Perfil de Acessibilidade por Cromatina em Larvas Plenas de Caenorhabditis elegans L4

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo ATAC-seq rápido e simples a ser implementado em um verme inteiro de estágio L4 Caenorhabditis elegans usando apenas 30 μL de pellet de verme.

Resumo

A acessibilidade à cromatina desempenha papéis essenciais na transcrição, reparo do DNA e segregação cromossômica. Regiões hiperacessíveis geralmente se correlacionam com promotores e potenciadores ativos, facilitando a ligação dos fatores de transcrição e a atividade regulatória. O ensaio para cromatina acessível à transposase usando sequenciamento (ATAC-seq) permite o perfil genômico amplo da acessibilidade à cromatina com pouquíssimas células. No entanto, sua implementação em Caenorhabditis elegans é limitada pela rica cutícula de colágeno do nematoide, que complica a dissociação celular. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para realizar ATAC-seq em worms inteiros no estágio L4. O procedimento começa com culturas sincronizadas e envolve a perturbação da cutícula, dissociação enzimática e preparação para suspensão celular. Núcleos permeabilizados são então submetidos à transposição de Tn5, seguida por amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) e purificação de bibliotecas prontas para sequenciamento de próxima geração (NGS). Esse protocolo requer 30 μL de pellet de verme, pode ser concluído em um dia e gera de 5.000 a 9.000 picos de acessibilidade na cepa de referência Bristol N2. Esse fluxo de trabalho simplificado pode ser adaptado para outros estágios de desenvolvimento ou populações celulares purificadas por FACS. Ao reduzir barreiras técnicas ao ATAC-seq em C. elegans, esse método amplia as oportunidades para estudar a acessibilidade da cromatina em todo o genoma em resposta a perturbações genéticas e ambientais em um contexto de organismo inteiro.

Introdução

Os genomas eucarióticos são densamente compactados dentro do núcleo celular. Para lidar com restrições espaciais, o DNA é fortemente enrolado em nucleossomos, complexos multiproteicos compostos por oito histonas altamente conservadas em diferentes^{filos 1}. Os padrões de acessibilidade da cromatina variam dependendo do estado celular em um tecido, e padrões específicos de genes ^2,3,4. A acessibilidade aos nucleossomos está fortemente correlacionada com a transcrição ativa, especialmente em promotores e regiões regulatórias distais como potenciadores, que são acessíveis aos fatores^{de transcrição 5}. Regiões de cromatina aberta também desempenham papéis importantes na reparação, replicação e segregação cromossômica^{do DNA 3}. Em contraste, a redução da acessibilidade geralmente se correlaciona com heterocromatina silenciada e sequências^{repetitivas 6,7}.

Mapear a acessibilidade da cromatina tem sido uma abordagem poderosa para entender a regulação gênica. Diferentes técnicas foram empregadas para investigar a acessibilidade da cromatina. Entre os métodos mais antigos, a micronuclease microcócica (MNase) e a digestão DNase I foram usadas para mapear o posicionamento e a acessibilidade dos nucleossomos em loci^{específicos 8,9}. Essas técnicas foram posteriormente implementadas para estudos genômicos amplos quando combinadas com sequenciamento de próxima geração (NGS^)10,11. No entanto, essas técnicas exigem uma calibração cuidadosa da concentração enzimática e do tempo de reação, juntamente com um número substancial de células, para uma implementação bem-sucedida.

Em 2013, o laboratório Greenleaf estabeleceu o ensaio para cromatina acessível por transposase usando sequenciamento (ATAC-seq) para mapear perfeitamente a acessibilidade à cromatina em nível genômico amplo, utilizando um baixo número de^{células 12}. O ATAC-seq aproveita a transposase Tn5 comercialmente disponível para inserir preferencialmente sequências curtas de DNA (ou seja, códigos de barras) em regiões abertas de cromatina, tipicamente desprovidas de nucleossomos, e correlaciona-se com promotores e realçadores ativos. O protocolo requer permeabilização celular e isolamento de núcleos, seguido de digestão limitada com Tn5 para marcação de cromatina hiperacessível. Posteriormente, índices complementares são incorporados durante a PCR, facilitando a multiplexação da amostra antes da^{NGS 13}. O ATAC-seq provou ser um protocolo robusto que também permite a pegada do fator de transcrição in silico e foi implementado para resolução de célula^{única 14,15,16,17}. Além de amostras de camundongos e humanos, o ATAC-seq foi implementado em vários sistemas, incluindo peixes-zebra e invertebrados como Drosophila e o nematoide Caenorhabditis elegans 18,19,20.

