Resposta à Temperatura das Taxas de Decomposição da Matéria Orgânica do Solo: Construção e Aplicações de um Bloco de Gradiente de Temperatura

Resumo

Apresentamos um bloco de gradiente de temperatura e detalhamos sua construção e utilização. O bloco fornece 22 temperaturas discretas, distribuídas linearmente entre uma faixa definida pelo usuário de 0 a 90 °C. Os dados coletados desse sistema permitem testar e desenvolver novas teorias sobre a resposta térmica das taxas de decomposição da matéria orgânica do solo.

Resumo

O solo é o maior reservatório de carbono (C) da Terra, contendo quase o dobro de C da atmosfera. O aumento de temperatura induzido pelas mudanças climáticas poderia aumentar a decomposição da matéria orgânica do solo (SOM), potencialmente liberando dióxido de carbono (CO₂) na atmosfera, resultando assim em um feedback positivo para as mudanças climáticas. Isso levanta a questão: como podemos definir a resposta das taxas de decomposição da SOM a mudanças de temperatura de curto prazo? Podemos utilizar esses dados para ajustar equações mecanicamente definidas em modelos do sistema terrestre para previsões climáticas? A maior parte das pesquisas até agora tem se concentrado em incubações laboratoriais em solo em diferentes temperaturas discretas. Isso, no entanto, não resulta em uma curva detalhada de resposta à temperatura, que é necessária para testar novas hipóteses impostas pelos desenvolvimentos mais recentes no campo, como a teoria da taxa macromolecular (MMRT). Neste artigo, apresentamos um bloco de gradiente de temperatura, modificado e aprimorado em relação a trabalhos anteriores, detalhamos seu processo de construção e fornecemos uma explicação detalhada para sua utilização. O bloco do gradiente de temperatura é um bloco de alumínio com quatro fileiras de 22 furos discretos, permitindo a incubação simultânea de 88 microcosmos (frascos de 60 mL). O bloco é resfriado em uma extremidade e aquecido na outra, criando uma distribuição linear de temperatura. Ele fornece 22 pontos de temperatura discretos ao longo de uma faixa definida pelo usuário, dentro de limites de 0 a 90 °C. Após 3,5 horas de incubação, a produção de_CO2 é medida em cada um dos 88 microcosmos. Os resultados demonstram que o bloco produz o gradiente de temperatura definido pelo usuário e facilita a construção de curvas de resposta à temperatura da decomposição SOM. Além disso, os dados coletados nesse sistema podem ser usados para testar e desenvolver novas hipóteses e teorias sobre o impacto das mudanças de temperatura nas taxas de decomposição da SOM, uma área de importância crescente no contexto das mudanças climáticas.

Introdução

O aumento das concentrações de dióxido de carbono (CO₂) na atmosfera leva a temperaturas mais altas na Terra¹. Esse fenômeno foi relatado pela primeira vez em 1856 por Eunice^{Foote 2}, que conduziu um experimento simples, porém inovador. Ela encheu um cilindro com ar ambiente e outro com_CO2 e registrou as temperaturas em ambos^{os 1}. Os resultados foram claros: cilindros com concentrações mais altas de_CO2 apresentaram temperaturas mais altas, demonstrando o efeito de aquecimento do aumento do CO2 1^atmosférico. Essa observação tem implicações significativas para as mudanças climáticas. Hoje, os primeiros insights de Foote continuam a informar a ciência climática contemporânea, orientando pesquisas sobre como o aumento dos níveis de_CO2 afeta o aquecimento global e influencia diversos ecossistemas.

Os solos armazenam quase o dobro do carbono (C) da atmosfera no primeiro metro, desempenhando um papel crucial no ciclo^{global de carbono 3}. Um processo-chave que influencia os estoques de C do solo é a decomposição da matéria orgânica do solo (SOM), que determina a taxa com que o C é liberado de volta à^{atmosfera 4,5}. Temperaturas médias anuais mais altas, impulsionadas pelas mudanças climáticas, têm o potencial de estimular a decomposição da matéria orgânica do solo (SOM), acelerando a liberação de_CO2 na^{atmosfera 6,7}. Isso representa um mecanismo de retroalimentação positiva para as mudanças climáticas, especialmente quando temperaturas mais altas aceleram as perdas de C por decomposição de SOM mais do que estimulam entradas fotossintéticas de C⁶. Apesar de extensas pesquisas sobre o tema, a magnitude e direção do chamado feedback terra-carbono-clima continuam amplamente^debatidas 8,9,10,11. Essa incerteza se deve em grande parte a lacunas de conhecimento fundamental sobre a resposta térmica das taxas de decomposição da SOM. Abordar essas lacunas é essencial para refinar modelos do sistema terrestre e incorporar representações teoricamente aterradas da resposta térmica às taxas de decomposição dos SOMs.

A resposta térmica das taxas de decomposição SOM é comumente representada pelo valor Q₁₀ e pela equação de Arrhenius. O valor Q₁₀ é definido como o fator pelo qual uma taxa é multiplicada quando a temperatura aumenta por 10 °C. Apesar dos desafios à sua^validade 12,13,14,15, o_Q10 tornou-se a abordagem padrão para comparar a resposta à temperatura de diferentes tratamentos e solos. A teoria de Arrhenius sugere um aumento exponencial nas taxas de processo, como as da decomposição SOM, com o aumento da temperatura¹⁶. No entanto, as atividades enzimáticas reais tendem a seguir uma forma unimodal com um ótimo térmico distinto e declinam em temperaturas^{mais altas 17,18,19}. Equações baseadas em Arrhenius tentam explicar esse declínio sugerindo desnaturação enzimática além do ótimo térmico⁶. No entanto, a desnaturação enzimática ocorre em temperaturas mais altas do que as comumente encontradas em solos, indicando que as enzimas atingem um ótimo térmico antes da desnaturação ocorrer^19,20. Além disso, simplesmente adicionar uma segunda função à equação de Arrhenius para levar em conta o colapso das taxas de respiração devido à desnaturação não permite estimar a temperatura de um ponto de inflexão – a temperatura na qual a taxa de variação da respiração é^{maximizada em 21,22}. Consequentemente, equações baseadas em Arrhenius não capturam totalmente a forma comumente medida da resposta térmica geral das taxas de decomposição SOM dentro da faixa de temperaturas geralmente observadas em solos^14,23.

Para abordar as limitações da teoria de Arrhenius, múltiplas equações foram desenvolvidas para representar a sensibilidade à temperatura dos processos biológicos; no entanto, poucos têm fundamento na teoria biológica ou foram aplicados aos solos ^24,25. Entre as abordagens baseadas em biologia, a teoria da taxa macromolecular (MMRT) supera algumas das limitações da equação de Arrhenius ao incorporar as propriedades termodinâmicas de macromoléculas biológicas, como as^{enzimas 26}. De forma semelhante, a teoria de Arrhenius Assistida por Enzimas (EAAR) explica o papel dependente da temperatura das enzimas na redução da energia de ativação da^{reação 24}. Ambas as equações foram aplicadas com sucesso a estudos da resposta térmica de reações bioquímicas em solos e^{microrganismos} 17,24,27,28. Essas equações fornecem valiosos insights mecanicistas sobre a resposta térmica da decomposição SOM e as etapas subjacentes da reação. No entanto, sua ampla adoção e parametrização são frequentemente prejudicadas por desafios experimentais.

Tanto os estudos de campo quanto os de laboratório apresentam vantagens e limitações para entender a resposta térmica das taxas de decomposição da SOM. Experimentos de campo fornecem insights valiosos sobre a resposta térmica de longo prazo das taxas de decomposição da SOM. No entanto, interpretar medições de fluxo de CO₂ em campo pode ser desafiador devido a variáveis de confusão como respiração autotrófica, variabilidade de umidade e acessibilidade ao^{substrato 29,30,31,32,33.} Embora essas interações sejam essenciais para quantificar processos do mundo real, tais estudos geralmente focam em respostas de longo prazo dos ecossistemas, em vez de medições de processos mecanicistas de curto prazo. Compreender a resposta térmica de curto prazo é crucial para parametrizar equações definidas por teorias recentes, como MMRT e EAAR, e para isso, estudos laboratoriais são fundamentais. Muitos estudos laboratoriais normalmente sofrem efeitos de confusão devido à depleção do substrato, que aumentam com o tempo de incubação e os tratamentos^{de temperatura} 34,35,36. Além disso, a maioria dos experimentos laboratoriais utiliza apenas alguns tratamentos de temperatura 37,38,39,40, resultando em ajustar equações exponenciais simples ou calcular razões Q₁₀ em vez de equações mais avançadas, que exigem que as taxas sejam medidas em um número maior de temperaturas ^{discretas 41}. Para enfrentar essas questões, é crucial desenvolver novas abordagens experimentais que permitam medições precisas das taxas de decomposição do SOM em uma faixa mais ampla de temperaturas, apoiando assim o rigoroso teste e desenvolvimento das teorias de decomposição do SOM em relação à resposta à temperatura.

