Artigo de método

Uma plataforma inovadora para alongamento celular in vitro e imagem

DOI:

10.3791/69779

⸱

10 de março de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um dispositivo inovador que aplica formas de onda de deformação isotrópicas e uniaxiais às células, enquanto apoia o cultivo em substratos com rigidez sintonizável e matrizes proteicas personalizáveis. Essa plataforma simples e econômica permite que pesquisadores investiguem como pistas mecânicas regulam a função celular tanto em estudos fundamentais quanto em contextos relevantes para doenças.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células respondem a sinais mecânicos do ambiente, como alterações na rigidez da matriz extracelular (ECM) e na tensão cíclica, que regulam processos celulares como determinação do destino celular, comunicação intercelular e desenvolvimento. Alterações nessas forças contribuem para a progressão da doença ou impulsionam a progressão de doenças em condições como asma, hipertensão e câncer. Embora dispositivos existentes de alongamento in vitro possam impor deformações uniaxiais ou isotrópicas, eles frequentemente utilizam rigidez não fisiológica, limitam imagens em tempo real ou não conseguem alcançar altas amplitudes de deformação relevantes para condições fisiológicas e patológicas. Aqui, apresentamos um dispositivo compacto compatível com microscópio que aplica tensão isotrópica ou uniaxial controlada a células aderentes em pratos de cultura elastomérica. Esses pratos possuem um módulo de Young ajustável e são compatíveis com uma variedade de revestimentos de matriz proteica para adesão celular, permitindo modulação independente da rigidez do substrato e da composição da ECM. Importante, a facilidade de operação do dispositivo é facilitada pelo seu design movido por motor de passo, que suporta a geração de formas de onda cíclicas programáveis. Demonstramos a capacidade do dispositivo quantificando a dinâmica intracelular do cálcio e as forças de tração celular em células musculares lisas das vias aéreas humanas primárias sob estiramento mecânico. Esta plataforma oferece uma ferramenta versátil para investigar o efeito de sinais mecânicos na função celular tanto em contextos saudáveis quanto relevantes para doenças.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células experimentam forças mecânicas do ambiente ao seu redor que desempenham um papel crítico na regulação de muitos aspectos da função celular, incluindo a determinação do destino celular 1,2, comunicação intercelular 3,4 e crescimento saudável 2,5. Além disso, mudanças nessas forças mecânicas podem levar ao aumento da progressão da doença e início da doença, incluindo a remodelação da matriz extracelular(ECM) 6 e o crescimentotumoral 7,8,9,10. As células podem perceber e responder a esses sinais mecânicos, que incluem mudanças na rigidez daECM-4, bem como a tensão cíclica em órgãos como coração, pulmões emúsculos 11,12. Estudos in vitro demonstraram que a rigidez e a composição da MCE podem influenciar a rigidez do citoesqueleto celular, tanto em repouso quanto após exposição a agonistascontráteis 13. Numerosos estudos in vitro e in situ examinaram como cepas transitórias, estáticas e cíclicas afetam células e tecidos, mostrando que as respostas variam com base no tipo, taxa e amplitude dacepa 14. Por exemplo, estudos recentes descobriram que um estiramento temporário reduz a rigidez das células aderentes em proporção à tensão aplicada, em que um aumento sustentado da deformação resulta em um aumento inicial rápido da rigidez, seguido por um relaxamento gradual15. Além disso, a sinalização de cálcio, o principal regulador molecular da geração de forças, é impactada por estiramento e outras forçasmecânicas 4,16,17,18,19,20. Estudar como rigidez e tensão influenciam as vias mecanobiológicas requer modular ambos os fatores enquanto monitora as respostas celulares. Portanto, desenvolvemos um novo extensor celular compatível com microscópio, capaz de induzir estiramento isotrópico ou uniaxial, com controle independente sobre rigidez do substrato, revestimento de matriz proteica e uma variedade de formas de onda programáveis.

