Modulação dependente de ligante colinérgico do acoplamento de fosforilação oxidativa em células de neuroblastoma BE(2)-C permeabilizadas por digitonina

Summary

Apresentamos um protocolo para permeabilizar seletivamente a membrana plasmática, permitindo a entrega direcionada de substratos e inibidores para avaliar a fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) em células cultivadas, superando barreiras de transporte da membrana plasmática que normalmente dificultam essa análise. Usando essa técnica, demonstramos como a função do OXPHOS é modulada por agonistas muscarínicos e antagonistas.

Abstract

O objetivo deste estudo foi avaliar a função da fosforilação oxidativa (OXPHOS) em células cultivadas utilizando combinações definidas substrato–inibidor, mantendo a estrutura celular e o contexto citosólico perdidos em preparações mitocondriais isoladas. Como as células intactas são pouco permeáveis a vários intermediários do ciclo de Krebs, a avaliação direta da respiração suportada pelo substrato através de pontos específicos de entrada da cadeia de transporte de elétrons (ETC) é limitada. Para superar isso, aplicamos permeabilização seletiva de membrana plasmática mediada por digitonina e realizamos ensaios de acoplamento e fluxo de elétrons baseados em analisadores de fluxo extracelular em células neuroblastoma BE(2)-C. Para determinar a dependência do tipo celular, a digitonina foi titulada empiricamente em células HEK293 e neurônios primários do gânglio dorsal do rato (DRG) usando succinato + rotenona para isolar a respiração impulsionada pelo Complexo II–IV.

A respiração suportada por succinato com inibição do Complexo I mostrou aumento no consumo de oxigênio (O₂) impulsionado pelo Complexo II–IV em células permeabilizadas em comparação com células não permeabilizadas, consistente com melhor acesso de um substrato impermeável à membrana às mitocôndrias. Em contraste, a respiração suportada por substratos que entram por vias de transporte endógenas (por exemplo, piruvanato/malato) mostrou diferenças menores entre as condições. Usando essa plataforma para testar ligandos muscarínicos, observamos diferenças associadas a agonistas versus antagonistas no consumo de O₂ no ensaio de acoplamento, enquanto o ensaio de fluxo de elétrons revelou efeitos mínimos associados ao ligante nas condições testadas. Esses achados indicam que os efeitos detectáveis do ligando foram mais proeminentes no nível dos estados respiratórios definidos por acoplamento do que a capacidade máxima de transferência de elétrons. No geral, a permeabilização seletiva expande o acesso ao substrato em ensaios bioenergéticos de células cultivadas e permite a análise da modulação farmacológica da respiração mitocondrial.

Introduction

O mau funcionamento ou reprogramação do metabolismo energético mitocondrial é central para um amplo espectro de distúrbios, incluindo neurodegeneração, câncer, doenças inflamatórias, condições cardiometabólicas e diversos distúrbios genéticos. Para compreender melhor o papel do metabolismo mitocondrial na patogênese da doença, várias estratégias analíticas foram desenvolvidas. Essas incluem medições da taxa de consumo de_O2 (OCR), taxa de acidificação extracelular (ECAR), quantificação de ATP, utilização de substratos, perfilamento ou análise do metabólito do ciclo de Krebs, e rastreamento^{isotópico 1}. Entre essas técnicas, a OCR serve como um indicador-chave da respiração mitocondrial e pode ser avaliada usando instrumentos como Respirometria de Alta Resolução (HRR; por exemplo, Oroboros_{O 2}k)², eletrodo do tipo Clark ou o analisador de fluxo extracelular

O sistema Oroboros_O2k mede a concentração de_O2 em uma câmara selada usando o sensor polarográfico_O2 (POS) do tipo Clark ^(POS)3,4,5 e é adequado para amostras como mitocôndrias isoladas, células permeabilizadas e homogeneados teciduais. Consiste em um cátodo de ouro/platina, um ânodo de prata e um reservatório de eletrólito KCl separados da amostra por uma membrana de Etileno Propileno Fluorado (FEP) permeável e quimicamente resistente a 25 μm_O2. O eletrodo^{tipo Clark 3} também opera em uma câmara fechada, detectando mudanças na concentração de_O2 por meio de um eletrodo sensível ao_O2, e é comumente usado para mitocôndrias isoladas ou suspensões celulares. Em contraste, o analisador de fluxo extracelular quantifica OCR e ECAR em células vivas aderentes ou mitocôndrias isoladas usando sensores fluorescentes embutidos em microplacas, possibilitando um perfil metabólico de alta potência. Uma vantagem prática da plataforma de analisador de fluxo extracelular é a avaliação automatizada e multiparamétrica em múltiplas condições em paralelo, enquanto sistemas de câmara fechada (por exemplo, HRR ou eletrodos do tipo Clark) normalmente fornecem menor vazamento e exigem mais manuseio manual.

