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Injeção intratecal lombar de SOD1-ASOs para direcionamento preciso do SNC e eficácia preditiva em camundongos humanos SOD1-G93A ALS

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DOI:

10.3791/69788

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24 de fevereiro de 2026

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1Biogen

Neste artigo

Resumo

Este artigo detalha métodos de administração intratecal para terapias direcionadas ao SNC em camundongos adultos, focando na precisão do protocolo e na possibilitade de injeções repetidas. Inclui descobertas de um estudo de validação em que oligonucleotídeos antissenso reduziram a expressão mutante de SOD1 em camundongos modelo SOD1-ALS, apoiando a utilidade da abordagem em pesquisas pré-clínicas sobre doenças neurodegenerativas.

Resumo

A administração intratecal (IT) de terapias voltadas para o sistema nervoso central (SNC) oferece uma rota minimamente invasiva para a entrega direta de medicamentos no líquido cefalorraquidiano (LCR), facilitando maior especificidade e engajamento do alvo. Embora a cateterização com TI seja padrão para parto prolongado em ratos, sua aplicação em camundongos é limitada por restrições anatômicas e risco elevado de complicações relacionadas a procedimentos, incluindo lesão e infecção na coluna espinhal. Para superar essas limitações, empregamos uma técnica aguda de punção por agulha para a administração de medicamentos IT em camundongos adultos, fornecendo uma alternativa reprodutível e menos invasiva, compatível com regimes de dosagem simples ou repetidos. Em um modelo transgênico de camundongo de esclerose lateral amiotrófica (ELA) que possui a mutação SOD1-G93A, alcançamos a entrega eficiente de TI de oligonucleotídeos antissenso (ASOs) direcionados ao gene SOD1. Essa abordagem reduziu efetivamente a expressão de SOD1 mutante e melhorou significativamente o fenótipo da doença, conforme demonstrado por avaliações eletrofisiológicas e de biomarcadores. Esses resultados validam tanto o método de administração de TI quanto a eficácia terapêutica, com desfechos comparáveis à administração intracerebroventricular (ICV). Mais importante ainda, a técnica espelha procedimentos utilizados em estudos clínicos em humanos, oferecendo forte relevância e utilidade translacional na avaliação pré-clínica de intervenções dirigidas pelo SNC. Embora seja necessária expertise técnica para garantir consistência e evitar efeitos fora do alvo, essa estratégia de entrega de TI representa uma metodologia robusta, reproduzível e clinicamente relevante para avançar o desenvolvimento terapêutico em modelos animais pequenos.

Introdução

Neste estudo, descrevemos um protocolo de injeção intratecal lombar (IT), comparamos com a administração intracerebroventricular (ICV) e avaliamos os resultados farmacodinâmicos e a tolerabilidade para orientar o desenvolvimento de terapias voltadas para o sistema nervoso central (SNC). Terapias direcionadas ao RNA, especialmente oligonucleotídeos antissenso (ASOs), representam uma modalidade promissora para doenças do SNC ao possibilitar a modulação pós-transcricional da expressão gênica. Essas abordagens são especialmente relevantes para distúrbios neurodegenerativos, onde a perda neuronal progressiva ressalta a necessidade de intervenções precisas, localizadas e oportunas para potencialmente modificar a progressão da doença. Aqui, comparamos diretamente a eficácia do protocolo de injeção de TI com a administração de ICV para terapias ASO.

Em estudos pré-clínicos, injeções intratecais lombares em camundongos adultos (machos ou mulheres, de 30 a 70 dias, peso de 13 a 20 g) foram usadas para administrar agentes farmacológicos ou vetores biológicos diretamente no líquido cefalorraquidiano (LCR) para o SNC que tem como alvo 1,2. Volumes de injeção de 5-10 μL são tipicamente administrados lentamente para limitar aumentos transitórios de pressão de LCR e refluxo, com acesso intratecal alcançado pelo espaço intervertebral L5-L6 1,2. O sucesso do procedimento depende de uma técnica cuidadosa para evitar lesões neurológicas, com a idade e o peso corporal influenciando o volume e o manuseio do LCR. O uso de agulhas de calibre fino (por exemplo, uma agulha de 27-30 G acoplada a uma seringa Hamilton de 25 μL) permite a entrega confiável2. Os principais desafios técnicos incluem minimizar as perdas de espaço morto, prevenir injeções incorretas e vazamentos epidurais, e reduzir a variabilidade dependente do operador, que pode impactar a precisão da dosagem e a distribuição do LCR.

Desenvolver terapias eficazes para distúrbios do SNC continua sendo um grande desafio devido à complexidade estrutural e à heterogeneidade celular do SNC. Essas características dificultam a entrega direcionada de medicamentos e restringem a biodistribuição entre múltiplas barreiras anatômicas e fisiológicas, exigindo estratégias especializadas de administração. Um obstáculo chave surge das barreiras fisiológicas e anatômicas em todo o SNC que restringem a penetração de drogas. O cérebro e a medula espinhal estão encapsulados em três camadas meníngeas: a dura-máter, a aracnoide mater e a pia mater, que, juntamente com a barreira hematoencefálica (BBB), fornecem uma defesa formidável contra terapêuticos circulantes e outras moléculas no sangue. Embora sejam vitais para manter a estabilidade do SNC, essas barreiras dificultam significativamente a entrega de grandes moléculas hidrofílicas, como ASOs, anticorpos monoclonais e vetoresvirais 1,2,3,4. A administração de TI oferece uma forma de contornar essas restrições ao introduzir terapêuticos diretamente no LCR dentro do espaço subaracnoideo. Essa via de entrega facilita a distribuição de medicamentos entre os compartimentos do SNC, promovendo uma penetração mais ampla nos tecidos e, assim, possibilitando o engajamento eficaz com alvos expressos em diversos tipos celulares dentro do SNC. Desde seu uso inicial por Hylden e Wilcox em 1980 para entrega de morfina emcamundongos 1, as injeções de IT tornaram-se um método mais amplamente utilizado para administrar uma variedade de agentes terapêuticos, incluindo pequenas moléculas, biológicos, vetores de terapia gênica e ASOs 5,6,7,8,9,10.

ASOs são oligonucleotídeos de fita simples engenheirados quimicamente projetados para se ligar a sequências complementares de RNA e modular a expressão gênica por meio de mecanismos como degradação mediada por RNase H, modulação por emenda e inibição estérica datradução 11,12,13,14,15. Aprimoramentos químicos como modificações na espinha dorsal fosforotioato, substituições de 2'-O-metoxietilo (2'-MOE) e resíduos de etil restritos aumentam sua estabilidade, afinidade de ligação e resistência anucleases 6. Essas propriedades têm apoiado sua aplicação na busca por genes patogênicos implicados em distúrbios neurogenéticos. Tratamentos baseados em ASO administrados intratecalmente demonstraram benefício clínico em doenças como atrofia muscular espinhal (SMA) e esclerose lateral amiotrófica (ELA)12,13,14,15. Por exemplo, Nusinersen (Spinraza) aumenta a inclusão do êxon 7 em transcritos SMN2 para compensar a perda de SMN1 em SMA 7,14. Estratégias semelhantes direcionadas a transcritos de huntingtina mutante também foram exploradas na doença deHuntington 12,13. Embora esses ensaios tenham sido encerrados no iníciode 2016, eles ressaltam o interesse contínuo em abordagens ASO dirigidas pelo SNC.