Neste artigo, descrevemos a construção e utilização de um bloco de gradiente de temperatura, que não apenas aborda as limitações experimentais atuais, mas também fornece um estudo de ponta para demonstrar a resposta de curto prazo da decomposição de SOM à temperatura. O desenho apresentado aqui é uma adaptação da metodologia desenvolvida inicialmente por Thomas et al. (1963)⁴² e posteriormente modificada por Robinson et al. (2017)⁴¹. As principais diferenças incluem 1) melhoria do sistema de resfriamento, 2) redução do tempo operacional ao acoplar o bloco a um analisador de_CO2 para medição direta das concentrações de_CO2, e 3) eliminação da necessidade de transportar frascos durante o experimento. Embora os relatórios^{anteriores 21, 41, 43} tenham fornecido uma descrição ampla do bloco de temperatura, o projeto detalhado, os métodos de construção e os testes foram mínimos, limitando a capacidade de outros pesquisadores utilizarem essa abordagem. Aqui, fornecemos detalhes completos tanto do projeto quanto da construção, e apresentamos resultados de múltiplos testes para demonstrar a funcionalidade correta do sistema para diferentes amostras de solo.

Protocolo

Aqui, apresentamos a construção detalhada e a utilização aprofundada do bloco do gradiente de temperatura. Todos os materiais com suas respectivas especificações podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1 e na Tabela de Materiais. O custo de construção e montagem do bloco de gradiente de temperatura foi de aproximadamente €20.000, excluindo o custo do analisador de gás. Este bloco de gradiente de temperatura é chamado 'Eunice' em homenagem a Eunice Foote.

1. Construção do bloco do gradiente de temperatura

1. Consulte a Figura 1 para o projeto do corpo do bloco do gradiente de temperatura.
2. Construção do bloco de alumínio
   1. Posicione e fixe o bloco de alumínio bruto em uma fresadora universal. Insira as medições e localizações de cada furo no software da máquina. A Figura 2 especifica a localização e o diâmetro de cada furo para o montagem.
   2. Fure furos para hastes de aquecimento. Em uma extremidade do bloco, perfure dois furos com diâmetro de 16 mm e profundidade de 133 mm. Posicione esses furos de modo que seus centros fiquem a 25 mm da borda superior e a 36,25 mm das bordas laterais (Figura 2).
   3. Crie um padrão de castelo para um agente de resfriamento. Na extremidade oposta do bloco, perfure um padrão de castelo ao longo de 180 mm de comprimento (Figura 3A). Certifique-se de que o padrão do castelo tenha espessura de 16 mm e profundidade de 140 mm. Furar 12 furos adicionais dentro do padrão do castelo, cada um com diâmetro de 10 mm e profundidade de 140 mm. Consulte a Figura 3B para a localização e distribuição exatas desses buracos.
      NOTA: O padrão do castelo foi criado para aumentar o contato do agente de resfriamento com o bloco, e os 12 furos servem para evitar transbordamento.
   4. Crie uma junta para o padrão do castelo. Corte uma junta de alumínio para envolver o agente de resfriamento dentro do bloco e coloque-o sobre o padrão do castelo. Isso é usado para evitar vazamentos do agente de resfriamento.
   5. Fure furos para a conexão do resfriador. Na frente e na parte traseira do bloco, furem furos com diâmetro de 15 mm para a conexão do resfriador (Figura 4). Posicione o centro dos furos a 75 mm de profundidade. Certifique-se de que o furo na frente esteja a 18 mm da borda e o do lado de trás a 162 mm da borda. Certifique-se de que esses dois furos conectem o início e o fim do padrão do castelo.
   6. Furar furos para sensores de temperatura. Furar 8 furos com diâmetro de 3 mm e profundidade de 150 mm. Esses sensores estão localizados no meio do bloco e distribuídos uniformemente ao longo de seu comprimento. Certifique-se de que o centro do primeiro furo do sensor esteja a 940 mm da borda, e o último furo do sensor esteja a 205 mm da borda.
   7. Furem furos para os frascos de 60 mL. Crie 88 furos, cada um com 28 mm de diâmetro e 144 mm de altura. Esses furos estão distribuídos uniformemente pelo bloco. O centro do primeiro e último furo do frasco se alinha com o centro do primeiro e último furo do sensor.
3. Preparação do isolamento
   NOTA: O material isolante é feito de poliisocianurato com espessura de 40 mm.
   1. Usando uma serra circular, corte o material isolante em forma de trapézio com um ângulo de 135°. Para cobrir os quatro lados longos do bloco de alumínio, corte o material isolante em um retângulo medindo 1080 mm por 230 mm. Corte cada um dos quatro lados desse retângulo em um ângulo de 135° para encaixar bem ao redor do bloco. Um desses lados será colado na tampa do bloco. Use fita de alumínio para proteger o material isolante da tampa do bloco.
   2. Para os dois lados curtos do bloco, corte o material isolante em um quadrado medindo 230 mm por 230 mm. Novamente, corte cada lado do quadrado em um ângulo de 135° para garantir um ajuste adequado.
4. Conectando o sistema de resfriamento (Figura 5)
   NOTA: O sistema de resfriamento utilizado neste sistema é compacto e eficiente em energia. Esse sistema de resfriamento é operado circulando um agente natural de resfriamento com capacidade de resfriamento de até -30 °C.
   1. Prenda o acoplamento do joelho e a espiga da mangueira ao bloco (Figura 5C). Depois, conecte a mangueira que direciona o agente refrigerante ao cooler.
   2. Cubra a mangueira com material isolante flexível para cobri-la completamente. Isso manterá o agente de resfriamento na temperatura desejada. Corte o material isolante flexível e ajuste firmemente na mangueira, usando selante adesivo para fixar o isolamento.
5. Insira a haste de aquecimento e os sensores no bloco para garantir o ajuste (Figura 5D).
6. Consulte a Figura 5 para uma visão geral dos passos explicados acima.

Figura 1: Design do corpo e partes do bloco de gradiente de temperatura. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Bloco de gradiente de temperatura que delimita a localização e o diâmetro dos furos usados para múltiplos usos. A letra "S" indica sensor. As dimensões estão em milímetros (mm). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Projeto e medições do padrão do castelo usado como agente de resfriamento. (A) Medições da espessura, comprimento e diâmetro do padrão do castelo, e (B) distância e localização dos 12 buracos usados para evitar transbordamento. As dimensões estão em milímetros (mm). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Vista lateral do bloco do gradiente de temperatura indicando a profundidade de cada furo e a localização das conexões dos resfriadores. A letra "S" indica sensor. As dimensões estão em milímetros (mm). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Visão geral da construção do bloco do gradiente de temperatura. (A) Furar furos para colocar os frascos de 60 mL; (B) construir o material isolante que cobre o bloco de alumínio; (C) conexão e gabinete para o agente de resfriamento; (D) inserir a haste de aquecimento e os sensores no bloco. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Construção da carcaça em aço inoxidável.

1. Corte o aço inoxidável para os lados longos com dimensões 1080 mm x 230 mm x 230 mm. Para os lados curtos, corte o aço inoxidável com dimensões de 230 mm x 230 mm. Certifique-se de fazer furos para a mangueira de resfriamento, sensores, hastes de aquecimento e alças.
   NOTA: Um dos lados longos é usado como tampa do bloco.
2. Conecte a calor as alças, dobradiças da tampa e fechos à carcaça de aço inoxidável.

3. Construção da unidade eletrônica

NOTA: Somente um eletricista qualificado pode construir a unidade eletrônica. O protocolo aqui descrito foi desenvolvido de acordo com as leis holandesas e da UE. Abaixo está uma breve visão geral dos principais componentes utilizados; instruções detalhadas de fiação são fornecidas no Arquivo Suplementar 1.

1. Projete o diagrama eletrônico (Figura 6).
2. Monte as caixas de junção.
   NOTA: As caixas de derivação são instaladas para proteger os componentes elétricos e as conexões contra objetos externos e danos.
   1. Fixe firmemente as três caixas de junção na carcaça de aço inoxidável usando os parafusos de fixação.
   2. Preparei os pontos de entrada dos cabos. Na caixa principal de derivação, faça seis furos para as prensa-cabos. Nas duas caixas menores, faça dois furos para as prensa-cabos. Uma caixa abriga o interruptor de duas vias, e a outra as conexões do cabo do bastão do aquecedor.
      NOTA: O interruptor de duas vias é usado para ligar e desligar a unidade, o que significa que fornece energia para o mini disjuntor.
   3. Na caixa principal de derivação, faça um furo no topo para o LED verde.
      NOTA: Esta luz LED indica quando a unidade está ligada e a energia está disponível para todos os componentes.
   4. Corte e encaixe o trilho DIN na caixa principal de junção. Depois, marque três furos para os parafusos de fixação que seguram o trilho DIN. Monte o trilho DIN na caixa principal de junção.
      NOTA: O trilho DIN é usado para facilitar a montagem dos componentes elétricos. Preferencialmente, coloque-o aproximadamente no centro da caixa principal de derivação.
3. Instalação de componentes elétricos.
   NOTA: Use a Figura 7 como referência e instale cada componente elétrico.
   1. Localize a caixa de derivação do interruptor de duas vias. Remova a metade superior do interruptor para encontrar a parte que precisa ser passada pela placa de cobertura. Marque e perfure um furo na placa de cobertura da caixa de junção do interruptor, que precisa encaixar e montar o interruptor na placa de cobertura. Use as instruções de montagem do interruptor.
   2. Na caixa principal de junção, coloque o terminal PE/GND no trilho DIN. Depois, coloque o disjuntor miniatura (MCB) no trilho DIN.
      NOTA: Os terminais PE/GND são usados como topos nas extremidades. O MCB é um disjuntor miniatura e o principal disjuntor de segurança em caso de falha ou escassez. Quando o MCB está ligado, ele aplica energia à fonte AC/DC.
   3. Coloque dois terminais triplos de alimentação no trilho DIN. Utilizando dois terminais duplos de ponte para uni-los no topo e na base dos terminais de alimentação.
      NOTA: Use terminais de alimentação para conectar mais de dois fios e utilize pontes para ligar múltiplos terminais de alimentação. Garanta uma conexão segura e confiável usando os conectores de ferula.
   4. Coloque a fonte de alimentação DC no trilho DIN como mostrado na foto.
      NOTA: Este estudo usou uma fonte de alimentação AC/DC de 24 V, 2,5 A. Que usa a energia AC e a converte para 24 VDC para as necessidades de energia de entrada dos outros componentes.
   5. Coloque o termostato no trilho DIN como mostrado na foto. Certifique-se de não perder o módulo de conexão do cabo (Verde na Figura 7).
      NOTA: Um termostato era usado para controlar e monitorar a temperatura. É um sistema de software baseado em navegador web que requer o endereço IP da unidade para fazer login, ajustar a temperatura das hastes de aquecimento e registrar os dados. Ele estava conectado à rede local (LAN) para poder se conectar à unidade a partir de qualquer computador do campus.
   6. Coloque sete terminais triplos de alimentação no trilho DIN conforme mostrado na foto. Usando três pontes quíntuplas, une os primeiros cinco feed-thrus nos terminais superior, central e inferior.
   7. Use duas pontes quíntuplas para unir os dois últimos feed-thrus no topo e no fundo.
   8. Coloque um suporte de fusível no trilho DIN como mostrado na foto.
      NOTA: Um fusível de 630 mA foi usado para proteger os componentes da unidade contra danos em caso de curto-circuitos e surtos de energia.
   9. Coloque duas unidades de conexão de terminal único no trilho DIN conforme mostrado na foto.
   10. Coloque o relé de estado sólido no trilho DIN como mostrado na foto.
       NOTA: O relé de estado sólido é usado para ligar e desligar as hastes de aquecimento.
   11. Coloque um terminal PE/GND como parada final.
4. Para o procedimento de conexão do fio elétrico, consulte a Figura Suplementar 1.
5. Para uma visão geral da unidade eletrônica, consulte a Figura 7.