O analisador de fluxo extracelular é especialmente útil para avaliar a função mitocondrial em células aderentes intactas ou células em suspensão que se depositam na base da microplaca. Em ensaios usando células aderentes intactas, o metabolismo energético mitocondrial pode ser perfilado usando substratos como glicose ou^{piruvato 6}. Alternativamente, ensaios usando pequenas quantidades de frações mitocondriais enriquecidas permitem a medição sequencial da respiração basal, respiração estimulada por ADP (Estado 3), respiração em repouso (Estado 4) e respiração estimulada por desacoplador usando combinações de substratos e^{inibidores 7}. No entanto, em sistemas celulares intactos, os metabólitos do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) que não são permeáveis às células não podem ser usados para avaliar seu metabolismo diretamente. Enquanto mitocôndrias isoladas permitem o uso desses metabólitos devido à ausência de barreiras plasmáticas na membrana. A análise da abordagem isolada de bioenergética mitocondrial enriquecida apresenta limitações: a estrutura mitocondrial pode ser alterada durante o isolamento, e fatores citosólicos que influenciam o metabolismo mitocondrial e o transporte do metabólito são reduzidos ou ausentes. Assim, abordagens de permeabilização seletiva são frequentemente usadas como um compromisso que pode preservar aspectos da arquitetura celular enquanto permite o acesso controlado às mitocôndrias. Para superar as limitações de usar células intactas ou mitocôndrias isoladas para ensaios metabólicos, este protocolo descreve um método para permeabilizar células de neuroblastoma aderente (BE(2)-C) usando digitonina. Essa abordagem facilita a importação de metabólitos que normalmente não seriam permeses celulares através da membrana plasmática, mantendo respostas mitocondriais funcionais a substratos definidos e inibidores.

A seletividade da digitonina baseia-se em diferenças na composição lipídica da membrana: a membrana plasmática é rica em colesterol, enquanto as membranas mitocondriais — particularmente a interna — contêm muito pouco colesterol⁸. Em concentrações baixas, a digitonina (ou saponina) permeabiliza seletivamente e completamente a membrana plasmática devido ao seu alto teor de colesterol, enquanto as membranas mitocondriais são afetadas apenas em concentrações mais^{altas 9,10}. A digitonina se liga ao colesterol e forma poros na membrana plasmática, permitindo que pequenas moléculas como intermediários do ciclo TCA entrem no citossol sem perturbar a estrutura ou função mitocondrial quando devidamente otimizadas. Essa abordagem é mais adequada para células cultivadas que podem ser reprodutivelmente placadas como monocamadas aderentes em uma microplaca de analisador de fluxo extracelular e requer titulação empírica da concentração de digitonina para cada tipo celular e densidade de semeadura. Indicadores operacionais da preservação da integridade mitocondrial incluem respostas robustas e sensíveis ao inibidor do OCR (por exemplo, diminuições esperadas com rotenona/antimicina A e respiração contínua conduzida por IV Complexo com ascorbato/TMPD), além da ausência de colapso do OCR que sinalizaria superpermeabilização. Portanto, a otimização da digitonina deve ser realizada antes das comparações experimentais e repetida sempre que as condições da cultura ou a densidade celular mudam. Além disso, a concentração ótima de digitonina varia conforme o tipo celular e deve ser determinada empiricamente para estabelecer uma janela de permeabilização que permita a entrada de substratos impermeados (por exemplo, succinato) enquanto mantém a função mitocondrial sensível a inibidores. Neste estudo, ilustramos esse princípio otimizando a digitonina não apenas em células BE(2)-C, mas também em células HEK293 e neurônios primários do gânglio dorsal do rato (DRG).

Esse protocolo foi demonstrado usando células de neuroblastoma BE(2)-C, que foram originalmente isoladas do cérebro de um paciente masculino com neuroblastoma. As células BE(2)-C expressam vários receptores muscarínicos, particularmente o receptor colinérgico muscarínico tipo-1 (CHRM1). Em nossos estudos anteriores, demonstramos que o CHRM1 está associado a mitocôndrias tanto nos corpos celulares quanto nas neurites dos neurônios ganglionares dorsais de rato cultivados, bem como em células HEK293 transfectadas com^{CHRM1 11}. Além disso, a deleção genética de Chrm1 em camundongos altera múltiplos aspectos da estrutura e função mitocondrial^12,13. Portanto, hipotetizamos que as células BE(2)-C podem ser usadas para investigar os efeitos moduladores dos ligantes muscarânicos na função do OXPHOS. Nesta demonstração, examinamos os efeitos de agentes muscarínicos — incluindo o agonista acetilcolina, o antagonista tendencioso pirenzepina¹⁴ e o antagonista atropina — na respiração mitocondrial na presença de succinato ou piruvanato/malato como substratos e comparamos seu impacto.