ELA é um distúrbio neurodegenerativo fatal caracterizado por degeneração progressiva tanto dos neurônios motores superiores quanto inferiores. A doença, que afeta entre 6 e 9 indivíduos por 100.000 no mundo e ocorre a uma taxa de aproximadamente 2 casos por 100.000 pessoas-ano, apresenta uma fraqueza muscular e espasticidade que agravam gradualmente, com a maioria dos pacientes sucumbindo à insuficiência respiratória neuromuscular dentro de 2 a 3 anos após o início dossintomas em 17 anos. Embora a maioria dos casos seja esporádica (SLA), cerca de 10% são familiares (FELA), oferecendo insights sobre os fatores genéticos da doença. Entre os genes mais estudados está a dismutase superóxida de/Zn 1 (SOD1), que representa quase 15 a 20% da fALS, menos de 2% da sALS, e é herdada de forma autossômicadominante 18. O SOD1 codifica uma enzima antioxidante citoplasmática que desintoxica espécies reativas de oxigênio ao converter radicais superóxidos em peróxido de hidrogênio. Formas mutantes de SOD1, como G93A, A4V e H46R, apresentam instabilidade conformacional, levando à agregação proteica e a um ganho tóxico de função que contribui para o estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e excitotoxicidade 19,20,21,22,23,24,25. Além disso, a patologia da ELA é agravada por mecanismos autônomos não celulares envolvendo microglia e astrócitos, que contribuem para um ambiente inflamatório crônico e lesão neuronalprogressiva 26,27,28,29. Silenciar a expressão de SOD1 usando ASOs, portanto, apresenta uma via terapêutica promissora para mitigar a patogênese da doença.

O modelo transgênico de camundongo SOD1-G93A (Cepa Jax #: 004435), que expressa a forma mutante humana G93A de SOD1 sob o controle do promotor endógeno humano SOD1, recapitula de perto as características clínicas da ELA, incluindo déficits motores precoces, neurodegeneração da medula espinhal e redução da sobrevivência30. Estudos pré-clínicos anteriores mostraram que administrar ASOs específicos de SOD1 por meio de parto intraventricular sustentado usando bombas osmóticas em ratos SOD1-G93A no dia pós-natal 65, com uma dose diária de 100 μg por 28 dias consecutivos, resulta em supressão significativa dos níveis de SOD1, redução das respostas neuroinflamatórias, surgimento tardio de sinais clínicos e melhora do desempenho motor.. Além disso, a redução mediada por ASO de SOD1 em pessoas vivendo com SOD1-ELA tem sido associada a reduções nos níveis da cadeia leve de neurofilamentos (NfL), um biomarcador sanguíneo indicativo de danoaxonal 32. Nesta investigação, administramos ASOs direcionados a SOD1 por meio de injeção de IT em camundongos SOD1-G93A e avaliamos seu impacto em leituras moleculares, eletrofisiológicas e de biomarcadores. A análise quantitativa do tecido da medula espinhal revelou reduções significativas nos níveis de mRNA SOD1. Avaliações eletrofisiológicas dos potenciais de ação muscular compostos (CMAPs) demonstraram preservação da função neuromuscular. Simultaneamente, os níveis séricos de NfL diminuíram, refletindo uma mitigação da lesão neuronal contínua.

Para avaliar a distribuição espacial e a eficácia relativa dos métodos alternativos de administração do SNC, incluímos um braço comparativo que utiliza injeção intracerebroventricular (ICV), no qual o agente terapêutico é introduzido nos ventrículos laterais para disseminação via fluxo de LCR ao longo dos espaços ependimam eperivascular 33. Ao comparar as vias de administração de TI e ICV, buscamos delinear diferenças nos resultados farmacodinâmicos e no direcionamento tecidual, refinando assim as estratégias de administração para terapias de ASO dirigidas pelo SNC. Além disso, para avaliar a viabilidade translacional, realizamos estudos independentes de tolerabilidade envolvendo até quatro injeções de TI por animal, espaçadas com oito semanas de intervalo. Em todos os esquemas testados, não foram observados sinais evidentes de sofrimento ou morbidade, apoiando a tolerabilidade da administração de ASO de TI no contexto da sobrevivência. Esses resultados são consistentes com relatos anteriores que demonstraram a tolerabilidade de injeções intratecais repetidas emcamundongos 34.

A relevância clínica da entrega de ASO em TI é ainda mais reforçada pelas recentes aprovações regulatórias do tofersen (QALSODY®) para a ALS35 associada à SOD1. Estudos clínicos demonstraram engajamento robusto do alvo, refletido por reduções na proteína SOD1 do LCR, seguidas por diminuições nos níveis da cadeia leve dos neurofilamentos, um biomarcador de lesão neuroaxonal. Embora o desfecho primário não tenha sido atingido no ensaio inicial de fase 3 do VALOR, análises integradas, incluindo a extensão aberta, sugeriram potenciais benefícios de iniciar o tratamentomais cedo 35.

Coletivamente, os dados aqui demonstram que a entrega de ASOs direcionados a SOD1 por TI no modelo de camundongo SOD1-G93A ALS alcança uma redução molecular eficaz, melhoria de biomarcadores e preservação funcional com tolerabilidade favorável. Esses resultados apoiam a entrega de ASO de TI como uma abordagem racional e clinicamente viável para doenças genéticas do SNC e fornecem uma estrutura pré-clínica robusta para o desenvolvimento translacional contínuo.

Protocolo

Todos os procedimentos aqui foram aprovados e conduzidos de acordo com protocolos aprovados pela IACUC e diretrizes institucionais de higiene química e biossegurança.
NOTA: Realizar estudos em camundongos transgênicos C57BL/6J (JAX #000664) e SOD1-G93A (JAX #004435) alojados sob condições padrão (ciclo claro/escuro de 12 horas, 22-24 °C, acesso ad libitum a alimentos e água).

1. Aplicação de ASOs quimicamente modificados para atingir SOD1 humano

  1. Empregar oligonucleotídeos antissenso validados (ASOs) para atingir especificamente os nucleotídeos 613-629 dentro da região não traduzida (UTR) 3' do gene SOD1 humano (RefSeq: NM_000454.5)36: A*GoToG*T*T*T*A*T*T*G*T*ToTo A*T*C
  2. Inclua modificações químicas validadas para aumentar a estabilidade e eficácia, incorporando MOE (2'-O-Metoxietil) (indicado na fonte comum), cEt (Etil Restrito) (itálico), DNA (negrito), ligações fosfatadas (o) e ligações fosforotioato (*), conforme relatadoanteriormente 36. O Arquivo Suplementar 1 apresenta a química da ASO com a correspondente codificação de cores.
  3. Prepare um ASO controle não direcionado, sem complementaridade aos genomas humanos ou roedores, seguindo o mesmo esquema de modificação para uso como controle: C*CoToAoT*A*G*G*A*C*T*A*T*C*AoGoGoA*A

2. Preparar e manusear soluções ASO sob condições estéreis

  1. Reconstituir ASO em líquido cefalorraquidiano artificial estéril (aCSF; Tabela 1) a uma concentração de 10 mg/mL sob condições estéreis, com o objetivo de um volume final de injeção de 10 μL (100 μg) por animal.
  2. Misture a solução suavemente usando uma pipeta estéril para manter a integridade molecular, depois faça um vórtice leve por 5-10 segundos para garantir que esteja bem misturada.
  3. Filtre a solução diluída através de um filtro de seringa estéril de 0,2 mm para remover partículas e contaminantes.
  4. Assépticamente aliquota a solução final em tubos de microcentrífuga estéreis e armazene a 4 °C em uma unidade monitorada e controlada por temperatura por até 1 semana, evitando ciclos de congelamento e descongelamento para manter a estabilidade.