Figura 6: Diagrama da unidade eletrônica. As cores dos fios são as seguintes: marrom = linha de Corrente Alternada de Tensão (VAC), azul = neutro VAC, verde e amarelo = GND (Terra/Terra), vermelho = Tensão Corrente Contínua (VDC) positiva, preto = VDC negativo. Os fios de dados são brancos, mas para facilitar sua identificação, nesta figura são mostrados em cor verde. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Caixa principal de junção da unidade eletrônica conectada ao bloco de gradiente de temperatura. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Montagem do bloco do gradiente de temperatura

1. Use selante adesivo para colar o material isolante na carcaça de aço inoxidável. Deixe secar durante a noite.
2. Insira os sensores e as hastes de aquecimento dentro do bloco de alumínio.
3. Coloque o bloco de alumínio dentro da carcaça de aço inoxidável, guiando os cabos por seus respectivos furos para conexão à unidade eletrônica.
4. Use as dobradiças para fixar a tampa isolante de aço inoxidável ao bloco.
5. Conecte o sistema de resfriamento ao bloco de alumínio.
6. Coloque o bloco do gradiente de temperatura no laboratório, garantindo que todas as conexões estejam seguras e funcionais (Figura 8A). Certifique-se de que o laboratório tenha uma mesa robusta com pelo menos 2 m de comprimento. Confirme que há acesso a conexões Ethernet e eletricidade. Uma temperatura ambiente controlada é desejada para o funcionamento ideal.

5. Construção do sistema de descarga

NOTA: A linha de lavagem foi projetada para padronizar as concentrações de_CO2 em cada frasco no início da incubação. Consulte a Figura 8B para visualizar o sistema de lavagem com o bloco de gradiente de temperatura.

1. Corte o tubo flexível de menor diâmetro em 10 pedaços, cada um medindo 15 cm de comprimento. Prenda uma agulha em uma das extremidades de cada um dos 10 tubos menores.
2. Corte o tubo de diâmetro maior em uma única peça medindo 1 m de comprimento. Coloque um tampão em uma extremidade desse tubo e conecte a outra extremidade ao condutor de ar ambiente no laboratório.
3. Meça e marque o tubo maior em intervalos de 5 cm ao longo de seu comprimento. A cada intervalo marcado, insira uma agulha conectada a um dos tubos menores.

Figura 8: Bloco de gradiente de temperatura. (A) Bloco de gradiente de temperatura instalado no laboratório com a tampa fechada e (B) aberto com o sistema de lavagem exibido. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Descrição da unidade de injeção do analisador de gás

NOTA: O analisador de gás deste sistema permite medir a concentração de_CO2 diretamente nos frascos de vidro de 60 mL. A faixa deste analisador de gás é entre 0 ppm e 10.000 ppm, com precisão de 0,04 ppm a 400 ppm. O analisador de gás vem com um kit de redução de fluxo que mede a uma taxa de 1,17 mL/s.

1. Modificar o tubo de injeção do analisador de gás adicionando um filtro externo de 0,45 μm e uma agulha de injeção (Figura 9).
   NOTA: O filtro de 0,45 μm foi adicionado como precaução adicional para evitar que a água entre no analisador de gás. A agulha tem tamanho de 18 g e dimensões de 1,2 mm x 25 mm. A agulha foi selecionada com base no diâmetro para minimizar danos aos septos de borracha dos frascos de vidro de 60 mL.
2. Conecte o tubo de injeção do analisador de gás à entrada de conexão do instrumento.
3. No final do tubo de injeção, conecte um conector Luer lock macho. Usando um tubo flexível com diâmetro interno de 1/4, fixe o travador Luer ao tubo de injeção. Depois, conecte o filtro de 0,45 μm usando um tubo flexível para fechar tudo herméticamente.
4. Na extremidade do parafuso do filtro de 0,45 μm, use um conector macho e outro fêmea para fixar a agulha com segurança.

Figura 9: Unidade de injeção do analisador de gás. (A) O tubo de injeção do analisador de gás. (B) Um filtro externo de 0,45 μm e uma agulha de injeção. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

7. Desenhar tratamentos para incubação

1. Selecione amostras de solo.
   NOTA: As amostras de solo escolhidas para este manuscrito demonstram a funcionalidade do protocolo e mostram o tipo de dados que podem ser coletados usando essa configuração.
2. Selecione uma faixa de temperatura para incubação em bloco, que é uma faixa definida pelo usuário de 0 °C a 90 °C.
   NOTA: A faixa de temperatura deste manuscrito era de 4 °C a 60 °C. Se o sistema for usado além dessa faixa, siga protocolos de segurança laboratoriais ao lidar com temperaturas altas ou abaixo de zero.
3. Planeje a randomização das amostras.
   NOTA: Para este manuscrito, as amostras foram randomizadas dentro do bloco de temperatura (posições A a D). Embora este estudo tenha inicialmente testado a randomização da leitura da amostra após a incubação, isso introduziu erros de rotulagem durante o processo de leitura. Portanto, uma ordem de medição consistente (ou seja, de altas para baixas temperaturas) foi priorizada.

8. Preparação de amostras para pré-incubação

NOTA: Para limitar mudanças nas comunidades microbianas do solo, as amostras devem ser incubadas frescas o quanto antes após a amostragem. No entanto, dependendo das restrições experimentais e da logística, as amostras de solo podem precisar ser secas ao ar para transporte e armazenamento antes da incubação. Neste manuscrito, um procedimento de secagem ao ar foi padronizado para processar amostras antes da incubação.

1. Peneira o solo fresco usando uma peneira de 2 mm. Deixe o solo peneirado secar a 40 °C por 24 horas. Esse solo seco ao ar pode ser armazenado até o processamento adicional.
2. Coloque a amostra de solo em uma lata de metal e misture cuidadosamente. Distribua o solo misturado em 22 frascos de vidro pré-rotulados de 60 mL. Usando papel de pesagem, adicione 3 ± 0,03 g de terra em cada frasco de 60 mL.
3. Usando uma pipeta, ajuste o solo para a capacidade desejada de retenção de água (WHC) com base no método do funil. Após ajustar o teor de água para o % alvo de WHC, registre o peso exato de cada frasco.
   NOTA: As amostras de solo selecionadas para este manuscrito foram ajustadas para 60% de WHC.
4. Tampe os frascos com algodão para permitir a troca de ar ambiente.
5. Pré-incube as amostras por 10 dias em laboratório com temperatura controlada a 20 °C.

9. Ajuste do WHC durante a pré-incubação

1. Após 7 dias de pré-incubação, registre o peso dos frascos e ajuste para o WHC alvo. Use uma pipeta para ser preciso e adicione água conforme necessário. Calcule a água a ser adicionada a cada frasco usando a Equação 1.
   Água a adicionar = peso_T0 (g) - peso_T7 (g) (1)
   onde o peso_T0 representa o peso do frasco no tempo zero e o peso_T7 representa o peso do frasco após 7 dias.

10. Inicialização do bloco de gradiente de temperatura

NOTA: O sistema de resfriamento é controlado usando o painel na frente do instrumento. O sistema de aquecimento é controlado usando o interruptor atrás do instrumento e uma interface online.