No passado, pesquisadores também criaram dispositivos para impor movimentos específicos e alongamentos mecânicos em culturas celulares etecidos 21,22. O caso mais simples, movimento uniaxial, é um alongamento mecânico imposto a uma única dimensão. Por exemplo, alguns dispositivos foram desenvolvidos para impor estiramento e tensão mecânicas nas tiras de tecido23 e fibras de colágeno24, ou para alinhar a orientação celular e induzir a migraçãocelular 25. Estiramento isotrópico refere-se a um tipo de alongamento no qual uma força igual é aplicada a um gel ou substrato de todas as direções, resultando em uma tensão uniforme no material. Esse estiramento simula a distribuição uniforme da força que as células experimentam em certos ambientes fisiológicos, como dentro dos alvéolos dos pulmões, onde as células são submetidas à expansão e contração radial durante o processorespiratório 26,27.

Os dispositivos de maca existentes apresentam várias limitações que limitam seu uso em pesquisas relacionadas à mecanobiologia. Muitos projetos utilizam valores de rigidez do substrato que excedem a faixa fisiológica típica para suportar esforço mecânico e suportar o peso do meio de culturacelular 28. No entanto, o uso dessa rigidez não fisiológica também pode afetar o comportamento celular, limitando potencialmente a relevância do modelo para ambientes de tecidonatural 29. Além disso, alguns projetos de macas obstruem o objetivo ou o caminho da luz, impedindo a imagem, enquanto outros usam membranas muito espessas para observaçãoclara 28. Mesmo quando os esticadores são compatíveis com microscópios e usam substratos finos, problemas como afundamento da membrana e perda de foco são comuns. Plataformas comerciais como a Flexcell utilizam deformação baseada em vácuo para esticar membranas flexíveis. Embora essa abordagem possa gerar campos de deformação estáveis e homogêneos, ela não é otimizada para microscopia de células vivas, e configurações compatíveis com microscópio exigem acessórios adicionais caros. Além disso, essas plataformas podem atingir uma cepa máxima de apenas 21,8%30, enquanto inspirações profundas podem produzir cepas superiores a 30%, com cepas ainda maiores observadas em doenças como asma eDPOC 31.

Portanto, projetamos um novo dispositivo de estiramento celular que permite o controle preciso do material sobre rigidez do substrato e composição da MEC, ao mesmo tempo em que possibilita a aplicação de deformações isotrópicas e uniaxiais variáveis às células aderentes. Esta plataforma é bem adequada para pesquisadores que investigam questões mecanobiológicas que exigem imagens ao vivo durante estimulação mecânica com substratos com rigidez fisiologicamente relevante. O dispositivo utiliza uma abordagem mecanicamente acionada inspirada na geometria de uma esfera de Hoberman bidimensional, que se expande e contrai por meio de juntas semelhantes a tesouras (Figura 1, Figura Suplementar 1). Um único motor de passo aciona 16 braços dispostos radialmente através de um mecanismo de ligação, produzindo expansão e contração coordenadas de oito pinos de fixação. Essa configuração gera deformação homogênea no plano aplicando deslocamento radial igual a todos os postes simultaneamente. O design único e a pegada compacta do dispositivo facilitam a obtenção de imagens de células vivas com um microscópio de fluorescência invertida durante alongamentos isotrópicos e uniaxiais no plano, a uma fração do custo das alternativas comerciais. O motor de passo linear é controlado com um código Arduino personalizado, permitindo formas de onda cíclicas programáveis com períodos e amplitudes ajustáveis. Neste estudo, demonstramos que o dispositivo entrega cepas precisas e reprodutíveis variando de menos de 1% a 15%, com uma capacidade geométrica superior a 200%. Além disso, quantificamos os efeitos do estiramento mecânico na dinâmica do cálcio intracelular e nas forças de tração celular das células musculares lisas das vias aéreas primárias humanas.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células musculares lisas primárias das vias aéreas humanas (ASMCs) usadas neste estudo foram obtidas do ATCC (Virgínia), e as informações dos doadores foram desidentificadas de acordo com as diretrizes do NIH. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Biossegurança da Northeastern University antes da experimentação.