Por décadas, o C. elegans tem sido um sistema modelo poderoso em áreas como desenvolvimento, biologia celular e neurociência, levando a descobertas seminais como a identificação de micro RNAs e a interferência de RNA (RNAi^)21,22. Possui um genoma compacto de 100 MB com ~20.000 genes codificadores^{de proteínas, 23}. A regulação gênica ocorre por meio da atividade do promotor, bem como de potenciadores distas, que foram mapeados via ATAC-seq em diferentes tecidos, estágios de desenvolvimento e pontos de envelhecimento^24,18. O perfil de acessibilidade da cromatina tornou-se, assim, uma ferramenta valiosa para entender a regulação gênica em C. elegans. Consequentemente, o ATAC-seq tem um potencial particular para estudar paisagens epigenéticas em diferentes condições ambientais ou isolados selvagens, a fim de descobrir respostas transcripcionais diversas. Além disso, pode fornecer insights sobre a arquitetura da cromatina de outros nematoides patogênicos e não patogênicos.

Um dos principais desafios metodológicos em C. elegans é a presença de uma cutícula rica em colágeno que precisa ser dissociada para obter uma suspensão celular homogênea a partir de vermes^{inteiros 25}. Para enfrentar esse desafio, compilamos e otimizamos diferentes protocolos para desintegrar os nematoides e então realizamos o ATAC-seq em C. elegans^18,26. O uso do estágio larvar L4 é preferível, pois animais nesse ponto de desenvolvimento possuem uma linha germinativa transcricionalmente ativa, que se traduz em cromatina aberta, fornecendo uma fonte consistente e informativa de acessibilidade à cromatina em células somáticas. Aqui, apresentamos um protocolo rápido e eficiente para dissociação de vermes e geração de suspensão celular, possibilitando o ATAC-seq em C. elegans. Nosso método é otimizado para vermes do estágio L4 e requer apenas 30 μL de pellet de verme, com potencial para adaptação para outros estágios de desenvolvimento ou para amostras menores, como células purificadas por FACS. Esse protocolo pode ser realizado em diferentes cepas e condições de C. elegans, permitindo a identificação de picos de acessibilidade de 5.000 a 9.000 de cromatina na cepa de referência Bristol-N2, estabelecendo as bases para análises subsequentes de acessibilidade da cromatina.

Protocolo

Recomenda-se usar luvas o tempo todo.

NOTA: Dia 1: Preparando a população sincronizada de vermes. Todas as minhocas foram cultivadas em placas NGM semeadas com E. coli OP50. Itens necessários antes de começar: (por amostra ou cepa), Uma placa(s) de verme adulta de 90 mm ou duas de 60 mm, Uma placa de 90 mm ou duas de 60 mm com comida, Tampão estéril M9²⁷ (3 g KH₂PO₄, 6 g_{Na 2HPO 4}, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO₄, H₂O a 1 L. Esterilizar por autoclav)

1. Coleta de vermes

1. Pegue uma placa de 90 mm (ou duas de 30 mm) com a população adulta do verme.
2. Recupere os vermes com o tampão M9 e transfira-os para um tubo centrífugo de 15 mL.
3. Repita a etapa anterior para recuperar todas as minhocas do(s) prato(s).
4. Deixe os vermes assentarem no tubo de 15 mL por um minuto e remova cuidadosamente o buffer M9.
5. Certifique-se de ter ~1 mL de vermes.

2. Descolorimento

1. Adicione 5 mL de tampão M9 + 650 μL de NaOH 5M + 1.300 μL de água sanitária doméstica (solução de 5% de NaClO).
2. Vórtice na velocidade máxima por 1–2 minutos (no máximo 2,5 minutos).
3. Centrifuge a 1.000 x g por 1 minuto em temperatura ambiente (RT).
4. Remova o sobrenadante e adicione 9 mL de buffer M9.
5. Repita as seções 2.3 e 2.4 mais cinco vezes.
6. Resuspenda os embriões em 7 mL de buffer M9.
   NOTA: O protocolo de branqueamento pode variar em eficiência dependendo da temperatura e do tipo de água sanitária comercial²⁸.

3. M9 (líquido) eclosão noturna dos ovos

1. Certifique-se de que o tubo de coleta com os ovos branqueados esteja devidamente fechado.
2. Coloque o tubo em movimento lento a 20 °C (por exemplo, em um shaker dentro de um cômodo a 20 °C).
3. Vermes eclodem durante a noite e se bloqueiam no L1.
   NOTA: Não deixe o tubo por mais de 12 horas.