1. Siga as instruções do fabricante para LIGAR o sistema de resfriamento. Pressione o botão de energia uma vez (Item A, Figura Suplementar 2). Certifique-se de que os números de temperatura °C e rpm piscem com a mensagem DESLIGADO. Isso indica que o sistema está LIGADO, mas atualmente inativo.
2. Ative a bomba pressionando o botão OK/Pump (Item E, Figura Suplementar 2) e pressione o botão + ou - (Item G e F, Figura Suplementar 2) para ajustar a rpm para 3500. Antes de ativar o sistema de resfriamento, verifique se o nível do fluido está com luz verde (Item L, Figura Suplementar 2). Se o nível do fluido estiver vermelho, isso significa que não há agente refrigerante suficiente. Entre em contato com o gerente do laboratório ou consulte o manual do fabricante.
3. Ative o sistema de resfriamento pressionando Temperatura (Item B, Figura S2) e pressione os botões + ou - (Item D e C, Figura Suplementar 2) para ajustar a Temperatura para -1,6 °C. O ponto de ajuste (Item O, Figura Suplementar 2) deve estar piscando. Isso indica que o sistema de resfriamento ainda não está no ponto de restrição.
   NOTA: A temperatura definida no sistema de resfriamento não é a mesma que a temperatura dentro do bloco.
4. Ligue o interruptor atrás do bloco (Figura Suplementar 3). Certifique-se de que uma luz verde acenda Isso indica que o sistema de aquecimento está LIGADO, mas o controle de temperatura não está ativo.
5. Para ativar o controle de temperatura do sistema de aquecimento, abra a interface online do bloco de gradiente de temperatura digitando o endereço IP 10.75.117.227 em um navegador. Faça login com o nome de usuário e senha fornecidos para visualizar a temperatura de cada sensor (Figura Suplementar 4). Essa interface mostra os valores dos sensores, que são atualizados a cada 3 segundos.
6. Ajuste a temperatura de aquecimento definida para 60,00 °C pressionando as setas para cima/baixo . Pressione o botão LIGADO para ativar o sistema de aquecimento.
   NOTA: Leva cerca de uma hora para o bloco atingir um gradiente linear estável de temperatura.
7. Dez minutos depois que o bloco foi ligado, verifique o controle do aquecedor para garantir que está funcionando. O instrumento está funcionando quando a temperatura é diferente para cada sensor.

11. Configuração do analisador de gás

1. Seguindo o manual de instruções do fabricante , ligue o analisador de gás pressionando o botão de energia uma vez. Espere 45 minutos para o instrumento aquecer.
2. Conecte o PC à rede Wi-Fi do analisador de gás, identificada pelo nome de host único (TG15-XXXXX), e use a senha para se conectar.
3. Escreva o nome do host ou endereço IP em um navegador web e pressione enter para conectar. Depois, abra a seção de configurações e selecione reduzir vazão. Se a opção já estiver selecionada, não altere nada no software.

12. Preparando para carregar amostras

1. Ajuste o WHC seguindo a seção 6 do protocolo 1 hora antes de iniciar a incubação.
2. Verifique o controle do aquecedor para garantir que ele atingiu a temperatura desejada em 10 minutos antes de colocar as amostras no bloco.
3. Ligue o condutor ambiente localizado no laboratório.
4. Conecte o sistema de descarga e o analisador de gás ao computador.

13. Coletar cartuchos de festim

1. Registre os espaços em branco seguindo estes dois procedimentos:
2. Conecte a linha de lavagem ao sistema de injeção do analisador de gás e registre diretamente o_CO2 (em ppm) da linha de lavagem.
3. Coloque cinco frascos de vidro de 60 mL em um suporte vazio. Para cada frasco, coloque uma linha de descarga. Depois de 1 minuto, retire a linha de descarga e tampe o frasco. Espere quatro horas antes de medir o_CO2 dentro dos frascos.

14. Carregamento de amostras no bloco de gradiente de temperatura

NOTA: No bloco você terá as posições dos blocos A, B, C, D. Coloque a mesma amostra na mesma posição do bloco ao longo do bloco (Figura 10). Por exemplo, a amostra número 175 vai na posição do bloco A de 1 a 22, a amostra número 45 vai na posição B do bloco de 1 a 22, e assim por diante.

Figura 10: Posições do frasco dentro do bloco. A letra "S" indica sensor. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

1. Abra o bloco, coloque o computador e o sistema de descarga sobre a tampa do bloco (Figura 11). Sobre uma mesa móvel, coloque as caixas contendo as amostras.
   NOTA: Use uma máscara KN95 para minimizar a variabilidade do_CO2 nas amostras. Isso impede que o_CO2 da respiração contamine os frascos.
2. Prepare uma planilha para registrar o tempo de fechamento (hora: minuto) de cada frasco individual e, em paralelo, visualize o tempo do analisador de gás.
   NOTA: O tempo de fechamento de cada frasco é usado para normalização da taxa durante o processamento de dados.
3. Comece a carregar as amostras no bloco de gradiente de temperatura. Trabalhe em lotes de oito amostras. Coloque as amostras sem tampa dentro do bloco, começando pela extremidade mais fria. Isso significa que as primeiras oito amostras são A1, B1, C1, D1, A2, B2, C2, D2.
4. Coloque a linha de descarga em oito frascos e espere 1 minuto. Retire a linha de descarga e feche imediatamente os frascos. Em uma planilha, registre o momento exato em que cada frasco foi tapa.
   NOTA: Insira cuidadosamente a linha de lavagem em cada frasco, garantindo que não entre em contato com o solo. Isso previne contaminação cruzada e ajuda a manter a integridade da amostra.
5. Enquanto os primeiros oito frascos estão sendo lavados, coloque o próximo lote de amostras no bloco do gradiente de temperatura. Por exemplo, as amostras de lavagem são: A1, B1, C1, D1, A2, B2, C2, D2. O próximo lote de amostras a serem adicionadas são: A3, B3, C3, D3, A4, B4, C4, D4.
6. Coloque a linha de lavagem no próximo lote de amostras.
7. Repita esses passos até que o bloco esteja totalmente carregado.
8. Feche o bloco e espere 3,5 h a partir do momento em que a última amostra foi fechada.
9. Configure o analisador de gás para o modo de suspensão, pressionando o botão de energia duas vezes em até 3 segundos.
10. Desligue o sistema de descarga usando a válvula vermelha localizada na parede.

Figura 11: Configuração do bloco do gradiente de temperatura de carga. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

15. Começando com medições de_CO2

1. Tire o analisador de gases do Modo de Sono pressionando o botão de energia uma vez por 1h antes de começar com as medições de_CO2 . Verifique as configurações do analisador conforme indicado na seção 8.
2. Ligue o sistema de lavagem e coloque o analisador de gás sobre a mesa móvel (Figura 12).
   NOTA: A mesa móvel precisa ser alta o suficiente para que o sistema de injeção do analisador de gás alcance todas as amostras.
3. Verifique a seção de diagnóstico do analisador de gás (Figura Suplementar 5). Certifique-se de que o status do instrumento esteja verde para todos os componentes. Aqui, existem duas possibilidades:
   1. Se tudo estiver verde, comece a análise.
   2. Se houver componentes vermelhos ou amarelos, consulte o manual do analisador de gás e, se necessário, peça ajuda técnica. Se o erro for corrigido, então prossiga com as medições de_CO2 . Se o erro não for corrigido, pare o experimento.
4. Abra a seção de gráfico do analisador de gás para visualizar as medições em tempo real. Lembre-se de que o instrumento está constantemente medindo CO₂ do ar.
   NOTA: A exibição de medição está atrasada por ~3-5 segundos.
5. Após 3,5 horas de incubação, comece a medir as amostras. Começando pelas temperaturas mais altas. Por exemplo, as primeiras amostras a serem lidas são: A22, B22, C22 e D22.
   NOTA: Use a máscara KN95 ao medir amostras em temperaturas <15 °C. Isso reduzirá o ruído nos dados.
6. Conecte a agulha de injeção do analisador a uma linha de lavagem entre as amostras. Isso facilitará a limpeza de dados.
7. No topo da tela, há uma função REMARK no software do analisador de gás. Cada vez que uma amostra for medida, crie uma observação ÚNICA e SIMPLES . Não se esqueça de clicar em COMENTÁRIO antes de rodar cada amostra.
   NOTA: Use números únicos ou o ID único da amostra como OBSERVAÇÃO. Se for cometido um erro na OBSERVAÇÃO, anote o tempo em que a amostra foi medida. Por exemplo, anote as injeções tardias, se o REMARK foi encerrado antes ou tarde, etc.
8. Insira a agulha no frasco de amostra de 60 mL por 20 s. Depois desses segundos, retire a agulha do frasco.
   NOTA: O analisador de gás terá problemas de pressão se a agulha ficar dentro do frasco de 60 mL por mais de 38 segundos. Evite isso porque o analisador de gás vai parar de funcionar por alguns minutos, até que a pressão volte a se estabilizar.
9. Siga estes passos para ler amostras e as cinco cartas em branco com o analisador de gás:
   NOTA: Clique no botão COMENTÁRIO no software online do analisador de gás para começar e terminar uma observação.
   1. Comece a OBSERVAÇÃO em hh:mm:00.
   2. Insira a agulha no frasco em hh:mm:10.
   3. Tire a agulha do frasco em hh:mm:30.
   4. Pare o COMENTÁRIO em: hh:mm:45.
10. Troque o filtro de 0,45 μm conectado à agulha de injeção do analisador a cada 16 amostras. Esse filtro tem como objetivo capturar a umidade e evitar o entupimento dos filtros dentro do analisador.
11. Repita esses passos para todas as amostras.