Protocol

1. Descongelamento e placagem inicial

NOTA: O meio base para células BE(2)-C é uma mistura 1:1 de Meio Essencial Mínimo de Eagle formulado por ATCC e Meio F12, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).

1. Descongelar células BE(2)-C de um criovial em um banho-maria a 37 °C. Depois de descongelar, centrifuge as células por 200 × g por 5 minutos para remover o crioprotetor.
2. Ressuspenda o pellet celular em meio de crescimento completo e coloque as células em um prato de cultivo celular de 10 cm. Incube a cultura a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ no ar até que as células atinjam subconfluência.

2. Subcultura

1. Subcultura das células por 2–3 passagens para garantir que atinjam uma fase de crescimento exponencial estável.

3. Tripsinização e preparação de suspensão de célula única

1. Quando a cultura atingir 60–80% de confluência, tripsinize as células. Passe a suspensão da célula várias vezes por tubetas de transferência de ponta fina com pontas polidas para dissociar aglomerados e obter uma suspensão de célula única.
2. Adicione um fresco contendo FBS para neutralizar a tripsina. Centrifuge as células a 200 × g por 5 minutos para fazer pellets.

4. Protocolo de semeadura celular para microplacas de cultura celular de 24 poços usadas em analisadores de fluxo extracelulares

1. Resuspenda o pellet em meio completo a uma concentração final de 10.000 células por 100 μL por poço.
2. Semeie as células com densidade otimizada para garantir que atinjam a confluência total em 1–2 dias. Deixe os quatro poços de canto ou um único poço de canto vazios, dependendo do projeto experimental. Esses poços servirão como controles de fundo.
   NOTA: Isso pode exigir tentativa e erro, incluindo ajustes no volume e no tempo do meio.
3. Monitore a cultura para mudanças na cor do meio — amarelamento indica queda no pH e exige substituição imediata por meio fresco para manter a saúde celular.

5. Preparação para ensaio baseado em analisador de fluxo extracelular

NOTA: Os formatos de acoplamento e ensaio de fluxo de elétrons usados aqui seguem fluxos de trabalho estabelecidos de respiração mitocondrial baseados em^{microplacas 7}, com modificações que incluem permeabilização das células BE(2)-C usando titulação digitonina e condições de tratamento com ligantes muscarínicos.

1. Prepare soluções de estoque e 2x Solução de Ensaio Mitocondrial (MAS). Prepare 2 misturas MAS e soluções de reagente funcional (substratos e inibidores) (veja Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 3) com antecedência.
2. Armazene todas as soluções e MAS em estoque a -20 °C para uso futuro, permitindo uma instalação eficiente do ensaio.
   SEGURANÇA: Rotenona, antimicina A, oligomicina, FCCP, digitonina e TPDT são perigosos e devem ser manuseados de acordo com as diretrizes institucionais de segurança. Todas as soluções inibidoras devem ser preparadas e manuseadas em um exaustor químico certificado, enquanto se usa o equipamento de proteção individual adequado (jaleco, luvas de nitrilo e proteção ocular). Soluções contendo esses reagentes, assim como resíduos contendo DMSO, devem ser coletadas e descartadas como resíduos químicos perigosos, de acordo com regulamentações institucionais e locais. As superfícies de trabalho devem ser descontaminadas após o uso.
3. Hidratando o cartucho sensor
   1. Na noite anterior ao experimento, hidrate o cartucho sensor do analisador de fluxo extracelular adicionando 1 mL de tampão de calibração do cartucho do sensor ou soro salino tamponado com fosfato (PBS, pH 7,4) a cada poço. Deixe o cartucho sensor agir durante a noite (12–18 h) em temperatura ambiente (20–25 °C).
      NOTA: A incubação em uma incubadora sem CO₂ a 37 °C não é necessária, pois o cartucho se equilibrará à temperatura ambiente durante o processo de carga. Uma vez colocado no analisador de fluxo extracelular para calibração, o cartucho atingirá 37 °C em aproximadamente 15 minutos.