NOTA: Para instruções sobre a fabricação do dispositivo, bem como as dimensões do dispositivo, consulte o arquivo CAD disponível em nosso repositório GitHub: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging.

1. Design de molde impresso em 3D

  1. Dimensões do molde isotrópico
    1. O diâmetro externo do molde é de 37 mm.
    2. A altura externa do molde é de 4,1 mm.
    3. A espessura da parede externa é de 2,1 mm.
    4. A espessura da base do molde é de 2 mm.
    5. Os furos de fixação estão localizados a 2 mm da borda.
    6. A área interna do poço de cultivo celular tem diâmetro de 20 mm e profundidade de 1,9 mm.
      NOTA: O molde PDMS completo deve ter uma espessura da área de cultura celular de 200 μm.
  2. Dimensões do molde uniaxial
    1. As dimensões externas do molde são 41 mm x 12 mm x 4 mm (L x L x H).
    2. Os furos de fixação ficam a 3 mm da largura da borda e 4 mm da borda do comprimento, com profundidade de 1 mm no poste.
    3. A espessura da parede externa é de 1,5 mm na borda de largura e 2 mm na borda do comprimento.
    4. As dimensões do poço interno de cultura celular são 26 mm x 5,5 mm x 1 mm (L x L x H).
    5. A espessura da base é de 2 mm.
      NOTA: Os moldes foram projetados no SolidWorks, impressos em 3D usando um sistema de resina cinza líquida da FormLabs e fabricados no makerspace da Northeastern University.
  3. Instruções apenas para o uso inicial do molde
    1. Lixe as bordas ásperas da impressão do molde.
    2. Cubra o molde negativo com esmalte transparente para facilitar a remoção posterior do mofo do PDMS após a cura. Deixe o mofo secar ao ar por 24 horas.

2. Fabricação de géis opticamente claros e elásticos com rigidez do substrato sintonizável para cultura celular

NOTA: Use EPI apropriado (luvas, jaleco, proteção ocular) ao manusear PDMS e NuSil.

  1. Adicione a base e o agente de cura do Sylgard 184 em uma proporção de 10:1 em peso em uma placa plástica.
  2. Misture vigorosamente com o abafador de língua (ou ferramenta similar) por 2-3 minutos.
  3. Desgasifice a mistura por 1 hora.
  4. Despeje a mistura PDMS no molde negativo personalizado (Figuras 2A,B).
    1. Adicione 1,3 g ao molde isotrópico.
    2. Adicione 0,5 g para o molde uniaxial.
      NOTA: Tenha cuidado para espalhar o gel de forma uniforme pelo mofo.
  5. Desgasifice o molde por 1 hora.
  6. Deixe o gel no molde assentar em uma superfície plana em temperatura ambiente por 2 horas.
  7. Cure a 60 °C durante a noite.
  8. Mistura as partes A e B do NuSil Gel-8100 em proporções iguais (1:1) por 15 minutos.
    1. Misture com o reticulador Sylgard 184 a 0,36% do volume total para produzir um substrato com rigidez de 13 kPa 32.
    2. Não adicione reticulador para produzir um substrato com rigidez de 0,3 kPa.
  9. Desgasifice a mistura por 30 minutos.
  10. Remova cuidadosamente o gel PDMS do molde personalizado. Coloque o gel sobre uma capa de 40 mm.
    NOTA: Cuidado para não rasgar os géis, pois são frágeis.
  11. Despeje a mistura NuSil sobre a área negativa do gel PDMS.
    1. Gel isotrópico: 100 μL.
    2. Gel uniaxial: 50 μL.
  12. Recubra os respectivos géis de PDMS com a mistura NuSil usando um spin coater por 50 s a 7 x g para obter uma espessura uniforme do substrato de 100 μm.
  13. Deixe o gel se depositar em uma superfície plana em temperatura ambiente por 2 horas antes de curar a 60 °C durante a noite.
    NOTA: Por favor, tenha cuidado para garantir que todas as etapas de cura sejam realizadas em uma superfície nivelada. Um gel irregular não permitirá que toda a região de interesse permaneça no plano de imagem do microscópio. Se a imagem revelar variação de foco ao longo do campo de visão, o gel pode ter curado em uma superfície irregular e deve ser refeito.
  14. Armazene as placas de cultura celular finalizadas em placas de Petri cobertas até o uso (Figura 2D-E).