3. Preparação do camundongo antes da injeção intratecal

  1. Pese cada camundongo até os 0,1 g mais próximos usando uma balança digital, depois transfira para um cone nasal e induza anestesia com isoflurano em uma concentração de 2-2,5% em oxigênio; Monitore a profundidade continuamente e confirme o plano cirúrgico pela perda do reflexo pedal.
  2. Prepare uma almofada térmica controlada por termostato e ajuste para 37 °C para apoiar os camundongos durante a preparação e recuperação.
  3. Aplique lubrificante oftálmico em ambos os olhos imediatamente após a indução da anestesia para evitar a dessecação da córnea. Em seguida, posicione o rato em reclinação ventral sobre a almofada térmica para evitar hipotermia, minimizar o estresse fisiológico e apoiar as funções cardiovasculares e respiratórias normais durante todo o procedimento.
  4. Administrar buprenorfina suspensão injetável de liberação prolongada (1,3 mg/mL) por via subcutânea a 3,25 mg/kg usando uma seringa estéril com agulha de 25-G e injetar 0,05 mL por 20 g de peso corporal antes do procedimento.
  5. Raspe a região lombar do meio do flanco até o cinturão pélvico, depois desinfete a área usando swabs alternados de álcool isopropílico e povidona-iodo, repita três vezes e deixe o local secar completamente ao ar.

4. Injeção intratecal direta

  1. Após a anestesia e a preparação do local cirúrgico, mova o rato para uma área de injeção limpa e coloque-o em reclinação ventral sobre a almofada térmica.
  2. Coloque o rato em uma posição que arqueie a coluna para facilitar a palpação e a injeção.
    1. Insira uma espátula curva sob o abdômen, no nível torácico inferior ao lombar superior para induzir uma leve flexão da coluna e alargar os espaços intervertebrais lombares entre a quinta e a sexta (L5-L6, preferida) ou a quarta e quinta (L4-L5) lâminas.
    2. Avance o bisel da agulha entre as lâminas para entrar na cisterna lombar e acessar o espaço subaracnoideo, evitando o contato direto com o osso para melhorar a segurança e a precisão da injeção.
  3. Estabilize o cinturão pélvico segurando suavemente o cinto pélvico entre o polegar e o indicador de uma mão e palpando a linha média dorsal com a outra para localizar o espaço intervertebral alvo entre L4-L5 ou L5-L6.
  4. Alinhe uma seringa estéril de insulina de 0,3 mL equipada com uma agulha de 29-G, 1/2 polegada, perpendicular à superfície dorsal da pele ou em um ângulo de 70-80°, com o chanfro orientado cranialmente. Avance a agulha até encontrar uma leve resistência ao penetrar na dura-máter, depois continue para o espaço intratecal.
  5. Insira de forma constante até que a ponta entre no espaço intratecal, confirmado por um reflexo de movimento da cauda indicando entrada intratecal bem-sucedida.
  6. Se houver resistência significativa ou não houver reflexo de movimento de cauda, retirar a agulha, reidentificar os marcos anatômicos e ajustar a posição da agulha antes de tentar novamente a injeção. Se a tentativa inicial foi realizada no espaço intervertebral L5-L6, execute a tentativa subsequente no espaço intervertebral L4-L5.
  7. Injete 10 μL da solução ASO lentamente (ao longo de 10 s) para minimizar mudanças de pressão e evitar refluxo de LCR. A agulha pode ser mantida no lugar por mais 10 segundos após a injeção.
  8. Retire cuidadosamente a agulha verticalmente e de forma suave para evitar danos nos tecidos e refluxo.
  9. Monitore o camundongo continuamente durante o período de recuperação, observando respiração, função motora, postura e quaisquer sinais de dor ou sofrimento.
  10. Certifique-se de que o rato recupere a mobilidade e o comportamento normais antes de devolvê-lo à sua gaiola.
  11. Documente todos os detalhes procedurais relevantes, incluindo o local da injeção, a dose de ASO, o volume da injeção e quaisquer observações comportamentais ou fisiológicas durante e após o procedimento, de acordo com os protocolos IACUC.

5. Monitoramento de camundongos e suporte à recuperação após a injeção

  1. Coloque cada camundongo em um compartimento individual ou bem espaçado dentro de uma câmara de recuperação pré-aquecida, mantida a 37 °C.
  2. Mantenha a temperatura da câmara controlada durante a recuperação da anestesia para evitar hipotermia.
  3. Monitore continuamente a frequência e padrão respiratório, postura e resposta a estímulos táteis.
  4. Observe o camundongo até que ele recupere o reflexo de endireitamento e demonstre movimentos coordenados.
  5. Evite superlotação para garantir visibilidade clara e evitar interferências.

6. Determinar critérios para o retorno à gaiola de origem

  1. Confirme que o mouse está estável com movimentos espontâneos coordenados.
  2. Certifique-se de que não haja sinais de sofrimento, incluindo respiração dificultosa ou irregular, vocalizações e falta de resposta prolongada.
  3. Ofereça suporte nutricional suave, como um suplemento de dieta em gel nutricionalmente completo, para ajudar a manter a hidratação e a ingestão calórica com esforço mínimo.

7. Realização de observação pós-recuperação de camundongos

  1. Verifique comportamentos normais como exploração, tosa e interação social caso os camundongos estejam em acolhimento.
  2. Monitore continuamente a aparência de sinais de recuperação anormal, como postura incomum, fraqueza ou paralisia, respiração irregular ou diminuição da resposta, e reavalie rapidamente se esses sintomas ocorrerem.
  3. Busque intervenção veterinária se a recuperação for atrasada ou comprometida.

8. Injeção intracerebroventricular no ventrículo lateral usando cirurgia estereotáxica e cuidados pós-operatórios

NOTA: Inclua um braço comparativo usando injeção intracerebroventricular (ICV) para avaliar a distribuição espacial e a eficácia relativa, entregando ASOs nos ventrículos laterais para disseminação mediada pelo LCR e comparação com a entrega intratecal. Realize as injeções de ICV de acordo com protocolos padronizados e bem estabelecidos paracamundongos 37.