6. Dia do experimento

NOTA: Prepare todas as soluções frescas, ajuste o pH se necessário e mantenha no gelo até o uso.

1. Descongele estoques de substrato congelado e 2x MAS em temperatura ambiente (20–25 °C) por 15–30 minutos ou em banho-maria a 37 °C por 5–10 minutos.
2. Prepare todo o substrato e as soluções de injeção (veja Tabela 4, Tabela 5, Tabela 6 e Tabela 7) e verifique se o pH está em 7,4. Ajuste se necessário e mantenha as soluções no gelo até o uso. Use a Tabela 4 e a Tabela 5 para o ensaio de acoplamento. Para o ensaio de fluxo de elétrons, use a Tabela 6 e a Tabela 7.
3. Carregue os inibidores e substratos nas portas apropriadas do cartucho sensor e prepare-se para executar o ensaio. Dependendo do tipo de ensaio — ensaio de acoplamento ou ensaio de fluxo ^{de elétrons 7} — consulte a Tabela 4 e a Tabela 5 ou a Tabela 6 e a Tabela 7, respectivamente, conforme necessário.
4. Prepare todas as soluções de trabalho do substrato e inibidores para volumes finais definidos (misturas a granel: 15 mL; misturas de injeção de cartucho: 2 mL por porta). Calcule as concentrações para alcançar as concentrações finais desejadas no poço após a injeção (volume final do poço: 700 μL após a Abertura D).
5. Adicione 450 μL da solução preparada para ensaio a cada poço da placa de 24 poços do analisador de fluxo extracelular contendo ligantes muscarânicos (concentração final de ligantes: 1 μM; volume total do poço: 500 μL). Certifique-se de que cada poço já contenha 50 μL de 1x MAS buffer e células submersas.
   NOTA: Realize esta etapa imediatamente antes de carregar a placa no analisador.
6. Carregue 50 μL de cada reagente preparado na porta de injeção correspondente do cartucho sensor.

7. Programação de instrumentos e execução de ensaios

1. Ligue o analisador de fluxo extracelular pelo menos 1–2 horas antes do experimento para permitir que a incubadora interna se estabilize a 37 °C. Mantenha a câmara a 37 °C durante toda a calibração e a execução do ensaio.
2. Programe o analisador para realizar os ciclos de mistura, espera e medição adequados de acordo com a Tabela 8.
3. Rotule poços e grupos experimentais no software de acordo com o desenho experimental.
4. Comece a rodagem do ensaio. Deixe o instrumento calibrar o cartucho sensor (~15 min).
5. Prepare a placa de ensaio para carregamento durante a calibração do cartucho. Atrasar o carregamento se necessário; o cartucho sensor permanecerá estável a 37 °C dentro do instrumento.
6. Conclua o ensaio quando o ciclo final de medição após a injeção Port D terminar. Prossiga imediatamente para a normalização pós-ensaio e análise dos dados.

8. Preparação de placas celulares para ensaio com analisador de fluxo extracelular

1. Comece a preparar a placa de células imediatamente após colocar o cartucho sensor no analisador para calibração. Adicione 700 μL de 1x MAS buffer a cada poço contendo células aderentes. Incube em temperatura ambiente (20–25 °C) por 1 min.
2. Aspire cuidadosamente o tampão sem perturbar as células anexadas. Repita a etapa de lavagem por pelo menos 3 x 1 minuto para remover o substrato residual e complete todas as lavagens em até 10 minutos.
3. Adicione 50 μL de buffer MAS 1x a um poço de fundo designado (sem células) para estabelecer uma referência visual de volume.
4. Aspire o tampão de poços experimentais, deixando aproximadamente 50 μL de tampão residual em cada poço.
5. Incube a placa a 37 °C em banho-maria, mantendo a placa acima da superfície da água para evitar a evaporação. Mantenha a 37 °C por 10 minutos (máximo 20 minutos) antes de carregar.
6. Imediatamente antes de carregar a placa, adicione 450 μL de um tampão MAS 1x contendo os substratos apropriados em cada poço para atingir um volume final de 500 μL.
7. Insira a placa no analisador de fluxo extracelular.

9. Fim do ensaio e análise de dados

1. Remova a placa de células e o cartucho sensor do analisador após a conclusão da execução.
2. Normalize os valores de OCR por poço usando quantificação total de proteínas ou contagens totais de células. Lisar células com o tampão RIPA e quantificar a proteína total usando o ensaio de Bradford ou outro ensaio espectrofotométrico de proteína.
3. Normalize os valores de OCR usando o software de análise e exporte os dados conforme necessário.
4. Aplique os seguintes critérios de aceitação: confirmar a estabilidade basal do OCR (≤15% de deriva em dois ciclos consecutivos de medição) e confirmar ≥60% de redução do OCR após injeção de rotenona, oligomicina ou antimicina A.
5. Exclua as sequências que não atenham a esses critérios e reotimize a concentração do permeabilizador ou a densidade de semeadura celular conforme necessário.