3. Revestimento de matriz de proteínas

  1. Adicione 500 μL de poli-L-lisina (PLL, 500 μg/mL) a cada substrato.
  2. Incube em temperatura ambiente por 1 hora.
  3. Lave os substratos por 3 × com 1 mL de PBS, seguido por 3 × com 1 mL de tampão HEPES de 10 mM (pH 8,0).
  4. Adicione 500 μL de mPEG-SVA (50 mg/mL) a cada substrato.
  5. Incube em temperatura ambiente por 1 hora.
  6. Lave os substratos por 3 × com 1 mL de PBS.
  7. Substitua o PBS por 500 μL de PLPP (14,5 mg/mL).
  8. Usando o sistema de micropadronização PRIMO com o software Leonardo, projete o padrão pré-definido na superfície do substrato com luz UV por 30 segundos.
  9. Lave os substratos por 3 × com 1 mL de PBS e coloque sob UV por 15 minutos para esterilização.
  10. Adicione 500 μL de gelatina conjugada com fluoresceína a 0,1% a cada substrato.
  11. Incube em temperatura ambiente por 1 hora.
  12. Lave 3 × com 1 mL de PBS.
    NOTA: Para visualizar padrões, incube com gelatina conjugada com fluoresceína a 0,1% por 1 hora em temperatura ambiente.
  13. Prossiga com a imagem de imagem.

4. Cultura de células musculares lisas nas vias aéreas humanas em pratos elásticos

NOTA: Realize todos os procedimentos de cultura celular em um exaustor de biossegurança usando a técnica asséptica padrão.

  1. Obtenha células primárias de músculo liso das vias aéreas humanas (ASMCs) do ATCC (Virgínia) e garanta que as informações sobre doadores sejam desidentificadas de acordo com as diretrizes do NIH. Confirme a aprovação do Comitê de Biossegurança Institucional antes da experimentação.
  2. Use células de três doadores humanos saudáveis de sexos e idades diferentes, sem histórico de asma/doença. Exemplo: uma mulher (18 anos) e dois homens (34 e 59 anos).
  3. Cultive células sob condições padrão (37 °C, 5% CO ₂) e utilize células até a passagem 6 para todos os experimentos.
  4. Cultive as células no seguinte meio completo de crescimento:
    1. DMEM/F12 (500 mL)
    2. 10% soro fetal bovino (FBS) (50 mL)
    3. 1× penicilina/estreptomicina (5 mL)
    4. 1× Aminoácidos não essenciais do MEM (5 mL)
    5. Anfotericina B (0,5 mL)
  5. Troque as células para um meio sem soro pelo menos 24 horas antes das medições. Prepare um meio sem sérum com:
    1. Ham 's F-12 médio (500 mL)
    2. 1 × penicilina/estreptomicina (5 mL)
    3. Anfotericina B (50 μg/L)
    4. 1× Aminoácidos não essenciais do MEM (5 mL)
  6. Esterilize por UV as panelas de cultura celular elásticas por 15 minutos.
  7. Incube pratos esterilizados com gelatina 0,1% por 1 h em temperatura ambiente antes da semeadura (Figura 2F).
    1. Para substratos padronizados:
      1. Células semente em poços de cultura celular elástica com densidade de 104 células/cm2.
      2. Incube em meio sérico a 10% por 10 minutos para promover a fixação em áreas padrão.
      3. Lave poços com PBS para remover células soltas.
      4. Encha os poços com 10% de meio sérico e incube por 24 horas.
      5. Substitua por meio sem soro e incube por 24 horas antes das medições.
    2. Para substratos sem padronização:
      1. Células semente na densidade desejada: 102 células/cm 2 para células isoladas. 103 células/cm 2 para células esparsas. 104células/cm 2 para células confluentes.
      2. Incube em meio sérico a 10% por 24 horas.
      3. Substitua por meio sem soro e incube por 24 horas antes das medições.

