs 3,64 ± 2,21, p = 0,00003), T. forsythia (2,20 ± 2,17 vs 3,56 ± 2,33, p = 0,00009) e T. denticola (0,82 ± 1,41 vs 2,35 ± 2,21, p = 0,0001). Embora os parâmetros periodontales tenham sido elevados nos dentes com pilar versus dentes sem pilar após o tratamento, as diferenças não alcançaram significância estatística. Entre os patógenos, T. forsythia apresentou a correlação positiva mais forte com os índices periodontais.

O uso curto prazo de DPR está associado a um aumento significativo na colonização por RCB nos dentes do pilar, sugerindo mudanças microbianas e inflamatórias precoces que podem preceder a degradação periodontal clinicamente evidente.

Introdução

A cavidade oral possui um microbioma dinâmico cujo equilíbrio ecológico é fundamental para manter a saúde^{periodontal 1}. A perturbação dessa homeostase microbiana, devido a fatores endógenos e exógenos, pode desestabilizar a homeostase microbiana, criando condições favoráveis para o crescimento de bactérias patogênicas, incluindo patógenos periodontales como Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola, coletivamente denominadas bactérias do complexo vermelho (RCB⁾². Esses patógenos são fundamentais na patogênese da periodontite e da periimplantite, atuando sinergicamente para evadir as defesas do hospedeiro, promover inflamação e facilitar a destruição dos tecidos periodontais, frequentemente levando à perda de dentes ^3,4. A perda de dentes afeta negativamente a capacidade de comer e falar, contribuindo para uma diminuição da sensação de confiança e bem-estar, aumentando assim a necessidade de compensação protética. Entre os métodos mais comuns empregados, especialmente na população idosa devido a diversas condições locais e gerais, está o tratamento protético com dentaduras parciais removíveis (DPR). No entanto, com o tempo, as^{RPDs 5} podem levar a uma variedade de problemas.

Evidências sólidas sugerem que o uso de DPRs pode resultar no acúmulo de placa dentária e no desenvolvimento de inflamação dos tecidos gengivais e periodontais, especialmente envolvendo dentes do pilar 6,7,8,9,10. No entanto, a ocorrência desses distúrbios orais também depende do compromisso do paciente com a higiene bucal, bem como do cuidado e manutenção da dentadura 11,12,13,14. Bassi et al. enfatizaram em sua pesquisa a importância de controlar a placa dentária. Eles examinaram pacientes que usaram DPR por um período de 6 a 12 anos e descobriram que a condição periodontal dos dentes de pilar era semelhante à dos dentes sem pilar em casos com higiene bucal regular. Em contraste, a condição periodontal piorou no grupo de pacientes que não deram importância ao acompanhamento e manutenção da higiene^{bucal 13}.

Apesar das vantagens funcionais das DPR, sua inserção na cavidade oral dificulta o fluxo livre da saliva, predispondo a formação de uma camada de película na superfície da prótese que pode levar à colonização bacteriana. Diferentes tipos de bactérias nocivas foram identificados em pacientes com^{TPPR 15}. Estudos recentes mostraram que os níveis de patógenos que causam infecções associados à cárie dentária, como Streptococcus^{mutans 16}, assim como os de Staphylococcus aureus¹⁷, podem aumentar significativamente após a colocação das dentaduras. Além de funcionar como indicador do estado da mucosa oral, alterações no nível de bactérias resultantes do uso de DPR também podem levar ao desenvolvimento de doenças dentárias nos dentes^{restantes 18}. Assim, se os pacientes não mantiverem suas DPR adequadamente, condições anaeróbicas podem ser criadas sob a base da dentadura, o que pode resultar no crescimento excessivo de bactérias patogênicas. Certos tipos de patógenos periodontais podem entrar na circulação sanguínea geral pela porta orofaríngea, representando um fator de risco considerável para o desenvolvimento de várias doenças sistêmicas^.

No entanto, ainda há escassez de estudos sobre alterações microbiológicas no sulco gengival dos dentes do pilar em pacientes com^DPR 21,22,23,24. Entre os poucos estudos sobre esse assunto, foram utilizados métodos convencionais para a detecção de patógenos periodontais, incluindo o teste BANA-ZymeTM e o método de cultura. Considerando que a maioria dos patógenos periodontais são anaeróbios facultativos, o uso desses métodos pode resultar em dificuldades em seu cultivo, já que, nesse contexto, condições de alta intensidade redutora e para as quais o oxigênio é tóxico são^{necessárias 25}. Além disso, a literatura odontológica disponível ainda não abordou satisfatoriamente a relação entre tais patógenos e os diferentes índices periodontales sob essa perspectiva.