Figura 12: Coloque o analisador de gás sobre a mesa móvel. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

16. Descarregando amostras do bloco de gradiente de temperatura

1. Uma a uma, retire amostras do bloco e coloque-as em uma caixa. Siga uma destas opções:
   1. Descarregando enquanto meço CO₂.
   2. Descarregando após medir a última amostra de_CO2 .
      NOTA: Selecione uma das duas opções com base nos requisitos para análise futura da amostra após a incubação em bloco ou no cronograma do laboratório. Por exemplo, a etapa 16.1.1 pode alterar a duração da incubação de algumas amostras, o que pode impactar os resultados das análises subsequentes. O cronograma do laboratório (por exemplo, horários de funcionamento e fechamento) também pode ser um fator limitante.
2. Processe e armazene amostras para análises futuras.
   NOTA: Neste caso, todas as 88 amostras foram preservadas após a incubação em bloco. Usando uma espátula, toda a amostra foi transferida do frasco de vidro de 60 mL para sacos plásticos pré-rotulados.

17. Baixando os dados

1. Para extrair os dados coletados com o analisador de gás, acesse o software online do analisador de gás. Clique em Configurações e depois clique no ícone de Download .
2. Selecione o horário específico em que a primeira e a última amostra foram medidas. Clique em Baixar.
3. Abra uma nova planilha, selecione Abrir Arquivo. Mude a busca de arquivos para Todos os arquivos (*.*) e procure pelo documento salvo na etapa anterior. Uma nova janela será aberta, depois seleciona Terminar.

18. Desligando os instrumentos

1. Desligue o analisador de gás com o botão de energia ou pela interface de software. Para desligar o instrumento com o botão, pressione o botão Desligar três vezes em até 5 segundos.
2. Desligue o sistema de resfriamento. Pressione lock (Item I, Figura Suplementar 2) e o botão OK/Pump (Item E, Figura Suplementar 2). O ruído branco deveria parar. Depois que o ruído branco desaparecer completamente, pressione o botão DESLIGADO no fundo.
3. Desligue o sistema de aquecimento. Desligue o sistema de controle do bloco do gradiente de temperatura usando o interruptor atrás do instrumento. Certifique-se de que a luz verde desligue (Figura Suplementar 3).

19. Conversão de_CO2 ppm em taxas de respiração em μg C por kg de solo por hora

1. Importar os dados do analisador de gás para o software de pós-processamento (usamos R) e extrair as seguintes variáveis: REMARK, TIME,_{CO 2} e H₂O.
2. Crie uma nova coluna para extrair os segundos de interesse, especificamente de >30 s a <35 s.
3. Remova quaisquer observações que tenham problemas relacionados à queda de pressão. Durante o experimento, quedas de pressão podem ter causado leituras de_CO2 ligeiramente menores do que o esperado. Essas pequenas quedas (entre 3% e 5% menores que o valor anterior ou seguinte) não são mudanças reais no CO₂, mas sim artefatos (erros) causados pela queda de pressão. Portanto, remova os valores de_CO2 que caíram ligeiramente (~3-5%) em comparação com o valor anterior ou próximo de_CO2 .
4. Calcule a concentração média de_CO2 (ppm) para os demais pontos de dados. Para cada amostra, subtraia a média dos cinco espaços em branco medidos.
5. Importe os dados do laboratório para um software de pós-processamento (por exemplo, R) e extraia as seguintes variáveis: REMARK, peso do solo seco e tempo de fechamento.
6. Para converter o_CO2 ppm medido pelo analisador em μg C por g de solo, aplique a Equação 2:
   
   onde a concentração de_CO2 medida pelo analisador de gás é expressa em ppm; O peso molecular do_CO2 é igual a 44,01 g·^mol-1; P é a pressão barométrica, igual a 1 e expressa em atm; R é a constante universal do gás igual a 0,082058 expressa em atm·^mol-1· ^K-1; o espaço de cabeça é calculado com base no espaço de carga dos frascos de vidro de 60 mL expressos em mL; T é a temperatura interna assumida do instrumento, igual a 293,15 e expressa em K; e o peso do solo seco é expresso em g.
7. Depois, divida pelo tempo de incubação expresso em horas e multiplique por 1000 para converter gramas em quilogramas de solo.
8. Por fim, converta o μg de_CO2 em μg de carbono usando os pesos moleculares de_CO2 e C. Isso resultará em taxas respiratórias expressas em μg C por quilograma de solo por hora.
9. Salve ou exporte os dados processados para análise posterior.

Resultados

Estabilidade e distribuição da temperatura do bloco
Durante o desenvolvimento desse protocolo, testamos a linearidade e a estabilidade temporal da temperatura dentro do bloco. Após ligar o sistema de resfriamento e o aquecedor, o tempo de inicialização do bloco é de aproximadamente uma hora, durante a qual a maioria dos oito sensores de temperatura distribuídos uniformemente atinge a temperatura alvo e permanece constante após um ultrapasso (Figura 13A). Após esse período, as temperaturas registradas pelos oito sensores confirmam uma distribuição linear perfeita da temperatura ao longo do bloco de alumínio (Figura 13B).

Figura 13: Linearidade e estabilidade temporal dentro do bloco do gradiente de temperatura. (A) Estabilidade temporal das temperaturas dentro do bloco durante o período de incubação, e (B) temperatura registrada pelos sensores no momento de início da incubação. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Temperatura do bloco e temperatura do solo
Testamos o tempo necessário para que a amostra de solo dentro do bloco atingisse a temperatura registrada pelos oito sensores (Figura 14). Neste estudo, medimos a temperatura das amostras de solo em oito posições diferentes dentro do bloco, localizadas próximas aos sensores. Os sensores, posicionados dentro do bloco, eram pré-estabilizados na temperatura alvo. Seguindo o protocolo descrito acima, uma vez que as temperaturas do bloco estavam estáveis, as amostras de solo eram colocadas dentro do bloco. Para este teste, usamos sensores extras que estão separados do bloco. Usamos 15 g de terra, garantindo que a sonda sensora estivesse em contato total com o solo. As amostras de solo foram deixadas sem tampo, e a temperatura foi registrada a cada minuto, totalizando 30 minutos. Durante esse teste, o bloco foi levemente fechado para minimizar a variação de temperatura e reproduzir o máximo possível as condições reais de utilização (completamente fechado). Descobrimos que leva aproximadamente 12 minutos para as amostras de solo se estabilizarem na temperatura alvo. Consideramos esse tempo de estabilização aceitável, dado que as incubações duram no mínimo 3,5 horas. Além disso, avaliamos a linearidade da temperatura do solo após 12 minutos de incubação em bloco. Os resultados indicam que as temperaturas do solo apresentam uma relação linear, alinhando-se de perto com a linearidade observada nos oito sensores (Figura 15).

Figura 14: Temperatura do solo registrada incubada em diferentes temperaturas. As amostras A, B, C e D foram incubadas em frascos posicionados próximos aos sensores correspondentes (veja a Figura 10 para referência). A temperatura do solo era registrada por um termopar inserido diretamente nas amostras de solo. As temperaturas específicas monitoradas por cada sensor são as seguintes: (A) Sensor 1 (S1) a 4,1 °C, (B) Sensor 2 (S2) a 12,5 °C, (C) Sensor 3 (S3) a 20,1 °C, (D) Sensor 4 (S4) a 28,1 °C, (E) Sensor 5 (S5) a 36,1 °C, (F) Sensor 6 (S6) a 43,8 °C, (G) Sensor 7 (S7) a 51,9 °C, e (H) Sensor 8 (S8) a 60 °C. Após colocar as amostras de solo no bloco, leva aproximadamente 12 minutos para atingir a temperatura alvo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 15: Forte correlação linear entre a temperatura do solo e a temperatura do sensor. Quatro frascos com solo foram colocados próximos aos oito sensores nas posições dos blocos A, B, C e D. A temperatura do solo era registrada por um termopar inserido diretamente nas amostras de solo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Interação temperatura-umidade
Há uma interação inevitável entre temperatura e umidade que precisa ser avaliada durante o período de incubação. Por exemplo, altas temperaturas podem acelerar a evaporação, enquanto baixas podem causar condensação de água. Para este teste, usamos quatro amostras de solo selecionadas aleatoriamente com diferentes texturas (Tabela Suplementar 2). De acordo com o protocolo, cada amostra de solo foi colocada na mesma posição do bloco em todas as 22 temperaturas. Os resultados mostram que, após um tempo médio de incubação de 3,5 h, temperaturas mais altas resultaram em maior perda de umidade em comparação com temperaturas mais baixas, independentemente da textura do solo (Figura 16). Solos incubados a 60 °C perderam em média 12% da água total adicionada, enquanto solos incubados a 4,1 °C perderam em média apenas 1,88% da água total adicionada. Isso significa que, durante as 3,5 horas de incubação em blocos, os solos foram mantidos dentro das condições ideais de umidade, entre 50% e 60% da capacidade de retenção de água, independentemente da temperatura de^{incubação 44,45} (Figura Suplementar 6).

Figura 16: Perda relativa de umidade do solo durante a incubação em bloco em quatro amostras diferentes. A perda de umidade foi calculada em relação à quantidade total de água adicionada para ajustar o WHC. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Medições de concentração de CO2
Para testar a precisão e exatidão do analisador de gases, realizamos quatro medições de um gás de referência certificado (413 ± 5 ppm CO₂), para as quais o analisador registrou 413,71 ± 0,60 (ppm CO₂, média ± SD). Isso confirmou a alta precisão e exatidão das medições de_CO2 registradas pelo analisador de gás. Além disso, para cumprir as especificações do fabricante, deve ser realizado um teste anual usando um gás de referência certificado.