  1. Anestesie o camundongo com isoflurano em concentração de 2-2,5% em oxigênio para imobilidade e posicione o camundongo em reclinação ventral sobre a bolsa térmica e, em seguida, administre buprenorfina suspensão injetável de liberação prolongada (1,3 mg/mL de buprenorfina cloridrato) por via subcutânea a 3,25 mg/kg usando uma seringa estéril de 1 mL com uma agulha de 25 g a 0,05 mL por 20 g de peso corporal antes do procedimento. Raspe o couro cabeludo do rato com uma máquina de cortar a cabeça.
  2. Realize todos os procedimentos cirúrgicos sob anestesia. Mantenha um campo asséptico estéril durante toda a cirurgia de VI. Use apenas instrumentos estéreis e manusee-os com cuidado para evitar contato com superfícies não estéreis.
  3. Fixe o mouse em um quadro estereotáxico com um console digital na posição padrão deitado. Coloque os dentes frontais na barra dentária do adaptador do camundongo para imobilizar a cabeça, depois fixe o adaptador com os tubos de respiração de inalação e exaustão que fornecem isoflurano. Insira as barras auriculares nas auscultadoras e aperte os parafusos para estabilizar firmemente a cabeça.
  4. Desinfete a área usando cotonetes alternados de álcool isopropílico e povidona-iodo, repetindo três vezes, e faça uma incisão na linha média com um bisturi estéril para expor o crânio. Use uma ponta de algodão estéril para remover tecidos moles e certifique-se de que a brema seja claramente vista.
  5. Marque a bregma no crânio. Posicione a seringa contendo ASO com agulha (26-G, 26s/2"/2, ponta) logo acima da bregma. Alinhe a agulha às coordenadas do alvo: AP -0,3 mm, ML ±1,0 mm, DV -3 mm a partir da superfície do crânio. Marque o crânio nas coordenadas AP e ML.
  6. Crie um orifício de rebarba nas coordenadas marcadas e depois use uma estrutura estereotáxica para baixar a agulha da seringa a uma profundidade de -3 mm a partir da superfície do crânio. Injetar a solução a uma taxa de 10 μL/min até que um volume total de 10 μL seja entregue. Após concluir a injeção, segure a agulha no lugar por 4 minutos e depois retire lentamente para minimizar o refluxo.
  7. Suture a incisão no couro cabeludo, coloque o camundongo em uma câmara de recuperação pré-aquecida a 37 °C até acordar totalmente e devolve-o à gaiola após confirmar a estabilidade. Forneça um suplemento nutricional completo de gel e monitore continuamente sinais de recuperação anormal, como postura incomum, fraqueza ou paralisia, respiração irregular ou diminuição da resposta; Reavalie rapidamente se algum desses sintomas ocorrer.

9. Avaliações eletrofisiológicas dos potenciais de ação muscular compostos (CMAP)

  1. Garantir que os experimentadores estejam cegos tanto para o genótipo quanto para o grupo de tratamento de cada camundongo para eliminar viés durante a coleta e análise dos dados.
  2. Anestesie o camundongo com isoflurano para imobilidade e conforto, mantendo a temperatura corporal em 37 °C.
  3. Confirme anestesia adequada garantindo a perda do reflexo pedal.
  4. Use eletrodos de agulha monopolar descartáveis de 28 G tanto para estimulação quanto para gravação. Insira o eletrodo de gravação 1 mm no músculo tibial anterior.
  5. Estimule o nervo ciático próximo à incisura ciática usando pulsos monofásicos de onda quadrada de 0,1 ms a cada 2 segundos, começando em 1,0 mA e aumentando em incrementos de 0,5 mA até que uma resposta supramáxima (tipicamente 1,5-3,5 mA) seja alcançada.
  6. Uma vez determinado o limiar supramáximo, registre as respostas CMAP a 0,5 mA acima desse nível. Meça a amplitude do CMAP (pico a pico) em 0,8 ms após o estímulo para excluir a latência e faça a média das amplitudes das pernas esquerda e direita para cada mouse.

10. Medição dos níveis séricos de pNFH

  1. Colete 100 μL de sangue total por punção da veia facial usando tubos capilares de coleta de sangue contendo ativador de coágulos e gel de separação sérica em pontos de tempo designados.
  2. Centrifuge amostras de sangue a 2000 g por 10 minutos a 4 °C para isolar o soro.
  3. Quantifique os níveis de cadeia pesada de neurofilamentos fosforilados séricos (pNFH) usando reagentes validados para imunoensaio para medição de pNFH em amostras biológicas em um analisador microfluídico totalmente automatizado de imunoensaio baseado em cartucho.

11. Isolamento de RNA e realização de RT-qPCR

  1. Pulverize os tecidos da medula espinhal cervical/torácica do camundongo usando uma esfera de aço de 6 mm em um moinho oscilatório oscilatório de alta energia programável criogênico para pulverização de amostras a 1.000-1.200 movimentos/minuto por 30-40 segundos.
  2. Homogeneize o tecido pulverizado (15 mg) usando esferas cerâmicas de 2,8 mm em lise e extração de RNA à base de fenol-guanidinium de 700 μL e reagente de extração de RNA usando um homogeneizador mecânico programado de alta velocidade baseado em esferas a 5,62 m/s por dois ciclos de 30 segundos.
  3. Extraia o RNA total usando o tratamento com DNase na coluna, seguindo as instruções do fabricante.
  4. Sintetize cDNA usando um sistema de reagente de transcrição reversa de alta capacidade para síntese de cDNA.
  5. Para a detecção de qPCR, projete conjuntos personalizados de primer/sonda para detectar o gene de interesse que vise o êxon 4 do gene SOD1 humano:
    Primer frontal (5′-TGGTGTGGCCGATGTGTCTA-3′),
    Primer reverso (5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′)
    sonda (5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGATCCCA-MGB/NFQ-3′)
  6. Use GAPDH do camundongo (ID do ensaio TaqMan: Mm99999915_g1) como gene de limpeza.
  7. Realize qPCR em um instrumento de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) de alto rendimento usando 20 ng de cDNA por reação, uma mistura master de qPCR baseada em sonda de ciclo rápido, espolvadores específicos para genes e sondas de hidrólise marcadas fluorescentemente para detecção de transcritos de manutenção (VIC/MGB) e alvo (FAM/MGB).

12. Análise estatística dos dados

  1. Os dados apresentados de medidas em vida (CMAP), pNFH sérico e análise de expressão gênica são médias ± desvio padrão (SD).
  2. Avalie a significância estatística entre médias de grupo usando ANOVA unidirecional, seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey, considerando p < 0,05 como estatisticamente significativo.
  3. Use softwares de análise estatística apropriados para gerar gráficos e realizar todas as análises, consistentes com as realizadas no estudo.

Resultados

Para caracterizar rigorosamente a precisão e eficiência da administração intratecal (IT) em camundongos adultos, realizamos primeiro experimentos fundamentais de validação utilizando o corante azul Evans (0,5%) como rastreador visual do fluxo de LCR e permeação tecidual. Camundongos adultos selvagens tipo C57BL/6J (cepa #000664; peso 25-30g) foram anestesiados com isoflurano (2-2,5%) em oxigênio para eliminar artefatos de movimento, e a região lombar foi preparada sob condições assépticas. As injeções de ITs foram realizadas por punção lombar no espaço subaracnoideo em doses ascendentes individuais de 20 μL, 30 μL e 50 μL para avaliar dose/volume e a relação intensidade da coloração. A colocação correta da agulha foi confirmada observando um movimento de cauda ou resistência negativa durante a injeção.