5. Imagem e análise de cálcio fluorescente

  1. ASMCs de via aérea com carência de soro por 24 horas.
  2. Prepare o corante FLIPRCa 2+6 conforme as instruções do fabricante.
  3. Misture o corante FLIPR Ca2+6 com um médio sem sérum na proporção 1:1.
  4. Incubar as células com a solução FLIPR Ca ² ⁺ 6 a 37 °C e 5% de CO ₂ por 2 horas.

6. Configuração de Imagem

  1. Use um microscópio Leica DMi8 invertido equipado com:
    1. Câmera Leica DFC6000
    2. Motor leve Leica LED8
    3. Objetivo seco 5×/0,12
  2. Ajuste excitação em 480/40 nm e emissão em 527/50 nm.
  3. Adquira imagens de 16 bits com taxa de quadros de 2 Hz durante experimentos de estiramento.

7. Análise de dados

  1. Importar sequências de imagens para Fiji (ImageJ) 33.
  2. Defina manualmente as regiões de interesse (ROIs) no citoplasma de cada célula.
  3. Extraia os valores médios de intensidade em escala de cinza para cada ROI ao longo do tempo.
  4. Processe dados de intensidade de fluorescência usando um script personalizado do MATLAB.
    NOTA: A intensidade da fluorescência é proporcional ao citosólico [Ca2+].

8. Medições e análise da força de tração

NOTA: Todos os códigos, incluindo os de análise de imagens, microscopia de força de tração e controle motor, estão disponíveis em nosso repositório do GitHub: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging

  1. Revestir os substratos do gel PDMS-NuSil com uma camada de esferas fluorescentes para servir como marcadores fiduciais para microscopia de força de tração.
  2. Prepare uma solução de 0,025% de microsferas vermelhas fluorescentes modificadas com carboxilato de 1 μm de diâmetro em HBSS, diluindo para uma proporção de 1:4000.
  3. Faça vórtice na solução da conta por 10 segundos.
  4. Adicione a solução de contas ao gel.
    1. 880 μL para o gel isotrópico.
    2. 420 μL para o gel uniaxial.
  5. Incube em temperatura ambiente por 1 h para permitir que as esferas aderam.
  6. Após 1 hora, remova cuidadosamente a solução.
    NOTA: Despeja suavemente a solução de esferas sobre géis macios. A remoção inadequada impede a distribuição adequada das contas.
  7. Limpe suavemente qualquer solução residual com um cotonete ou Kimwipe.
  8. Fotografe as contas com um microscópio Leica DMi8 equipado com uma objetiva seca 10x/0,32.
  9. Capture imagens na condição pré-estiramento e continuamente durante todo o protocolo de alongamento.
    NOTA: Realize todas as imagens no centro do substrato, onde a uniformidade da deformação é maior. Se necessário, refoque o microscópio na posição esticada antes de capturar imagens.
  10. Analise as imagens usando um código MATLAB personalizado baseado na microscopia da força de tração de Fourier para calcular vetores de deslocamento e campos de deformação planar correspondentes 34.
  11. Represente os dados como a média de N ensaios.