Considerando o tempo de atraso causado pela linha de injeção e pelo kit de redução de vazão para o analisador de gás, múltiplos testes foram realizados para determinar o tempo ideal de medição. Os resultados mostram que a linha de injeção causa um atraso de aproximadamente cinco segundos. Nesse contexto, o tempo ideal de medição é de 20 s, permitindo tempo suficiente para preencher a unidade de detecção de CO₂ e alcançar um equilíbrio por 5 s (Figura 17). Considerando que o kit de redução de fluxo mede a uma taxa de 1,17 mL/s, esse tempo de medição corresponde à amostragem de 39% do conteúdo de ar nos frascos de 60 mL. Além disso, observamos que, quando o analisador de gás é usado como um sistema fechado, ocorre uma queda de pressão. Essa queda ocorre durante o intervalo de um segundo em que não há injeção de ar, enquanto a agulha é extraída do frasco. Para levar em conta essa queda de pressão durante o processamento de dados, excluímos valores de_CO2 que são ligeiramente menores (entre 3% e 5%) do que o valor anterior ou o próximo.

Figura 17: Tempo ótimo de medição para uma amostra individual de solo incubada em três temperaturas diferentes. Este gráfico mostra o tempo de injeção e extração da agulha, o equilíbrio do_CO2 por 5 s e a queda de pressão associada ao período de tempo selecionado. Incubation_ID mostra a posição do bloco (C) e as posições do frasco (5, 10 e 15). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Testando o protocolo completo
Para avaliar a funcionalidade e reprodutibilidade do protocolo, incubamos duas amostras diferentes, cada uma com quatro réplicas técnicas, entre 22 temperaturas discretas que variam de 4 °C a 60 °C. Essas amostras de solo foram escolhidas para demonstrar o tipo de dados gerados com esse sistema e seu desempenho. Características específicas da amostra podem ser encontradas na Tabela Suplementar 2. O bloco do gradiente de temperatura capturou de forma confiável as taxas de respiração do solo das diferentes amostras de solo em cada ponto de temperatura, permitindo visualizar a curva de resposta térmica. Além disso, as curvas de resposta à temperatura resultantes para todas as réplicas foram quase idênticas, como refletido pelo pequeno desvio padrão em torno das taxas médias de respiração em todas as temperaturas (Figura 18). Esses resultados demonstram alta reprodutibilidade e confirmam a precisão do protocolo.

Figura 18: Taxas representativas de decomposição SOM (Rs) para dois solos, cada um medido com quatro réplicas técnicas incubadas ao longo de todo o gradiente de temperatura. Os pontos representam a média das taxas de respiração em cada temperatura, e barras de erro indicam o desvio padrão entre réplicas técnicas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Um segundo teste foi realizado para demonstrar a aplicabilidade científica do protocolo. Medimos as taxas de respiração do solo ao longo de todo o gradiente de temperatura e ajustamos os dados usando o modelo Arrhenius ou MMRT (Figura 19). Essas amostras de solo foram escolhidas para demonstrar o desempenho do sistema para curvas de resposta à temperatura contrastantes (as características da amostra são fornecidas na Tabela Suplementar 2). Os resultados mostram que os dados coletados com o bloco do gradiente de temperatura podem ser analisados adicionalmente testando diferentes teorias sobre a sensibilidade à temperatura das taxas de decomposição da SOM. No entanto, surgem desafios ao trabalhar com solo fresco em qualquer experimento. Durante o período pré-incubação de 10 dias, observamos comunidades fúngicas crescendo dentro de alguns frascos em amostras de solo além do conjunto de amostras representativas. Apesar dos nossos esforços para remover cuidadosamente as comunidades fúngicas sem perturbar o solo, esse crescimento impactou os resultados de algumas amostras (Figura 20). Consequentemente, decidimos descartar as amostras afetadas removendo toda a amostra, não apenas os frascos individuais afetados pelo crescimento fúngico.

Figura 19: Resultados representativos e taxas de respiração (Rs) de quatro diferentes amostras de solo incubadas no bloco do gradiente de temperatura. A linha vermelha representa o ajuste de Arrhenius (A,B), e a linha azul representa o ajuste MMRT (C,D). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 20: Padrões de frequência respiratória de algumas amostras afetadas pelo crescimento fúngico. Esses resultados são exemplos de (A,B) duas amostras contaminadas que foram excluídas de análises adicionais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Circuito básico NO/NC. " C" também pode ser rotulado como "COM" para Comum. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Painel de controle do sistema de refrigeração. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Interruptor do sistema e indicador de luz. (A) Interruptor do sistema de controle do bloco do gradiente de temperatura; e (B) luz verde indicando que os sensores e o sistema de aquecimento estão LIGADOS. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Controle do bloco de aquecimento com gradiente de temperatura na interface online. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 5: Seção diagnóstica do analisador de gás. Tudo está verde, significa que o instrumento está pronto para medições. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 6: Capacidade de retenção de água dos solos incubados em diferentes temperaturas, medições registradas após 3,5 h de incubação em blocos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Instruções detalhadas de fiação. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Lista de materiais com a quantidade necessária. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Características das amostras de solo utilizadas no teste de perda de umidade e protocolo completo. Essas amostras foram escolhidas para demonstrar a funcionalidade do protocolo. A classificação de texturas segue o sistema USDA, com grosso, argila, silte e areia expressos em porcentagens. OC refere-se ao teor de carbono orgânico (g C·^kg-1 solo), pH foi medido em água, e CaCO₃ representa o teor de carbonato de cálcio (g·^kg-1 solo). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O uso de um bloco de gradiente de temperatura para medir a resposta térmica de curto prazo das taxas de decomposição da SOM apresenta desafios, especialmente na detecção de taxas respiratórias em baixas temperaturas. Baixas temperaturas podem inibir diretamente as atividades catalíticas das enzimas intracelulares e extracelulares^46,47. Portanto, o tempo de incubação deve ser longo o suficiente para garantir que as baixas taxas de respiração no extremo inferior da faixa de temperatura permitam um acúmulo suficiente de_CO2 nos frascos de vidro para se encaixar na faixa de detecção do analisador de gases. Nesse sistema experimental, a temperatura mais baixa foi de 4,1 °C; Essas amostras foram as primeiras a serem carregadas no bloco e as últimas a serem analisadas, proporcionando tempo extra de incubação. Os ~3,5 h de tempo de incubação em bloco foram considerados suficientes para produzir mudanças detectáveis na concentração de_CO2 nas amostras. Esse comprimento de incubação provavelmente depende do tipo de solo e, particularmente, do conteúdo de matéria orgânica. Por exemplo, pode ser que solos arenosos com baixo teor de matéria orgânica precisem de tempos de incubação mais longos do que solos ricos em carbono. No entanto, nos testes aqui, o tempo de incubação de 3,5 h foi geralmente suficiente para a maioria dos tipos de solo e níveis de conteúdo orgânico.

Além de otimizar o tempo de incubação para a detecção de CO₂ em baixas temperaturas, é igualmente importante minimizar a perda de umidade na extremidade superior do gradiente de temperatura. A umidade do solo desempenha um papel crucial no transporte, difusão e dissolução de substratos para comunidades^{microbianas 48}. Por exemplo, a umidade do solo pode limitar as taxas de respiração ao restringir a difusão do substrato em baixos níveis de umidade e reduzir a disponibilidade de oxigênio em níveis altos^{de umidade 45,49}. Assim, minimizar a perda de umidade em altas temperaturas é relevante para evitar que a umidade limite o acesso microbiano aos substratos. Embora os frascos desse protocolo fossem completamente selados, a água condensava nas tampas e nas paredes internas dos frascos. Essa condensação foi considerada como umidade perdida do solo. Assim, reduzimos o tempo de incubação de 4 horas, como em Robinson et al. 2017⁴¹, para 3,5 horas. Embora não tenha sido possível manter níveis de umidade completamente constantes em todos os tratamentos térmicos, os solos foram mantidos em níveis ideais de umidade durante o período de incubação de 3,5 horas. Mesmo em altas temperaturas, o WHC do solo permaneceu acima de 50%, garantindo que a disponibilidade de água não limitasse o acesso microbiano aos^{substratos 44,45}.

Outra consideração importante é a faixa de temperatura da incubação. Embora o sistema de resfriamento possa atingir temperaturas tão baixas quanto -30 °C e o sistema de aquecimento até 320 °C, o material isolante tem tolerância de -183 °C a 148 °C. Os frascos de vidro usados nesse sistema suportam 500 °C. Embora essas faixas sejam amplas, incubar amostras acima de 100 °C representa uma preocupação de segurança para o operador. Para evitar superaquecimento, foi adicionado um resistor térmico, garantindo que o sistema de aquecimento desligue automaticamente se o bloco de alumínio atingir 90 °C. A inclusão desse resistor térmico é crucial devido ao excesso de inicialização observado (Figura 13A). Se a temperatura durante a inicialização ultrapassar 90 °C, o sistema será desativado. Dadas essas limitações, recomendamos operar este sistema até uma temperatura máxima de 60 °C para desempenho seguro e confiável. Testes adicionais são necessários para incubar amostras de solo abaixo de 0 °C para garantir a detecção confiável de_CO2 , já que a condensação e a variabilidade de umidade associada podem afetar medições em temperaturas abaixo de zero. Para esse protocolo, escolhemos um limite inferior de temperatura de 4 °C, no qual não foi observada condensação. Se o sistema for usado em faixas de temperatura mais amplas, recomendamos a implementação de diretrizes adicionais de segurança térmica.