Em até 5 minutos após a administração do contraste, os camundongos foram perfundidos transcarricamente com soro salino tamponado com fosfato frio (PBS) para remover o contraste residual da vasculatura. As medulas espinhales eram então cuidadosamente extraídas e fotografadas sob iluminação padrão contra um fundo neutro. A inspeção visual revelou uma distribuição consistente e uniforme do azul de Evans dorsal a ventral em todos os camundongos que receberam corante. Volumes de injeção mais altos se correlacionaram com saturação intensificada do corante ao longo do eixo rostrocaudal, embora mesmo o camundongo injetado com o volume de 20 μL também tenha apresentado coloração robusta. Em contraste, camundongos que não receberam o corante azul de Evans (grupo controle injetado com soro fisiológico estéril) não apresentaram coloração visível ou coloração de fundo no tecido da medula espinhal (Figura 1). Esses achados demonstram que as injeções de TI em camundongos permitem a entrega rápida e reprodutível de solutos ao longo da medula espinhal. As limitações desses experimentos incluem a falta de avaliação quantitativa da distribuição do corante e a ausência de análise da distribuição do corante no volume de injeção de 10 μL usado para a administração do ASO. No entanto, a quantificação foi realizada em medições subsequentes de engajamento de alvos no nível de expressão gênica em camundongos humanos SOD1-G93A, utilizando análise específica de expressão gênica humana para SOD1. O volume de injeção de 10 μL usado em experimentos subsequentes para administração de ASO foi selecionado para garantir uma dosagem segura e bem tolerada em camundongos e espera-se que forneça exposição adequada ao SNC com base em estudosanteriores 38.

Com base nessa validação anatômica, avaliamos a relevância funcional da entrega de TI usando ASOs direcionados a SOD1 mutante, uma estratégia terapêutica validada em modelos SOD1-ALS. Camundongos transgênicos hemizigóticos SOD1-G93A, que possuem o gene mutante humano SOD1 , apresentam degeneração previsível dos neurônios motores e declínio neuromuscular, tornando-os um modelo pré-clínico estabelecido. Com 5 semanas de idade, antes do início sintomático, os camundongos receberam um único bolus de TI de um ASO específico para SOD1 em concentração de 100 μg em 10 μL. Essa dose foi selecionada com base em estudos de otimização anteriores realizados com administração de VI em camundongos, conforme relatado por McCampbell et al. (2018)36. Para comparar a eficácia entre a entrega de TI e a ICV, um grupo separado recebeu injeções de ICV da mesma dose de ASO usando entrega estereotáxica. Os controles receberam ASO Inativo (controle não direcionado) via rota de TI.

Cinco semanas após o tratamento (aos 10 semanas de idade), os camundongos passaram por testes de potencial de ação muscular composto (CMAP) sob anestesia leve de isoflurano. Registros de CMAP na musculatura dos membros posteriores, provocados por protocolos padronizados de estimulação do nervo ciático, revelaram preservação significativa da amplitude tanto em grupos tratados com TI quanto com ICV em comparação com controles inativos tratados com ASO (p < 0,0001 via ANOVA unidirecional com o teste post hoc de Tukey). Importante destacar que a preservação da amplitude não diferia significativamente entre os métodos de entrega de TI e ICV (p > 0,05), indicando proteção neuromuscular comparável (Figura 2A).

Para avaliar biomarcadores sistêmicos da integridade neuronal, os níveis séricos de cadeia pesada de neurofilamentos fosforilados (pNFH) foram medidos usando um ensaio eletroquimioluminescente altamente sensível. Amostras de sangue obtidas no período de 5 semanas pós-injeção demonstraram uma redução de >40% na concentração de pNFH em camundongos tratados com ASO em relação aos controles tratados com veículo (p < 0,0001), sem diferença significativa observada entre as modalidades de IT e ICV (Figura 2B). A resposta uniforme dos biomarcadores moleculares corrobora os dados eletrofisiológicos, sugerindo que a entrega de TI mitiga efetivamente os processos neurodegenerativos neste modelo de ELA.

Para avaliar o engajamento do alvo do SOD1-ASO em nível molecular, realizamos a PCR quantitativa por transcrição reversa (RT-qPCR) em tecidos dissecados da medula espinhal cervical e torácica. O RNA total foi extraído usando um protocolo baseado em colunas, garantindo alta pureza (A260/A280>1,8), seguido pela síntese de cDNA com priming aleatório de hexâmeros. A amplificação quantitativa por PCR, direcionada a transcritos humanos de SOD1, normalizada para GAPDH, revelou uma queda média de 60% após a entrega de TI e 35% após a entrega de ICV, ambos significativos em relação aos controles inativos de ASO (p < 0,0001 para ambos). A comparação direta entre rotas de entrega mostrou redução significativamente maior com a entrega de TI (p < 0,0001), indicando um engajamento mais eficaz do alvo na medula espinhal por meio do acesso direto à coluna (Figura 3). Estudos adicionais são necessários para avaliar o engajamento de alvos em outras regiões do SNC.

Coletivamente, esses dados abrangentes oferecem validação convincente das injeções de TI como uma técnica precisa, reproduzível e minimamente invasiva para entregar ASOs ao sistema nervoso central (SNC) em modelos murinos. A administração de TI demonstrou eficácia terapêutica equivalente à entrega de VI em um amplo espectro de medidas de desfecho, incluindo preservação sustentada da função neurológica (CMAP), normalização de biomarcadores relevantes para a doença (pNFH) e robusta redução molecular de transcritos humanos de SOD1 em regiões do SNC alvo. Esses achados ressaltam a versatilidade da entrega de TI como uma via clinicamente tradutível para terapias ASO voltadas ao SNC, oferecendo eficácia equivalente à ICV, mantendo a simplicidade procedimental e a redução da invasividade. Assim, a entrega de TI e ICV são abordagens igualmente viáveis para intervenções voltadas ao SNC, oferecendo flexibilidade em ambientes pré-clínicos dependendo da acessibilidade anatômica, viabilidade procedural e contexto terapêutico. Isso posiciona a entrega de TI como uma plataforma promissora de tradução para futuras terapias voltadas para o SNC. Para apoiar os esforços translacionalistas, sugerimos a realização de estudos pré-clínicos adicionais para avaliar a distribuição farmacocinética no líquido cefalorraquidiano, em várias regiões do SNC e na captação de células-alvo, utilizando técnicas como hibridização fluorescente in situ ou imunofluorescência.