9. Calibração do dispositivo de alongamento celular

  1. Adicione 500 μL de H₂O ao poço para simular o peso do meio de cultura celular e manter o padrão proteico úmido.
  2. Para o protocolo relativo à criação de padrões específicos de proteínas, consulte a seção 3 intitulada "Revestimento de Proteínas da Matriz".
  3. Imagem de padrões fluorescentes a cada 400 μm passos de deslocamento motor, aumentando até um máximo de 2800 μm, e depois retornando a zero em incrementos reversos de 400 μm.
  4. Caracterize a relação entre o deslocamento linear do motor de passo e a deformação isotrópica do prato de cultura celular extensível em escalas macroscópica e regional, medindo as mudanças de área e excentricidade das letras fluorescentes com padrão proteico que formam "BREATHE" no substrato elástico durante o esticamento. Use uma caixa delimitadora retangular que engloba todas as letras para calcular a área e a excentricidade de toda a palavra.
  5. Aplique segmentação de imagem no MATLAB para quantificar esses parâmetros para cada letra individual.
  6. Defina deslocamento zero pelas dimensões não esticadas do prato de cultura celular.
  7. Repita cada experimento em dois a três poços de cultura celular extensível preparados independentemente para garantir a reprodutibilidade.

10. Apresentação de dados e testes estatísticos

  1. Para experimentos de calibração de macha, defina ensaios como o número de ciclos.
  2. Mostre cada ensaio separadamente, em vez de combiná-los em uma única curva para demonstrar a repetibilidade do sistema.
  3. Indique barras de erro como desvio padrão.
  4. Use uma ANOVA unidirecional para testar diferenças significativas em conjuntos de dados com três ou mais grupos influenciados por um fator independente.
  5. Use ANOVAs bidirecionais seguidas de comparações post hoc por pares para testar diferenças significativas em conjuntos de dados influenciados por dois fatores independentes.
  6. Aplique o teste t para comparações par a par quando os dados são normalmente distribuídos.
  7. Aplique o teste de soma de postos de Mann-Whitney para comparar valores medianos quando os dados não são normalmente distribuídos.
  8. Informe os testes específicos utilizados, o número de amostras e os valores P correspondentes, junto com os resultados.
  9. Use um limiar de valor P de 0,05 para determinar diferenças estatisticamente significativas entre conjuntos de dados.
  10. Realize testes estatísticos no SigmaStat.
  11. Plote figuras em GraphPad Prism e MATLAB.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O estretchador de células induz alterações macroscópicas na área que refletem deformações localizadas. Para avaliar o comportamento isotrópico, medimos as mudanças de área de um padrão de proteína de gelatina fluorescente formando a palavra "BREATHE" em um poço de cultura celular extensível, junto com suas letras individuais, em um substrato isotrópico. Nossos resultados demonstraram que tanto a palavra quanto as letras individuais apresentavam mudanças equivalentes na área (