Outra possível limitação desse método é que o período de incubação relativamente curto não permite que as comunidades microbianas se adaptem às mudanças de temperatura. A resposta térmica dos solos expostos ao aquecimento sustentado tem sido o foco de muitos estudos, especialmente com o objetivo de testar as teorias de adaptação^microbiana 27,43,47,50,51. A adaptação microbiana foi proposta para explicar o efeito decrescente ao longo do tempo do aquecimento experimental nas taxas de respiração do^{solo 47}. No entanto, a metodologia apresentada aqui foi desenvolvida para medir a resposta térmica de curto prazo das taxas de decomposição da SOM. Embora a adaptação microbiana seja improvável de ocorrer em curtos períodos^{de tempo,} um estudo recente usou uma metodologia semelhante para quantificar a taxa de adaptação microbiana incubando solos a partir de um gradiente geotérmico. Neste estudo, a MMRT foi ajustada para estimar parâmetros-chave, incluindo os ótimos de temperatura e os pontos de inflexão. Ao comparar esses parâmetros entre os solos do gradiente geotérmico, os achados mostram que a taxa de adaptação microbiana é significativamente menor do que a taxa de aquecimento⁵². Este estudo destaca a importância de entender toda a curva de resposta térmica, especialmente capturando o ótimo de temperatura e os pontos de inflexão dos processos biológicos do solo (Figura 19C,D). À luz desses achados, recomendamos a amostragem de comunidades microbianas em múltiplos pontos de temperatura durante a incubação em bloco para avaliar como a composição e as funções das comunidades microbianas se correlacionam com as taxas de respiração e parâmetros de sensibilidade à temperatura.