Figura 1
Figura 1: Visualização da distribuição do corante azul de Evans após injeção intratecal em camundongos adultos. O Evans Blue Dye (0,5%) foi administrado por injeção intratecal direta (IT) em camundongos adultos para avaliar qualitativamente sua distribuição na medula espinhal. Três volumes diferentes de corante 20 μL, 30 μL e 50 μL foram entregues em grupos experimentais separados (n = 1 camundongo por condição de volume). Após a injeção, as medulas espinhales foram colhidas e lavadas para avaliar a penetração do contraste conforme avaliada pela intensidade da coloração ao longo do tecido. Imagens do tecido da medula espinhal mostram a extensão da dispersão do contraste associada a cada volume de injeção, demonstrando um aumento dependente do volume na cobertura e na intensidade da coloração em toda a medula espinhal. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2
Figura 2: A terapia com oligonucleotídeos antisentido direcionada a SOD1 restaura a função motora e reduz os níveis patológicos de neurofilamentos em camundongos. Camundongos transgênicos adultos SOD1-G93A receberam uma dose única de oligonucleotídeo antissenso ativo (SOD1-ASO) que mira SOD1 por meio de injeção intratecal (IT) ou intracerebroventricular (ICV) aos 5 semanas de idade, ou um ASO controle inativo via injeção IT. O impacto terapêutico foi avaliado às 10 semanas de idade, correspondendo a 5 semanas após o tratamento. (A) Registros de potencial de ação muscular composto (CMAP) foram obtidos para avaliar a função neuromuscular em animais tratados. Grupos tratados com SOD1-ASO (n = 5 - 6 por grupo) apresentaram uma reversão no declínio do CMAP em relação ao grupo controle, indicando recuperação funcional. (B) Níveis periféricos de cadeia pesada de neurofilamentos fosforilados (pNFH), um biomarcador da neurodegeneração, foram quantificados a partir do soro coletado na semana 10 (n = 5 - 8 por grupo). O tratamento com SOD1-ASO levou a uma redução significativa nos níveis circulantes de pNFH em comparação ao controle, sugerindo atenuação do dano neuronal associado à doença. Todos os dados são apresentados como média ± DS. A significância estatística foi determinada por meio da análise unidirecional da variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey, com valores p ≤ 0,0001 indicando diferenças robustas entre os grupos de tratamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3
Figura 3: A administração de SOD1-ASO suprime significativamente a expressão de mRNA de SOD1 humano na medula espinhal transgênica SOD1-G93A do camundongo. Para avaliar a eficiência de direcionamento do oligonucleotídeo antissenso (SOD1-ASO) direcionado por SOD1, administrado por injeção intratecal (IT) ou intracerebroventricular (ICV), foi analisada a seção cervical/torácica do tecido da medula espinhal de camundongos transgênicos SOD1-G93A eutanasiados às 10 semanas de idade (5 semanas pós-administração) para expressão humana de mRNA SOD1 usando reação em cadeia quantitativa da polimerase por transcrição reversa (RT-qPCR). Os níveis de transcritos de SOD1 em humanos foram quantificados e normalizados em relação à expressão no grupo inativo tratado com ASO. A figura mostra a mudança de dobra no mRNA humano de SOD1 (normalizado para GAPDH) para cada grupo de tratamento (n = 5-7 camundongos por grupo), destacando uma regulação substancial em resposta à administração de SOD1-ASO. Os dados são apresentados como média ± DS. As diferenças estatísticas entre os grupos foram determinadas por meio da análise unidirecional da variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey, com valores p ≤ 0,0001 indicando diferenças robustas entre os grupos de tratamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

ComponenteFWQuantidade de adição (por L ou kg)Unidades
Fosfato de Sódio Monobásico Diidrato0.034g
Dibásico Dibásico de Sódio Anidro1420.111g
Cloreto de sódio58.448.766g
Cloreto de potássio74.560.224g
Diidratado de cloreto de cálcio147.020.206g
Cloreto de Magnésio Hexahidratado0.163g
Água (Milli-Q)993g
Poloxamer 1880.01g

Tabela 1: composição de aCSF.

Figura suplementar 1: Posicionamento do camundongo para injeção intratecal lombar. Uma espátula curva ou scoopula colocada sob o abdômen flexiona a coluna, alargando o espaço intervertebral. A injeção tem como alvo o nível L4-L5 ou L5-L6, com alinhamento adequado ao longo do eixo medial da coluna, como mostrado. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Sequência e química da ASO. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A técnica de injeção intratecal direta (IT) apresentada aqui representa um método minimamente invasivo, porém altamente eficaz, para administrar agentes terapêuticos no sistema nervoso central (SNC), especialmente em modelos de pequenos roedores como camundongos. Esse procedimento de punção cega é tecnicamente desafiador, mas já se mostrou reproduzível e clinicamente relevante quando realizado por um injetor treinado. Esse método utiliza anatomia precisa e técnica eficiente para proporcionar acesso rápido ao SNC sem necessidade de cateterismo, uma simplificação importante com benefícios substanciais para a expansão de estudos pré-clínicos; No entanto, sua relevância translacional se beneficiará de uma avaliação quantitativa adicional e validação metodológicapadronizada 5,8,10.

Uma injeção bem-sucedida de TI depende de vários passos fundamentais. A preparação meticulosa dos animais é essencial: a anestesia é induzida primeiro em uma câmara e mantida com um cone nasal, seguida pela raspagem da região lombar e administração de analgésicos para garantir o conforto do animal. O posicionamento correto do camundongo é alcançado colocando uma espátula curva sob o abdômen, flexionando a coluna para alargar o espaço intervertebral (Figura Suplementar 1). O objetivo da injeção intratecal descrita aqui é posicionar o bisel da agulha dentro da cisterna lombar, avançando-a entre as lâminas no nível vertebral apropriado. O direcionamento preciso do espaço intervertebral entre as lâminas L4 e L5 ou, preferencialmente, entre as lâminas L5 e L6, é fundamental para acessar o espaço subaracnoideo 5,10. O espaço subaracnoideo, também chamado de espaço intratecal, situa-se entre o aracnoide e a piamater 39. Como a medula espinhal é mais curta que o canal vertebral, os segmentos caudais da medula espinhal estão localizados de forma mais rostral em relação aos seus níveis vertebrais correspondentes. Para evitar ambiguidades, os locais de injeção são designados pelo espaço intervertebral em vez do nível da medula espinhal. Notavelmente, existe uma variabilidade substancial na segmentação vertebral lombar em camundongos, tanto dentro quanto entre as cepas40. A injeção deve ser realizada ao longo da linha média da coluna para evitar desvio lateral, que pode resultar em paresia do membro posterior ou, em casos graves, paralisia devido a lesão da medula espinhal. Quando realizada no local anatômico correto, o risco de lesão direta da medula espinhal é mínimo. No entanto, permanece um pequeno risco de irritação ou dano na raiz nervosa, ressaltando a importância de treinamento adequado do operador e proficiência procedimental para minimizar os desfechos adversos. O reflexo tail-flick serve como um indicador útil da colocação bem-sucedida da agulha, permitindo que o injetor avalie a profundidade e evite penetrações superficiais ou excessivamente profundas. Essa técnica exige prática para ser dominada, exigindo um controle constante da profundidade, ângulo e volume de injeção para evitar refluxo e vazamento para os tecidos ao redor. Embora recomendemos manter o volume de injeção ≤10 μL, avaliamos até 20 μL sem efeitos adversos. Estudos anteriores identificaram um volume de injeção intratecal de 10 μL como ótimo para a administração demedicamentos 38. Embora isso represente 25-30% do volume total de LCR emcamundongos 41,42, o volume máximo tolerável de injeção intratecal em camundongos adultos foi relatado como 30μL 10. Volumes de injeção acima dos limites recomendados podem perturbar a dinâmica do líquido cefalorraquidiano (LCR), levando a alteração da pressão do LCR e a um risco aumentado de efeitos adversos. O volume total de LCR em camundongos é estimado entre 35-40 μL e gira de 12 a 13 vezes pordia 41,42, correspondendo a uma renovação completa aproximadamente a cada 1,8 h42,43. Considerando a rápida renovação de LCR e observações empíricas, bem como estudos anteriores que demonstraram o uso seguro de volumes de injeção intratecal de até 20-30 μL sem complicações, um volume de injeção de 10 μL não deve produzir efeitosadversos10,44.