4. Dia 2: crescimento de vermes: recuperação de vermes L1 .

1. Pegue o tubo do shaker e confirme ao microscópio que há vermes L1 .
2. Deixe o tubo assentar verticalmente por cerca de 1 hora na hora de descanso.
3. Remova o sobrenadante e transfira ~300 vermes L1 para uma placa de 90 mm ou duas placas de 30 mm com comida.
4. Coloque-os em uma incubadora a 20 °C e deixe-os crescer por 26 horas até alcançar o estágio L4.

5. Dia 3: Preparação das soluções padrão: As próximas soluções devem estar preparadas para produzir soluções novas no dia 4

NOTA: Isso pode ser feito no dia 2 ou 3.

1. 1 mL de SDS 10%.
2. 50 mL de 1M HEPES pH 8 (autoclave).
3. 250 mL de 20% de sacarose (autoclave).
4. 100 mL de NaCl 2M: prepare (autoclave).
5. 50 mL de 2M KCl (autoclave).
6. 10 mL de 1M_{CaCl 2} (autoclave).
7. 10 mL de 1M_{MgCl 2} (autoclave).
8. 100 mL de 1M Tris, pH 7,4.
9. 5 mL de NaCl 5M (autoclave).
10. 500 μL de 10% Tween-20.
11. 500 μL de 10% de Nonidet P40/IGEPAL.
12. 100 μL de digitonina 5% (precisa ser aquecido a 65 °C para se dissolver).
13. 500 μL de 10% de BSA (filtro com 0,22 μm) armazenados a 4 °C.
    Dia 4: Vermes do estágio L4 para ATAC
    NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter um incubador a 25 °C, uma centrífuga de 4 °C pronta, aqueça a Digitonina a 65 °C (para preparação de tampão fresco), tenha tampão M9 estéril, H2O estéreis e filtros de 20 μm.

6. Preparação da solução

1. Prepare soluções novas (veja a Tabela 1). Sempre manuseie L-15 com 10% de FBS e buffer de ovo em condições estéreis e mantenha-os frios.

Tabela 1: Estoques para preparação de soluções frescas. Receitas para preparação de estoque para dissociação de nematoides e protocolo de suspensão celular (seções 6 e 7). Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

7. Protocolo de dissociação de nematóides e suspensão celular

NOTA: Será necessário um ou dois discos de 90 mm ou dois de 30 mm com uma população sincronizada de minhocas L4.

1. Após 26 horas na incubadora a 20 °C, confirme ao microscópio que a maioria dos vermes está no estágio L4.
2. Recupere todas as minhocas das placas com o tampão M9 e coloque-as em um tubo centrífugo de 1,5 mL.
3. Lave 5 vezes com 1 mL de_H2Oestéril deixando as minhocas se estabilizarem pela gravidade.
4. Transfira o tubo com os vermes para uma incubadora a 25 °C por 30 minutos para eliminar restos de comida intestinal.
5. Pegue 50 μL do pellet de minhoca e coloque em um tubo novo.
6. Adicione 200 μL de novo tampão SDS-DTT e misture em um rotador de tubo por exatamente 5 minutos (não mais).
7. Adicione 1 mL de tampão frio para ovo e dê uma rodada em um picofuge para remover o sobrenadante. Repita 6 vezes.
8. Adicione 80 μL de pronase fresca preparada (15 mg/mL).
9. Com uma pipeta de 200 μL (com pontas filtradas), misture 70 vezes a mistura de vermes pronase e incube por 15 minutos em RT.
10. Adicione 800 μL de meio L-15 10% FBS e centrifuge por 5 min a 500 x g a 4 °C.
11. Adicione 1 mL de meio L-15 10% FBS e repita a centrifugação.
12. Repita o passo anterior mais duas vezes.
13. Remova o sobrenadante e re-suspenda em 900 μL de meio L-15 com 10% de FBS.
14. Filtre com um filtro de 20 μm.

8. Isolamento de núcleos e marcação por cromatina

NOTA: Use pontas filtradas com pipeta. Antes de começar: retire o tampão Tn5, deixe descongelar, ajuste um termobloco para 37 °C, retire o kit de purificação de produto PCR (Tabela de materiais), coloque o tampão EB a 37 °C, a centrifugação das colunas deve ser feita no RT.