O bloco de gradiente de temperatura descrito neste artigo oferece vantagens significativas em relação às metodologias tradicionais. Um grande benefício é que permite aos pesquisadores medir as taxas de decomposição da SOM de forma eficiente e precisa em 22 temperaturas distintas com pequenas quantidades de solo. Isso representa uma melhoria metodológica em comparação à incubação de amostras de solo em poucas temperaturas discretas, o que obriga os pesquisadores a aplicar o coeficiente de temperatura Q₁₀ – um método que muitos estudos desafiaram^{12, 13 e 15}. Outro benefício significativo é que essa configuração coleta dados que capturam claramente a forma e a inclinação da curva de resposta da temperatura. O número de tratamentos discretos de temperatura ao longo de um amplo gradiente de temperatura nos permite identificar a temperatura do ponto de inflexão e o ótimo dos processos biológicos, possibilitando comparações entre tratamentos. Os exemplos apresentados neste manuscrito apresentam dois padrões distintos (Figuras 19A, B vs. Figura 19C, D), que os pesquisadores podem analisar mais a fundo usando diferentes teorias de sensibilidade à temperatura. Alguns exemplos apoiam a teoria de Arrhenius, onde as taxas de reação aumentam exponencialmente com a temperatura (Figura 19A,B). Em contraste, outros exemplos se alinham com a teoria da MMRT, mostrando uma resposta unimodal com um ótimo claro de temperatura (Figura 19C,D). Esses dois padrões diferentes indicam que o protocolo de incubação em blocos de temperatura apresentado é capaz de reproduzir ambos os tipos de curvas de resposta, que podem ser usadas para testar teorias sobre a sensibilidade à temperatura das taxas de decomposição da SOM, aprofundando assim nossa compreensão da termodinâmica, biologia e química.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fusível de vidro de 630 mA	RS	563-637	https://uk.rs-online.com/web /p/fusíveis-cartucho/0563637?gb=s
Selante adesivo	Innotec	01.2451.0000	https://www.innotec.nl /producten/adheseal
Bloco de alumínio	Metaalketen	96082150.1	https://www.metaalketen .com/alumínio/
Fita de alumínio	Manutan	A159435	https://www.manutan.nl/nl/mnl/aluminiumtape -met-schutlaag-50565-50-m-x-50-mm-tesa -a159435?shoppingab=true& gad_source= 1& gclid=CjwKCAjw74e1Bh BnEiwAbqOAjE5Tw3-r3xiW 9FWALDZMlVUWpqJpQQ R_zwwXR8_R6Sb1Ce_8v x96jxoCtx4QAvD_BwE
Fio preto	RS	361-787	https://nl.rs-online.com/web /p/fio-conectado/0361787
Fio azul	RS	724-4392	https://nl.rs-online.com/web /p/fio-ligado/7244392
Fio marrom	RS	724-4395	https://nl.rs-online.com/web /p/fio-conectado/7244395
Prensa-cabos	RS	807-9786	https://nl.rs-online.com/web/p /cable-glands/8079786?cm_ mmc=NL-PLA-DS3A-_-goog le-_-CSS_NL_EN_Cables_% 26_Wires_Whoop-_-(NL:Who op!)+Cabo+Glândulas-_-807978 6& matchtype=&; aud-8271861 83926:pla-339598489905& gcli d=Cj0KCQiAw8OeBhCeARIsA GxWtUyscrqjF3FwA6j2jqUyeg_ s70tOXBRuYRF90pwubv3Po8v sbZSJhV4aAq84EALw_wcB& gc lsrc=aw.ds
Serra circular	Ryobitools	RWSL1801M	https://nl.ryobitools.eu/elektrisch-g ereedschap/zaagmachines/cirkelz agen/rwsl1801/rwsl1801m/?gad_so urce=1& gclid=Cj0KCQjw2ou2BhCC ARIsANAwM2Easx4PAZzvVYvFFUD ZKemTdqNDXsde_NDPSB8FAlGu7 8Hzy2j3TuoaAhTjEALw_wcB
Fechamentos	Kramp	HS491976	https://www.kramp.com/shop-nl/nl/p /verstelbare-haakvergrendeling-118- 128-tipo.3--HS491976
Agente de resfriamento e natural	Dijkstra Vereenigde	L035004186	https://www.laboratorium-apparatuur .nl/ika-rc2-green-basic-koelthermo staat-30-c-bad-volume-4-l035004186
DIN Rail	RS	648-5722	https://nl.rs-online.com/web/p/din-ra ils/6485722?cm_mmc=NL-PLA-DS 3A-_-google-_-CSS_NL_NL_Pmax _Test-_--_-6485722& matchtype=&; & g ad_source=1& gclid=CjwKCAjw8f u1BhBsEiwAwDrsjOqGDs92gjrJHkp SsYmOiS0OK6tC9U_fMHEhlmvu7r SbNp8VnmuDERoCC0UQAvD_ BwE& gclsrc=aw.ds
Pontes duplas	RS	803-7530	https://nl.rs-online.com/web/p/din-rail -terminal-accessories/8037530?sear chId=11c9702f-3312-4bb0-a826-e9D 50bd91ee1& gb=s
Cabo Ethernet	RS	657-2090	https://nl.rs-online.com/web/p/ cabo ethernet/6572090
Máscara facial	KN95	NA	https://www.bol.com/nl/nl/p/kn95- Máscara-Facial Descartável-FFP2-x-1-Máscara S-KN95-Wegwerp-Gezichtsmasker-FFP 2-x-1mondkapjes/930000000131403 0/? Referrer=NLGOOFS&; utm_source =google& utm_medium=free_shopping
Conector fêmea	qosina	17642	https://www.qosina.com/female- para-fêmea-luer-conector-lock-17642
Filtro 0,45 & micro; m	Whatman	10462650	https://us.vwr.com/store/product/1394 3097/whatmantm-puradisc-aqua-30-m m-seringa-filtro-0-45-m-whatman- produtos-cytiva
Isolamento flexível (mangueira)	Celsis	4600000198	https://www.celsisbv.nl/k-flex-plaati solatie-op-rol-st-10e-1x10mtr-10mm .-bl-s3-d0/4600000198?gad_source =1& gclid=Cj0KCQjw8MG1BhCoARI sAHxSiQknvLK3RcqgqXwR1Ma7V PznSz8IasKUGvLo0SySzLiff2o_kK Vjip0aAtATEALw_wcB
Tubo flexível	Avantor	MFLX06491-14	https://www.avantorsciences.com /de/en/product/38670173/bev-a- linha-v-transfer-pump-tubing
Kit de redução de fluxo	LICOR	7800-113	https://www.licor.com/support /Analisadores-de Traço-Gas/tópicos/re duced-flow-rate-kit-7800-113.html
Terminal do portafusível	Elektramat	401144228	https://nl.mouser.com/ProductD etail/Phoenix-Contact/3270200? qs=zdVlZaK%252BC241RFTPi Xj4mA%3D%3D& mgh=1& utm_i d=20328035028& gad_source=1 & gclid=CjwKCAjw8fu1BhBsEiwA wDrsjBg9elAMYS9bWJ1Bd086J 7fGBWvcRWZ51okdr2qJgOlOTd BdrUZ_rBoCvuUQAvD_BwE
Analisador de gases	LICOR	LI-7815	https://www.licor.com/env/ produtos/gás traço/LI-7815
Frascos de vidro com tampas 60 mL	Cole-Parmer	GZ-99535-25	https://www.coleparmer.com/i/ COLE-PARMER-PRÉ-LIMPO-EPA- vials-clear-glass-60-ml-72-cs/9953525
Fio verde/amarelo	RS	721-0636	https://nl.rs-online.com/web /p/fio-ligado/7210636
Alças	RS	456-539	https://nl.rs-online.com/web/p/ gaveta-maçanetas-armário-han dles/0456539
Varas de aquecimento	RS	860-6984	https://www.reichelt.com/nl/nl/shop /produto/verwarmingspatroon_hotr od_20_0x250_mm_1250_w_230_ v_-317248? PROVID=2809&; gad_s ource=1& gad_campaignid=22415 164764& gbraid=0AAAAADwnxtY mY6n2NPja4HF_ftn_kJY-U& gcli d=CjwKCAjwiNXFBhBKEiwAPSa PCaYMjfVMKQazvkQk_deE2koc XA9SZ_ltbPIefniuRsmzBwN_oQ rfQhoCegUQAvD_BwE
Dobradiças	RS	448-1497	https://benl.rs-online.com/ Web/P/Dobradiças/4481497
Mangueira	Wildkamp	750568	https://www.slangenboer.nl/wat erslang-cristal-al-961?channabl e=41cdee736b7500534230313 0353131333924& bg_source=ga & bg_campaign=21584331548& bg_kw=pla-293946777986-mi-1 09646330-pi-SB01051139-ppi- 293946777986& bg_source_id= 709628610149& gad_source=1 & gad_campaignid=215843315 48& gbraid=0AAAAADegGXwz 91MJFzGxBRxjCSRew10eG& gclid=CjwKCAjwiNXFBhBKEiw APSaPCZNCdBEfvnV2pYYPeV SQaiG_UKP0q_eknv0lC_N_0Y WIIZQvze8TEhoCzPUQAvD_BwE
Espinho de mangueira	Wildkamp	11000357	https://www.wildkamp.nl/pro duto/slangtule-RVs-316L-Lost-W AX-Buitendraad-X-Slangtule-BS P-X-10-0-MM/11000357
Agulha de injeção	Merkala	303262	https://www.merkala.nl/bd-mic rolance-injectienaalden-18g-ro ze-1-2x40mm-100-stuks.html? gclid=CjwKCAjw_Na1BhAlEiw AM-dm7DrC9mGkmpNN8krYe CmkvpEeSv4CuH3I2Px71KJxY YSm-vjVu2LclRoCwuwQAvD_BwE
Analisador de gás em tubo de injeção 1/4"	VWR	MFLX06491-12	https://us.vwr.com/store/pr Oduct/39537334/Bev-A-Line- V-Transfer-bomba-tubo
Material isolante	Technische Unie	3603842	https://www.technischeunie. nl/product/prd1899911190
Acoplamentos de joelho	Kramp	MMI9006K	https://www.kramp.com/shop-nl/ NL/P/Haakse-Koppeling-Instelbaa R-bu-BU-3-8-BSP--MMI9006K
Tubo de grande diâmetro 3/8"	Avantor	39213360	https://www.avantorsciences.co m/us/en/product/39213360/mast erflex-transfer-tubing-flexible- vinyl-avantor
Parafusos M6, Hex	RS	281-120	https://nl.rs-online.com/web/p/so cket-screws/0281120?srsltid=Afm BOorVGq-ZyA2yrJG1kU7SHGiZ EblaRz0nDmX7MwhzIRjcc6P4YIYE
Caixa principal de junção	RS	Confere Dia.	https://nl.rs-online.com/w eb/p/general-purpose-enclo sures/2896320?gb=s
Conector macho	qosina	12090	https://www.qosina.com/male- para-macho-luer-lock-connector-12090
Luer macho	Walternedical	BPC04M	https://www.waltersmedical.co. uk/product/nibp-connector-male-luer-slip/
MCB - Siemens SENTRON	RS	3RF2320-1AA02	https://nl.rs-online.com/we b/p/mcbs/2383188?gb=s
Alimentação PE/DND	RS	687-9411	https://uk.rs-online.com/we b/p/din-rail-terminal-blocks/ 6879411?searchId=c9a9c1 b1-3def-40d0-8b14-b792f8269615& gb=s
LED de Indicação de Energia	RS	909-2437	https://uk.rs-online.com/ web/p/pilotos/9092437?gb=s
Fonte de alimentação	Antratek	X-2902992	https://nl.rs-online.com/web/ p/din-rail-power-supplies/054 0731?srsltid=AfmBOoqMPIO Av7bZd1Qu_Acy3KMFR0-x OD_Hkw3NeQCYyzKJLzEGXzxQ
Pontes de condutor de quínopla	RS	803-6713	https://uk.rs-online.com/web /p/din-rail-terminal-blocks/80 36713?searchId=7de6627a- 3634-42ed-a600-2e3ce8974fe7&; gb=s
Fio vermelho	RS	361-822	https://nl.rs-online.com/web /p/fio-ligado/0361822
Terminal de Anel 2,5 mm²	RS	534-569	https://uk.rs-online.com/ Web/P/Anel-Terminais/0534569
Sensores	Antratek	X-DTS-S3C	https://www.antratek.nl/dig sensor-de temperatura ital-cabo-1m
Septa Red Butyl	HomeGreen	A255	https://www.homegreen.nl/la b-benodigdheden/septa-rood -butyl-20-mm?srsltid=AfmBO ooStonU5v9Q9j7i_RgQMJ9F m6ZVbPbIRU0cD1_47-BEVmb1r5I5
Passagem de condutor único	Elektramat	401167865	https://www.elektramat.nl/ catalogsearch/result/?q=401167865
Cabo de energia monofásico	RS	626-6694	https://nl.rs-online.com/w eb/p/power-cords/6266694?gb=s
Fio monofásico	RS	775-6123	https://uk.rs-online.com/web /p/power-cable/7756123?gb=s
Caixa de junção pequena	RS	498-5387	https://nl.rs-online.com/web/p /caixas de uso geral/4985387
Relé de Estado Sólido	RS	467-4762	https://nl.rs-online.com/web/p /relés de estado sólido/4674762
Broca em espiral	Ericks	10471300	https://shop.eriks.nl/nl/gereed schappen-verspanende-geree dschappen-boren-hss-en-hsse -boren-cilindrische-schacht/spir aalboor-din340-hsse-geslepen- type-ti-5-80mm-12592599/?srslt id=AfmBOoopMLgX1mtyuUxkU KU7jW4fYY1bY5wSTvSGQUkO zTc6E2wdxUZQ
Caixa e tampa de aço inoxidável	247 Tailore steel		https://247tailorsteel.com/nl/?ut m_term=24%207%20steel& utm _campaign=B+-+NL+-+247tailo rsteel+-+NL+-+Doelvertonings percentual+%3E+Conv.+Waa rde+met+Doel-ROAS& utm_so urce=adwords& utm_medium= ppc& hsa_acc=2007690635& h sa_cam=783787418& hsa_grp =118504886580& hsa_ad=67 1662182959& hsa_src=g& has _tgt=KWD-374862287021& HS a_kw=24%207%20steel& has _mt=p& hsa_net=adwords& has _ver=3& gad_source=1&; gclid= Cj0KCQjw8MG1BhCoARIsAHx SiQnhmktBk_3c_wobSJobrTVp4 _nqiW26Zt7XzSkHdK-htW8medy NCcQaAjbrEALw_wcB
Interruptor 2 vias	RS	746-9336	https://nl.rs-online.com/web/p /alças-comando-cam/7469336
Ponte terminal	Elektramat	401043503	https://www.elektramat.nl/phoenix-c ontact-doorverbindingsbrug-voor-rijg klem-2-polig-5-2-mm-rood-fbs-2-5/?c hannable=0141ac6964003330383936 ec& utm_source=google-superfícies&; utm _medium=organic& bg_source=ga& bg_ campanha=19011971421& bg_kw=-mi-9 214030-pi-401043503-ppi-& bg_source _id=&; gad_source=1&; gclid=CjwKCAjw 8fu1BhBsEiwAwDrsjE2kRcDZUHPupfy haLoTzWLqM9v8HKaiI67st4UOmUXIN 9OaI25ALRoCvmUQAvD_BwE
DAQ do termostato	Antratek	X-300-I	Temperaturaü Berwachung & Termostato (+X-DTS-S3C) von ControlByWeb (antratek.nl)
Fresadora Universal	Mach4Metal	MACH-ID 7580	https://mach4metal.com/en /fresadoras/cnc/fehlm ann-picomax-p54-2
Passagem de condutor Wago 3	RS	803-6713	https://nl.rs-online.com/web/ p/din-rail-terminal-blocks/80 36713?cm_mmc=NL-PLA-D S3A-_-google-_-CSS_NL_N L_Pmax_0525-_--803671 3& matchtype=&; & gclsrc=aw.d s& gad_source=1&; gad_campa ignid=22555696009& gbraid=0 AAAAADkeWNNXeREaDmJ5n yYqYMqp-c7A6& gclid=CjwKCAj wtfvEBhAmEiwA-DsKjilXxL8uO 4Jo6XyDesHGaQkoz6Ggi4ATI6 FUInWV9TxmIX519DGIZBoCh9 YQAvD_BwE
Conector Wago	RS	883-7557	https://uk.rs-online.com/ web/p/standard-terminal-b locks/8837557?gb=s
Manchas nas extremidades dos fios (100 pc)	Elektramat	401173609	https://www.elektramat.nl/solar -adereindhuls-geisoleerd-2-5mm 2-hulslengte-8mm-blauw-per-100 -stuks-1505145/?channable=014 1ac6964003430344a4& utm_source =google-surfaces& utm_medium =orgânico&; bg_source=ga& bg_c ampaign=17673967332& bg_kw= -mi-9214030-pi-401173609-ppi-& bg _source_id=& gad_source=1&; gclid= CjwKCAjw8fu1BhBsEiwAwDrsjNms VYTNZ5TuXEHtsF34hcY-T5kLFnhi zir1fUsR3UYcG9bxmugqJRoCp_Y QAvD_BwE