A escalabilidade é uma vantagem significativa dessa técnica. Uma vez dominados, injetores treinados podem tratar de 10 a 12 animais por hora, facilitando estudos pré-clínicos maiores sem os encargos logísticos da implantação de cateter ou abordagens cirúrgicas mais invasivas. O procedimento evita instrumentação complexa, reduz o estresse animal e reduz os tempos de recuperação em comparação com cateterismo crônico, tornando-o adequado para estudos longitudinais que exigem dosagem repetida. Para simular os regimes clínicos de dosagem, validamos as administrações seriadas de TI em camundongos, administrando até quatro doses espaçadas com intervalos de oito semanas. Essas injeções foram bem toleradas, sem sinais de sofrimento, mudanças comportamentais ou sinais de doença, consistente com estudos anteriores que não relataram alterações significativas na dinâmica do LCR ou na arquitetura da medula espinhal após múltiplos tratamentos comTI 34,45. Assim, nossos estudos confirmam que a dosagem repetida de IT, com intervalos apropriados, é viável com paradigmas de tratamento humano, onde o engajamento sustentado do alvo é necessário para o benefício terapêutico. Na nossa experiência, essas injeções repetidas de TI foram realizadas com sucesso em uma ampla faixa etária de 5 a 29 semanas. Embora o aumento da idade e da massa corporal possa alterar levemente o acesso à medula espinhal devido ao maior tecido subcutâneo, a administração bem-sucedida ainda é possível com um operador experiente, experiente na técnica e familiarizado com a sensação da colocação da agulha. Observamos, no entanto, que vários fatores além do local de injeção e do volume do bolus, especificamente a velocidade de injeção e as propriedades físicas da solução injetada, como a densidade relativa ao LCR, podem influenciar substancialmente a distribuição dos solutos dentro do SNC. Embora esses parâmetros não tenham sido medidos ou manipulados diretamente no presente estudo, trabalhos recentes de Linninger et al. (2023) demonstram, por meio de um modelo farmacocinético mecanicista, que tais fatores afetam significativamente a biodistribuição e o direcionamento tecilar dos oligonucleotídeos antisentido (ASO)intratecais e o alvo do tecido 46. Assim, reconhecemos isso como uma limitação do nosso estudo e destacamos a velocidade de injeção e as propriedades da solução como variáveis importantes para futuras investigações visando otimizar a entrega do SNC e a relevância translacional. Juntos, esses resultados destacam a confiabilidade e viabilidade da dosagem repetida de IT em paradigmas pré-clínicos multidose, apoiando seu uso para engajamento sustentado de alvos e modelagem translacional de regimes terapêuticos humanos.

A abordagem de TI também oferece flexibilidade nos testes terapêuticos. Ele acomoda uma ampla gama de modalidades, incluindo ASOs, pequenas moléculas, peptídeos e vetores virais, permitindo a avaliação direta de intervenções direcionadas ao SNC. A capacidade de entregar volumes precisos e controlados de terapêuticos na cisterna lombar garante uma medula espinhal eficaz e uma exposição mais ampla ao SNC, ao mesmo tempo em que limita o excesso sistêmico. O reflexo tail-flick e outros sinais procedurais permitem a verificação em tempo real da entrega intratecal bem-sucedida, aumentando ainda mais a reprodutibilidade e reduzindo as taxas de falha experimental 5,6,8,47.

Estudos anteriores em camundongos SOD1-G93A mostraram que a patologia da doença afeta de forma mais proeminente a medula espinhal, especialmente a região lombar, do que no córtex29,48. Portanto, essa técnica é especialmente relevante no contexto da SOD1-ELA, uma forma genética de ELA causada por mutações no gene superóxido dismutase 1 (SOD1). Essas mutações produzem agregados proteicos SOD1 mal dobrados que levam a um ganho tóxico de função nos neurônios motores, levando ao declínio neuromuscularprogressivo 49,50. Neste estudo, empregamos ASOs direcionados para SOD1 para demonstrar o engajamento bem-sucedido com mRNA alvo e recuperação funcional. A análise RT-qPCR revelou supressão significativa dos transcritos SOD1 humanos na medula espinhal após a administração de TI, enquanto os registros CMAP indicaram reversão da disfunção dos neurônios motores. Além disso, a análise sérica mostrou uma diminuição nos níveis de cadeia pesada de neurofilamentos fosforilados (pNFH), um biomarcador da neurodegeneração, reforçando a eficácia da estratégia terapêutica.

A relevância clínica desse modelo é enfatizada pela recente aprovação da FDA do tofersen (QALSODY®), um ASO projetado para direcionar o mRNA SOD1 para o tratamento do SOD1-ALS35. Tofersen é administrado intratecalmente em pessoas vivendo com SOD1-ELA e demonstrou clara atividade farmacodinâmica, incluindo redução nos níveis totais de proteína do LCR SOD1 (marcador indireto de engajamento do alvo) e NfL plasmático (marcador de lesão axonal e neurodegeneração). Em análises integradas do estudo de fase 3 do VALOR e seu OLE, o início precoce do tratamento com tofersen esteve associado a reduções do declínio nas medidas de função clínica, força e qualidade de vida, bem como redução do risco de eventos equivalentes àmorte 35. Esses dados validam a via intratecal como uma via poderosa para a terapia ASO voltada para o SNC e conferem forte peso translacional a estudos pré-clínicos que empregam estratégias de administração semelhantes.

Além de sua utilidade na ELA, a via ITa demonstrou sucesso na atrofia muscular espinhal (SMA)14,51,52, onde o ASO Nusinersen (Spinraza®) administrado por TI foi a primeira terapiaaprovada 14,51,52. As injeções de TI contornam a barreira hematoencefálica e possibilitam a ampla biodistribuiçãodo SNC 53, que é crítica para doenças caracterizadas por patologia neuronal difusa. Embora a dosagem repetida apresente desafios logísticos e de tolerabilidade, os avanços nas técnicas de formulação e administração continuam tornando a administração de TI mais viável para tratamentos a longo prazo.

A administração de TI oferece maior relevância translacional para a prática clínica humana do que as injeções de ICV. As injeções de VI e ITO em camundongos adultos diferem principalmente na localização-alvo dentro do SNC e na distribuição e efeitos resultantes da substância administrada. As injeções de VI administram substâncias diretamente no líquido cefalorraquidiano (LCR) nos ventrículos laterais do cérebro, tendo como alvo principal os sítios supraespinhales. Em contraste, as injeções de TI administram substâncias no LCR dentro do espaço subaracnoide espinhal, tendo como alvo principal a medula espinhal. Embora ambos os métodos contornem a barreira hematoencefálica e permitam a entrega direta do SNC, a administração de TI pode levar a uma duração mais longa da ação54 para alguns compostos e normalmente resulta em uma transdução mais forte na medula espinhal, enquanto a ICV pode alcançar altas concentrações locais em regiões cerebrais adjacentes ao ventrículolateral 54. No entanto, é importante notar que compostos administrados ao LCR espinhal podem chegar ao cérebro, embora a taxa de transporte seja muitolenta 1. Essas diferenças também se refletem nos riscos processuais. As injeções de ICV apresentam um potencial maior de contaminação se a esterilidade for comprometida, enquanto as injeções de TI, embora não isentas de risco, apresentam menos vulnerabilidades relacionadas ao dispositivo. Após o procedimento, as injeções de injeção inflamada podem induzir desconforto transitório ou reações relacionadas aos membros posteriores, enquanto as injeções de VI estão associadas a um desconforto imediato menor, embora a irritação craniana local ainda seja possível.