10. Exportação de resultados

1. Insira um pen drive no instrumento.
2. Exporte os dados do ensaio.

11. Processamento de dados

1. Analise os dados usando o software do instrumento.
2. Exporte dados processados em formatos compatíveis com softwares de análise preferenciais para análise e visualização adicionais.

Results

Otimização da concentração de digitonina para permeabilização das células BE(2) C em ensaio de acoplamento
No início desse protocolo, padronizamos a concentração ótima de digitonina necessária para uma permeabilização celular eficaz sem comprometer a respiração mitocondrial. Neste protocolo, testamos 5 μM e 10 μM de digitonina como concentrações iniciais e realizamos um ensaio de acoplamento. Este ensaio avalia o grau de acoplamento entre o ETC e a maquinaria do OXPHO...

Discussion

Este estudo introduz um protocolo rápido e econômico para avaliar a modulação de OXPHOS mediada por ligantes muscarânicos em células de neuroblastoma cultivadas. Ao empregar o permeabilizador seletivo de membrana plasmática digitonina, em combinação com pares substrato-inibidor definidos, possibilitamos a entrega direcionada de substratos metabólicos como succinato diretamente às mitocôndrias in situ. Essa abordagem supera as limitações das membranas celulares intactas, que norm...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloreto de acetilcolina	MilliporeSigma	A6625	Agonista muscarínico
ADP	MP Biomédicas, Inc	ICN19014901	Aceitador de elétrons, substrato para síntese de ATP.
Antimicina A	AAJ63522MA	Termo Científica	Inibe o complexo mitocondrial III
Atropina	MilliporeSigma	1044990	Antagonista muscarinico
Células Be2C	Coleção de Cultura do Tipo Americano	CRL-2268	Uma célula neuroblasto isolada do cérebro de um paciente masculino com neuroblastoma, expressa receptor muscarínico
Digitonina	MilliporeSigma	D141	Detergente suave, permeável de membrana.
D-Mannitol	Termo-Química Científica	AA3334236	Um álcool de açúcar não metabolizável, usado para estabilização osmótica e proteção de membranas
EGTA	MilliporeSigma	E0396	Quelação de cálcio Previne a ativação de proteases dependentes de cálcio e outras enzimas que podem degradar proteínas mitocondriais.
BSA livre de ácidos graxos	MilliporeSigma	126575	Previne efeitos descontrolados de ácidos graxos e estabiliza as mitocôndrias
FCCP	Cayman Chemical	NC0904863	Um protonóforo e desacoplador da fosforilação oxidativa em mitocôndrias
HEPES	MilliporeSigma	391340	Amortecimento de pH, compatibilidade com a função mitocondrial
L-Ascorbate	TCI América	A053925G	Ciclo intermediário do TCA, substrato do OXPHOS
Cloreto de magnésio	MilliporeSigma	M8266	Para o equilíbrio iônico, suporte para atividade enzimática
N1,N1,N1,N1-tetrametil-1,4-fenileno diamina (TPDP)			Doador de elétrons para citocromo c, avaliação da função IV complexa bypassando os Complexos I e II, TMPD/ascorbato possibilita medição direta do consumo de oxigênio dependente do Complexo IV
Oligomicina	MilliporeSigma	1404-19-9	Inibe a síntese de ATP mitocondrial, Complexo V
Dicricloreto de pirenzepina	MilliporeSigma	P7412	Agonista tendencioso muscarinico
Ácido pirúvico	Termo-Química Científica	AC132155000	Substrato de ciclo TCA
Rotenone	MilliporeSigma	557368	Inibe o complexo mitocondrial I
Microplacas de cultura celular Seahorse XF24 V7 PS	Agilent	102340-100	Microplacas de Cultura Celular
Analisador Seahorse XFe24	Agilent	S7801BR	Os Analisadores Agilent Seahorse XFe24 medem a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de células vivas em um formato de placas de 24 poços.
Ácido succínico	Fisher Chemical	AC158742500	Ciclo intermediário do TCA, substrato do OXPHOS
Buffer de calibração de cartucho sensor XFe24	Agilent	102340100	PBS buffer pH 7,2
Cartuchos sensores XFe24	Agilent	102340-100	sensor para medição de OCR e ECAR