Portanto, para superar as limitações da cultura microbiana convencional e melhorar a precisão diagnóstica, este estudo utilizou a reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) para quantificar as cargas bacterianas do complexo vermelho (RCB) nos dentes do pilar de usuários de RPD. Paralelamente, o status periodontal tanto dos dentes do pilar quanto dos não pilares foi avaliado usando índices clínicos padronizados. O estudo investigou ainda correlações entre a carga bacteriana e os parâmetros periodontais para elucidar melhor a interação biológica entre o uso de próteses e a disbiose microbiana.

Protocolo

Este estudo incluiu 30 pacientes parcialmente edêtulos que buscaram cuidados prostodontistas na Clínica de Próteses Dentárias, Centro Clínico de Odontologia Universitária do Kosovo, entre setembro de 2021 e março de 2022. A aprovação ética foi obtida do conselho de revisão institucional (Aprovação nº 378/19), e todos os procedimentos seguiram os princípios da Declaração de Helsinque. Foi obtido consentimento informado por escrito de todos os participantes.

O tamanho da amostra foi determinado com base em pesquisas anteriores, que indicam que de 11 a 30 participantes são suficientes para obter resultados significativos em parâmetros microbianos e periodontais entre usuários de^{DPR 21,23}. Assumindo um teste t pareado de duas caudas com nível alfa de 0,05, a análise de potência indicou que um tamanho de amostra de 28 participantes forneceria 80% de potência para detectar uma diferença estatisticamente significativa dessa magnitude. Para considerar possíveis desistências, inscrevemos 30 participantes. Além disso, um período de acompanhamento de três meses foi suficiente para observar um aumento da carga bacteriana nesses^{pacientes 24}.

Pacientes elegíveis eram usuários de próteses pela primeira vez, apresentando dentição natural tanto adjacente quanto antagônica. Os critérios de exclusão incluíam: profundidades de sondagem >4mm, estado imunocomprometido (por exemplo, quimioterapia), uso de antibióticos nos últimos 90 dias, tabagismo excessivo (>25 cigarros/dia) e comprometimento cognitivo que dificulta a compreensão dos procedimentos de DPR.

Todos os participantes receberam DPR com fecho retido fabricados com uma estrutura metálica de cobalto-cromo e resina acrílica (polimetil metacrilato). O projeto de cada RPD foi personalizado com base na classificação de edentulismo, qualidade da dorsal residual e considerações biomecânicas.

Procedimento de coleta de amostras

A coleta de amostras foi realizada exclusivamente nos dentes do pilar de dentaduras parciais removíveis (DPR) entre os pontos de tempo T0 e T3. Os participantes foram inicialmente solicitados a fazer gargarejos minuciosos com água para eliminar quaisquer resíduos de comida. Antes da coleta da amostra, o dente do pilar selecionado foi isolado usando rolos de algodão para manter um ambiente de trabalho seco. Dois pontos de papel estéreis (nº 35; 04 afilados) foram inseridos no sulco gengival nas partes mesial e distal da superfície bucal do dente e deixados no lugar por 1 minuto. As pontas de papel eram então transferidas para um microtubo estéril contendo 1,5 mL de solução salina normal e transportadas para um laboratório microbiológico designado. As amostras eram armazenadas a -20°C até o processo de isolamento do DNA.

Preparação e amplificação do DNA bacteriano:

O teste de parodontoscreen (Tabela de Materiais) foi empregado para identificar T. denticola, T. forsythia e P. gingivalis usando^{RT-PCR 26}. O teste consiste em: preparação de DNA; amplificação por PCR em tempo real usando reagentes específicos (uma mistura para amplificação bacteriana universal, uma mistura para amplificação bacteriana oportunista e uma mistura para amplificação genômica de DNA humano); e a gravação e interpretação dos resultados da amplificação.

A extração de DNA foi realizada usando um kit de extração de DNA (Tabela de Materiais), seguindo as diretrizes do fabricante para garantir a qualidade ideal do DNA. O teste utiliza análise qualitativa de PCR em tempo real com uma mistura de PCR selada com parafina. Essa mistura inclui um Controle Interno para verificar a validade da rodagem de PCR e um Controle de Ingestão de Amostras (SIC) para avaliar a qualidade da extração e confirmar DNA suficiente para amplificação precisa.

A amplificação por PCR foi realizada usando tiras e tampas especializadas, com reagentes incluindo solução de Taq-polimerase, mistura mestra sob camada de parafina, amostra de DNA e óleo mineral. O programa de PCR é o seguinte: (i) desnaturação inicial a 80 °C por 30 s, (ii) desnaturação a 94 °C por 1 min 30 s, (iii) 5 ciclos de 30 s a 94 °C (desnaturação), 15 s a 64 °C (ligação e alongamento do primer (detecção de fluorescência), (iv) 45 ciclos de 10 s a 94 °C (desnaturação), 15 s a 64°C (ligação e alongamento do primer, detecção de fluorescência), (v) 5 s a 94 °C (desnaturação final).