As aplicações futuras dessa técnica vão além dos estudos pré-clínicos atuais. A entrega de TI pode ser utilizada para avaliar terapias de próxima geração voltadas para o SNC, incluindo ferramentas de edição genética (por exemplo, sistemas CRISPR/Cas), modalidades de interferência de RNA e terapias gênicas baseadas em vetores virais. A abordagem é adaptável para terapias combinadas que visam múltiplas vias do SNC, permitindo avaliação em tempo real das interaçõesfarmacodinâmicas 55,56. Além disso, a administração de TI pode ser integrada a modalidades de imagem para acompanhar a distribuição e o engajamento de alvos in vivo, acelerando os pipelines translacionais. A técnica também oferece uma plataforma para estudar estratégias de medicina de precisão em modelos de camundongos geneticamente definidos de doenças neurológicas, facilitando a descoberta de biomarcadores, avaliações funcionais longitudinais e avaliações de segurança antes da tradução clínica.

Em conclusão, a técnica de injeção direta de IT, utilizando anestesia isoflurana lombar, representa um método minimamente invasivo, rápido e clinicamente traduzível para administrar terapêuticos no SNC murino. Sua aplicação bem-sucedida em modelos SOD1-ALS e compatibilidade com dosagem serial fornecem uma base sólida para uma implementação mais ampla na pesquisa em neurociência translacional. À medida que o campo avança com crescente ênfase na modulação gênica do SNC, terapias direcionadas a RNA e medicina de precisão, a via da TI continuará sendo uma estratégia chave de entrega de medicamentos, unindo modelos pré-clínicos ao sucesso clínico.

Divulgações

SM e S-C L são atuais funcionários da Biogen, Inc., enquanto TC, DF, YL, JD e MZ são ex-funcionários da empresa. Os oligonucleotídeos antissenso discutidos neste artigo foram fornecidos aos autores pela Ionis Pharmaceuticals. Tofersen (QALSODY) é um produto desenvolvido em conjunto pela Biogen e pela Ionis Pharmaceuticals.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer à Ionis Pharmaceuticals por fornecer os ASOs descritos no artigo. Somos gratos a Ryan Gamble, Steve Garafalo, Adria Martig, Isabel Isaza, Taras Tuczkewycz e David Koske da Biogen por suas contribuições especializadas, que enriqueceram significativamente o manuscrito por meio de revisões substanciais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de insulina 0,3 mL 29 G, 1/2 polegada para injeção de IL-iSmiths Medical4429-3
Rebaba de broca estéril de 0,5 mm de diâmetroFerramentas Científicas Finas (FST), ou equivalente1900705
Sutura Monofilamento Prolene 5-0Ethicon 8870H 
Palitos de álcoolDynarex1203
Palitos de álcoolDynarex1203
Analgésico - Buprenorfina de liberação prolongadaReceita necessária
Clipper animalWahl08787-450A
Kit de Transcrição Reversa de CDNA de Alta Capacidade da Applied BiosystemsFisher Scientific43-688-14
Homogeneizador Ruptor de Contas 24Omni International, Inc.19-070
Coleta de sangue e tubos de separação séricaBeckton Dickinson (BD)365967
Diidratado de cloreto de cálcioJT Baker1335
Bomba digital de seringaAparato de Harvard70-4507
Sistema Imunoensaio Automatizado EllaR& Sistemas D600-100
Pomada para os Olhos-PuralubeDecra17033-211-38
Geno/MoedorSPEX SamplePrep2010
Esterilizador seco Germinator 500Braintree Scientific, ou equivalenteGER 5287-120V
Seringa Hamilton com agulha (26s/2"/2 (estilo pontiagudo)Hamilton8030026s/2"/2:                                                                                              26s: 26 G;                                                                                                             2" de comprimento;                                                                                                                             2: estilo de pontos
Mistura Homogeneizante de Tecidos Duros Cerâmica 2,8 mm (2 mL Tubos Reforçados) (50/pk)Fisher Scientific50-280-9286Fornecedor: Revvity Health Sciences Inc
Bolsa TérmicaK& Fabricação H1060
Plataforma ICVStoelting502063
Câmara isoflurana com sistema de escavanagemVetEquip901820
Cloreto de Magnésio HeahidratadoEMD Chemicals1.05832
Tesoura MetzenbaumFerramentas Científicas Finas (FST), ou equivalente14016-14
Mouse GAPDH TaqMan ID do ensaio Mm99999915_g1ThermoFisher Scientific4331182
Eletrodos de agulha para CMAP, 28 gNatus Medical (marca Teca)#902-DMF25-TP
NutraGel: Nutrição completaBio ServNGB-2
Suporte para Agulhas Olsen-HegarFerramentas Científicas Finas (FST), ou equivalente12502-12
Poloxamer 188Mutchler
Cloreto de potássioJT Baker3045
Pré-amplificador (para CMAP)Instrumentos de Precisão Mundial (WPI)SYS-DAM50
Kit pNFH ProteinSimpleR& Sistemas DSPCKB-PS-000519
Palhas de Provido-IodetoDynarex1201
QIAzol Reagente de Lise  Qiagen79306
Sistema QuantStudio 12K FlexBiossistemas Aplicados4471087
ScoopulaFisherbrand01-257-567
Signal v6.04Cambridge Electronic DesignNúmero de série 061144CMAP Software 
Câmara de recuperação de pequenos animaisUnidades Portáteis de Terapia Intensiva Animal Termocare Modelo FW-1FW-1 
Quadro estereotáxico de pequenos animais com console de exibição digitalKOPFModelo 940 
Sod1 G93AO Laboratório JacksonAção # 004435
Cloreto de sódioEMD Chemicals1.16224
Dibásico Dibásico de Sódio AnidroSigma Aldrich55136
Fosfato de Sódio Monobásico DiidratoSigma Aldrich3819
Bisturi descartável estérilMed Vet International, ou equivalenteMIL4410
Drapeado estérilDynarex4410
Compressas estéreis de gazeDynarex, ou equivalenteDRX-3354
Solução salina estérilThermoFisher Scientific14190094
Luvas cirúrgicas estéreisAnsell, ou equivalente20277290
Isolador de Estímulo (para CMAP)Instrumentos de Precisão Mundial (WPI)SYS-A365D
Micro Broca de Stoelting  Stoelting58610
Pinças curvas cirúrgicas (Pinças Graefe - Titânio)Ferramentas Científicas Finas (FST), ou equivalente11652-10
Pinças cirúrgicas para estreitos (Graefe Pinceps - Titânio)Ferramentas Científicas Finas (FST), ou equivalente11650-10
Fita cirúrgicaDynarex, ou equivalente3572
Seringa para injeção subcutânea de analgésicoBD309582
TaqMan Mixagem Master Avançada RápidaThermoFisher Scientific4444556
Água (Milli-Q)
BalançaMettler Toledo                                        Modelo XSR2002S23-112795
Camundongos selvagens C57BL/6JO Laboratório JacksonAção # 000664

Referências

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