1. Centrifuge a suspensão filtrada por 5 minutos a 500 x g a 4 °C.
2. Remova o sobrenadante, deixando ~50 μL.
3. Adicione 45 μL de Lysis Buffer (recém-preparado) e suspenda cuidadosamente novamente.
4. Adicione cuidadosamente 50 μL de Wash Buffer (não misturar).
5. Centrifuge por 5 min al 500 x g a 4 °C. Remova o sobrenadante. Mantenha no gelo.
6. Durante a rotação, prepare para cada reação (Rx) a seguinte mistura de Tn5 por amostra: 25 μL Tn5 Buffer²⁹, 24,8 μL Nuclease livre de H₂O, 0,2 μL da enzima Tn5. Prepare uma mistura master para múltiplas amostras.
7. Após a centrifugação, remova o sobrenadante. Mantenha os núcleos no gelo. Adicione 50 μL de mistura de Tn5 ao pellet de núcleos e pipete lentamente sete vezes. Incube a 37 °C por 30 minutos em um termobloco. Certifique-se de dar pequenos toques em cada tubo a cada 10 minutos.
   NOTA: Remova o kit de purificação PCR e coloque o EB Buffer em uma incubadora a 37 °C. Os próximos 5 passos usarão os buffers desse kit.
8. Após a incubação do Tn5, adicione 300 μL de buffer PB (amarelo) do kit e misture um vórtice na velocidade máxima por 25 s.
9. Pegue todo o volume do tubo e transfira-o para a coluna de rotação (roxa, armazenada a 4 °C) e centrifuge por 1 min na velocidade máxima em RT.
   NOTA: A coluna conterá o DNA, então o sobrenadante pode ser descartado com confiança.
10. Adicione 750 μL de PE Buffer à coluna de spin e centrifuge 1 min na velocidade máxima em RT.
11. Descarte o sobrenadante com o tubo de coleta. Coloque a coluna em um novo tubo de 1,5 mL e repita a centrifugação; descarte o tubo de 1,5 mL.
12. Coloque a coluna em um novo tubo de 1,5 mL rotulado e adicione 10 μL de EB Buffer a 37 °C no centro da coluna. Certifique-se de não tocar na coluna. Deixe no RT por 1 minuto.
13. Centrifugar por 1 minuto na velocidade máxima em RT; nunca a 4 °C.
14. Repita os últimos 2 passos para um total de 20 μL de elução no buffer EB.
    NOTA: Pausa opcional: Se parar, amostra(s) podem ser armazenadas a -20 °C. Aqui, a cromatina marcada está em um volume de 20 μL.

9. Amplificação de biblioteca

1. Para amplificação da biblioteca ATAC, é necessário realizar uma PCR em tempo real para estimar o número adequado de amplificação do ciclo (veja a Tabela 2). Faça isso em uma placa de PCR.
2. Para estimar os números de ciclo para a amplificação final, é necessário tomar o número de ciclo que corresponde ao primeiro terço da curva de amplificação. É ideal que o número de ciclo não ultrapasse 15. O número do ciclo deve ser estimado para cada amostra.
   NOTA: Após a qPCR, o DNA marcado está em um volume de 18 μL. Pausa opcional: Se quiser parar, as amostras podem ser armazenadas a -20 °C.
3. Amplificação final da Biblioteca ATAC:
   1. Cada amostra deve ter um primer diferente para RV (anote).
   2. Cada amostra deve ser amplificada para o número de ciclo (N) estimado para cada uma.
   3. Realize essa PCR em tubos de 200 μL (veja a Tabela 3).
   4. Aqui, há 8 μL de DNA marcado e 50 μL de bibliotecas ATAC amplificadas
   5. Pausa opcional: Se quiser parar, amostra(s) pode(s) ser armazenada(s) a -20 °C.

Tabela 2: Instruções para a primeira amplificação da biblioteca. Programa de receita e PCR para a primeira amplificação da biblioteca (seção 9). Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3: Instruções para a amplificação final da Biblioteca ATAC. Programa de receita e PCR para amplificação final da biblioteca (seção 9). Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

10. Purificação da biblioteca

NOTA: Antes de começar, retire as contas de seleção de tamanho (AMPure, SPRIselect ou bolas calibradas caseiras) da geladeira para que se ajustem à temperatura ambiente. Misture as esferas vigorosamente usando o vórtice toda vez antes de usar.