A detecção de fluorescência foi realizada nos canais de detecção Fam e Hex, exceto no tubo nº5, que continha o marcador (onde a fluorescência foi detectada nos canais Fam e Rox). O processo de amplificação foi realizado usando cicladores térmicos em tempo real (Tabela de Materiais). O Software RealTime para o instrumento (versão 7.9) foi usado para o registro automático, interpretação e análise quantitativa dos dados de amplificação da PCR, permitindo uma estimativa precisa da carga de patógenos.

As cargas microbianas foram representadas como "Lg (equivalentes genômicos/amostra)". Os resultados foram apresentados em três faixas no laudo do teste Parodontoscreen para cada paciente, baseados nos níveis de carga bacteriana da seguinte forma: P. gingivalis (normal <5,0; moderado ≥5,0; grave >6,0); T. forsythia (normal <5,0; moderada ≥5,0; grave >5,5); e T. denticola (normal <3,5; moderado ≥3,5; grave >5,0).

Exame clínico

O exame clínico incluiu um exame detalhado da condição periodontal dos dentes de pilar e não pilares em T0 e T3. O índice de placa (PI) foi avaliado usando uma sonda dentária de acordo com os critérios de Silness-Loe (0-3)²⁷. A condição gengival foi avaliada em seis pontos da superfície do dente usando o índice gengival (IG) segundo os seguintes critérios: 0, sem inflamação; 1, inflamação leve; 2, inflamação com sangramento gengival durante a sondagem; 3, inflamação severa com possível sangramento gengival^{espontâneo 28}.

A profundidade de sondagem (PD) foi medida usando a sonda Williams desde a margem gengival até o final da profundidade do bolso^{clínico 29}. A mobilidade dentária (TM) foi determinada pela palpação bimanual nas direções horizontal e vertical, de acordo com o critério³⁰ de Miller.

Todos os participantes do estudo receberam tratamento periodontal não cirúrgico adequado antes do exame clínico, incluindo remoção da placa dentária e do cálculo por meio de raspagem ultrasônica. Os participantes também foram instruídos em procedimentos de higiene bucal, como escovar os dentes e limpar dentaduras, além de receber orientações sobre como remover dentaduras à noite.

Análise estatística

Os dados foram analisados usando Microsoft Excel e IBM SPSS Statistics for Windows. Estatísticas descritivas (média, desvio padrão e intervalo) foram calculadas para idade, cargas microbianas e índices periodontais, incluindo PI, GI, DP e TM. Alterações nos parâmetros clínicos e microbiológicos entre antes (T0) e 3 meses após a inserção (T3) foram avaliadas usando o teste de Wilcoxon signed-rank para dados não paramétricos pareados. O teste exato de Fisher (simulação de Monte Carlo, bilateral) foi usado para avaliar dados categóricos relacionados à classificação de carga microbiana. O coeficiente de correlação de rank (ρ) de Spearman foi empregado para avaliar associações entre cargas microbianas e parâmetros periodontais. Um valor p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo para todas as análises.

Resultados

Demografia dos participantes

A Tabela 1 apresenta a distribuição dos parâmetros demográficos. Entre os 30 participantes, 16 eram homens (53,3%) e 14 eram mulheres (46,7%). A idade média dos participantes era de 64,6 anos, com variação de 48 a 76 anos. Detalhes adicionais sobre a demografia social são fornecidos na Tabela 1.

Exame clínico

A Tabela 2 mostra...

Discussão

Manter uma higiene bucal ideal torna-se cada vez mais desafiador com a idade, devido à diminuição da resposta imunológica e às limitações mecânicas impostas por próteses, como os DPR com fecho retido. Essas condições favorecem o acúmulo de biofilmes patogênicos, especialmente ao redor dos dentes do pilar, que atuam como estruturas críticas de suporte, mas também são vulneráveis à deterioração periodontal. Este estudo buscou abordar essas preocupações quantificando as cargas de bactérias ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com trava de segurança	Biotek	MT1.5/100
Pinça Dentária	Bader	17/4021-1
Cicladores Térmicos DTprime em Tempo Real	DNA-Tecnologia		Cicladores Térmicos em Tempo Real
IBM SPSS	IBM Corp	Versão 21.0
Microsoft Excel	Microsoft Office 2010
Pontos em papel (nº 35; 04 afilados)	DiaDent	MP210-602
Kit de Detecção de PCR em Tempo Real ParodontoScreen	DNA-Tecnologia	R1-P808-S3/5EU
Sonda periodontal	MEDESY	548/9PT
PREP-GS PLUS	DNA-Tecnologia	P-003/2EU	Kit de extração de DNA & nbsp;
Software em tempo real	DNA-Tecnologia	Versão 7.9
Cloreto de sódio 0,9%	VIOSER