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, descrevemos o design, desenvolvimento, validação e implementação de um novo extensor celular compatível com microscópio que pode imitar cepas isotrópicas e uniaxiais enquanto simultaneamente capta imagens de células vivas. Este dispositivo é compacto e pode caber em um palco de microscópio Leica DMi8, confinando todas as partes móveis a um único plano para permitir imagens ao vivo, mantendo o foco no substrato e nas células subjacentes. Isso foi feito utilizando braços a...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nenhum dos autores tem interesses concorrentes a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem ao Sr. Noah Joseph por sua ajuda na fabricação dos moldes. Os autores agradecem a Heitor Mourato e Glenn Thayer, da Boston University Scientific Instrument Facility, pela ajuda na usinagem do dispositivo. Esse trabalho foi apoiado pela bolsa de carreira #2047207 da National Science Foundation (NSF) concedida a Harikrishnan Parameswaran. H.P. concebeu a pesquisa. S.E.S. e S.R.P. desenvolveram o design geral do dispositivo, e S.E.S. e H.P. projetaram os experimentos isotrópicos. A S.E.S realizou os experimentos com moldes isotrópicos, analisou os dados experimentais e interpretou os resultados junto com a H.P. V.C. projetou os moldes uniaxiais, otimizou a preparação do gel e o formamento de esferas. O B.M.G conduziu os experimentos com gel uniaxial, analisou os dados experimentais e interpretou os resultados junto com H.P. e V.C. S.E.S. e B.M.G. que prepararam as figuras. B.M.G, S.E.S, V.C. e H.P. contribuíram para a redação e edição do manuscrito. A H.P. aprovou a versão final do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
  Dulbecco' s modificado Eagle' s médio/F12Fisher Scientific12634010500 mL 
(4-benzoilbenzil) cloreto de trimetilamãe (PLPP)Alvé OleN/A14,5mg/mL
0,1% gelatina conjugada com fluoresceína  InvitrogenG13187
Solução de Gelatina 0,1%Sigma-AldrichES-006500 mL 
1 & mu; Microsferas vermelhas fluorescentes modificadas por carboxilato com diâmetro mFluoSpheresF8816
1× Solução de aminoácidos não essenciais do MEMSigma-AldrichM7145100 mL
1× Penicilina/estreptomicinaFisher Scientific15-140-122100 mL
Soro fetal bovino 10%Termo-CientíficaA5256701500 mL 
Tubo de 15 mLFisher Scientific14-959-53A
1x glutamina Fisher ScientificMT10010CM
1x Suplemento de Crescimento de Insulina-Transferrina-SelênioCiências da Vida Corning25-800-CR
Anfotericina BSigma-AldrichA294225 & mu; g/litro
Rolamentos de esferasMcMaster-Carr N/A
Diidratado de cloreto de cálcioSigma-Aldrich223506
Trilhos de vagõesMcMaster-Carr N/A
FLIPR Ca2+ 6Dispositivos MolecularesR8190
GraphPad PrismaDotmaticsN/A
Presunto' s F-12 médio & nbsp;Sigma-AldrichN8641500 mL 
Solução Salítica Balanceada de Hanks Termo-Científica14025092500 mL 
HEPES buffer Termo-Científica15630080100 mL
Leonardo SoftwareAlvé OleN/A
MatlabMathworksN/A
Metoxi-polietilenoglicol & ndash; Valerato de Succinimidil (mPEG-SVA)Laysan Bio IncN/A50mg/mL
Nusil Gel-8100Nusil N/A
Placas de PetriTermo-Científica26399190 mm 
solução salina tamponada com fosfato  Sigma-Aldrich10010023500 mL 
poli-L-lisina (PLL)Sigma-AldrichP8920500μ g/mL
Células musculares lisas das vias aéreas humanas primárias  ATCCPCS-130-011
Módulo óptico PRIMO  Alvé OleN/A
ParafusosMcMaster-Carr N/A
SigmaStatSystat SoftwareN/A
Encobridora de RotaçãoLaurellModelo WS-650MZ-23NPPB
Componentes de Fixação de Esticas e Palco  Instalação de Instrumentos Científicos da Universidade de BostonN/AAço inoxidável
Kit base de elastomo e agente de cura Sylgard 184DowH047J8Q026
Frasco de Cultura de Tecidos T-25 - Tampa de ventilação, estérilCellTreat229331
Depressor lingual  Termo-Científica22-363-154