1. Prepare 1 mL de etanol 80% (grau molecular).
2. Adicione 25 μL (0,5 vol) de esferas ao tubo da amostra (onde há 50 μL) e misture com a pipeta.
3. Incubar em RT por 10 minutos.
4. Coloque os tubos no suporte magnético por 5 minutos.
5. Transfira o sobrenadante (70 μL) para um novo tubo limpo de 200 μL.
   NOTA: Nesta etapa, os fragmentos de DNA com <200 pb são descartados.
6. Adicione 65 μL (1,3 vol) de contas e misture 10 vezes.
7. Incubar em RT por 10 minutos.
8. Coloque os tubos no suporte magnético por 5 minutos.
9. Descarte o sobrenadante (sem tirar o tubo do suporte magnético).
   NOTA: Neste ponto, as contas contêm fragmentos de DNA de >200 pb e <1000 pb.
10. Com o tubo ainda na grade magnética, adicione 200 μL de etanol fresco preparado a 80% diretamente sobre as esferas e pipete várias vezes para lavá-las.
11. Remova o etanol e repita a lavagem com 200 μL de etanol.
12. Descarte o etanol, depois deixe as contas secar com a tampa aberta por ~2–5 minutos (não deixe secar demais).
13. Retire a(s) amostra(s) do suporte magnético. Resuspenda 50 μL de_H2Oestéril. Certifique-se de lavar todas as esferas das paredes do tubo.
14. Por fim, incube o(s) tubo(s) no suporte magnético por 5 minutos.
15. Transfira o sobrenadante para um tubo novo e limpo. Aqui, as bibliotecas ATAC amplificadas e purificadas são armazenadas.
    NOTA: As bibliotecas podem ser armazenadas a -20 °C por um curto período (até quatro semanas) ou por períodos mais longos a -80 °C.

11. Distribuição do tamanho dos fragmentos

1. Após a amplificação final, é recomendável passar parte da amostra por eletroforese capilar para poder ver o padrão de distribuição do tamanho dos fragmentos.

Resultados

O controle de qualidade após a marcação garante uma preparação precisa da biblioteca
Durante o protocolo, é importante prestar atenção especial à qPCR realizada após a marcação da cromatina (seção 9), pois é uma etapa vital para avaliar a qualidade do DNA e o desempenho do experimento. A Figura 1A mostra duas curvas de amplificação; A esquerda (com menos de 15 ciclos) representa um material de boa qualidade que mostra que tudo foi bem-sucedido até agora, então está tudo b...

Discussão

Aqui descrevemos um protocolo otimizado para perfilar a acessibilidade da cromatina em todo o genoma por ATAC-seq em vermes inteiros de estágio L4 de Caenorhabditis elegans . A acessibilidade à cromatina influencia diretamente a expressão gênica, reparo do DNA, replicação e recombinação, e embora o ATAC-seq tenha se tornado uma abordagem padrão para amostras celulares e de tecido, sua aplicação a organismos intactos apresenta desafios técnicos únicos, especialmente em nematoides...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
250 mL, 0.22 µm PES	Ultra Curz	sc-200253
Agar	BD	214010
Agencourt AMPURE XP	Nalgene	A63886
Bovine Serum Albumin	Maplica	200100
Calcium Chloride	Sigma	C5670-100G
CellTrics 20 µm	Sysmex	04-0042-2315
Cholesterol	Sigma	C8503-25G
Digitonin	Sigma	D141-500 mg
Disposable gloves	Microflex	94-243
DL-Dithiothreitol	sigma	D0632-10G	Nocivo
Ethyl alcohol, pure	Sigma	1003661421
Fetal Bovine Serum	biowest	S181S-500
HEPES	Sigma	H3375-250 G
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)	Illumina	20034211
Kapa Syber 50 mL	Sigma	KK4618
L-15 Medium (Leivobitz)	sigma	L4386-10L
Magnesium Chloride anhydrous	Sigma	M8266-100G
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma	M1880-500G
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma	M1880-500G
MinElute PCR Purification Kit (50 preps)	Qiagen	28004
NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master Mix	NEB	M0541S
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74835-1L
Pen Strep	Gibco	15140-122
Peptone	BD	211677
Petri dish 60 mm	Tritech	T3308
Petri dish 90 mm	Interlux	C9015-2C
Pipet tips 10 µL, filter	Cellpro	800108
Pipet tips 20 µL, filter	Cellpro	800708
Pipet tips 200 µL, filter	Cellpro	800608
Potassium Chloride	Sigma	P9541 -500G
Potassium Phosphate Dibasic Powder	J.T. Baker	3252-01
Potassium Phosphate Monobasic, Crystal	J.T. Baker	3246-01 500G
Sodium Chloride	JT Baker	3624-01
Sodium dodecyl sulfate	sigma	L4509-100G
Sodium Hydroxide	Macron	7708-10
Sodium Hypochlorite	Cloralex	544394479
Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated Crystal	J.T. Baker	3824-01
SPRIselect	Beckman	B23318
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Syringe Filter PVDF 0.22 µm	Ultra Curz	Sc-358812
Trizma base	Sigma	T1503 1KG
Tween 20	Sigma	P9416-50ML