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez, Y., Smutny, M. Emerging role of mechanical forces in cell fate acquisition. Front Cell Dev Biol. 10, 864522(2022).
  2. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18, 728-742 (2017).
  3. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  4. Stasiak, S. E., Jamieson, R. R., Bouffard, J., Cram, E. J., Parameswaran, H. Intercellular communication controls agonist-induced calcium oscillations independently of gap junctions in smooth muscle cells. Sci Adv. 6 (32), eaba1149(2020).
  5. Riley, D. J., Rannels, D. E., Low, R. B., Jensen, L., Jacobs, T. P. NHLBI workshop summary: effect of physical forces on lung structure, function, and metabolism. Am Rev Respir Dis. 142, 910-914 (1990).
  6. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 802-812 (2014).
  7. Gong, F., et al. An overview of the role of mechanical stretching in the progression of lung cancer. Front Cell Dev Biol. 9, 781828(2021).
  8. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 63-73 (2009).
  9. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5, e12905(2010).
  10. Hannezo, E., Heisenberg, C. -P. Mechanochemical feedback loops in development and disease. Cell. 178, 12-25 (2019).
  11. Das, S., Ippolito, A., McGarry, P., Deshpande, V. S. Cell reorientation on a cyclically strained substrate. PNAS Nexus. 1, pgac199(2022).
  12. Dartsch, P. C., Hämmerle, H., Betz, E. Orientation of cultured arterial smooth muscle cells growing on cyclically stretched substrates. Acta Anat. 125, 108-113 (1986).
  13. An, S. S., et al. Cell stiffness, contractile stress and the role of extracellular matrix. Biochem Biophys Res Commun. 382, 697-703 (2009).
  14. Arold, S. P., Bartolák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  15. Trepat, X., et al. Universal physical responses to stretch in the living cell. Nature. 447, 592-595 (2007).
  16. Benavides Damm, T., Egli, M. Calcium 's role in mechanotransduction during muscle development. Cell Physiol Biochem. 33, 249-272 (2014).
  17. Ito, S., et al. A novel Ca2+ influx pathway activated by mechanical stretch in human airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 407-413 (2008).
  18. Ito, S. Stretch-activated calcium mobilization in airway smooth muscle and pathophysiology of asthma. Curr Opin Physiol. 21, 65-70 (2021).
  19. Ito, S., et al. Actin cytoskeleton regulates stretch-activated Ca2+ influx in human pulmonary microvascular endothelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 26-34 (2010).
  20. Tanaka, Y., Hata, S., Ishiro, H., Ishii, K., Nakayama, K. Quick stretch increases the production of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) in porcine coronary artery. Life Sci. 55, 227-235 (1994).
  21. Brown, T. D. Techniques for mechanical stimulation of cells in vitro: a review. J Biomech. 33, 3-14 (2000).
  22. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  23. Fredberg, J. J., Bunk, D., Ingenito, E., Shore, S. A. Tissue resistance and the contractile state of lung parenchyma. J Appl Physiol. 74, 1387-1397 (1993).
  24. Shen, Z. L., Dodge, M. R., Kahn, H., Ballarini, R., Eppell, S. J. Stress-strain experiments on individual collagen fibrils. Biophys J. 95, 3956-3963 (2008).
  25. Atcha, H., et al. A low-cost mechanical stretching device for uniaxial strain of cells: a platform for pedagogy in mechanobiology. J Biomech Eng. 140, 0810051-0810059 (2018).
  26. Tschumperlin, D. J., Margulies, S. S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  27. Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells. J Biomech Eng. 138, 4032550(2016).
  28. Ursekar, C. P., et al. Design and construction of an equibiaxial cell stretching system that is improved for biochemical analysis. PLoS One. 9, e90665(2014).
  29. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 13661-13665 (1997).
  30. Cell stretching bioreactor FAQs. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com/resources/faq (2024).
  31. Bossé, Y. The strain on airway smooth muscle during a deep inspiration to total lung capacity. J Eng Sci Med Diagn Ther. 2, 010802(2019).
  32. Yoshie, H., et al. Traction force screening enabled by compliant PDMS elastomers. Biophys J. 114, 2194-2199 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Butler, J. P., Toli ć-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, C595-C605 (2002).
  35. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 4, 764(2021).
  36. Ji, G., Barsotti, R. J., Feldman, M. E., Kotlikoff, M. I. Stretch-induced calcium release in smooth muscle. J Gen Physiol. 119, 533-543 (2002).
  37. Davis, M. J., Meininger, G. A., Zawieja, D. C. Stretch-induced increases in intracellular calcium of isolated vascular smooth muscle cells. Am J Physiol. 263, H1292-H1299 (1992).
  38. Naruse, K., Sokabe, M. Involvement of stretch-activated ion channels in Ca2+ mobilization to mechanical stretch in endothelial cells. Am J Physiol. 264, C1037-C1044 (1993).
  39. Arold, S. P., Bartol ák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  40. Cell stretching bioreactors. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com (2024).
  41. Mitrossilis, D., et al. Single-cell response to stiffness exhibits muscle-like behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18243-18248 (2009).
  42. Parameswaran, H., Lutchen, K. R., Suki, B. A computational model of the response of adherent cells to stretch and changes in substrate stiffness. J Appl Physiol. 116, 825-834 (2014).

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