Rastreamento Síncrono Multiarticular Baseado em Deep Learning para Quantificação Objetiva da Cinemática Locomotrica do Membro Posterior em Ratos

Summary

Esse protocolo estabelece uma pipeline de avaliação cinemática do membro posterior do rato usando um teste de esteira sem marcadores com auto-rotulagem de trajetória multiarticular orientada por aprendizado profundo, que permite quantificação reprodutível do movimento.

Abstract

A avaliação precisa e objetiva da marcha dos ratos é essencial para as áreas de pesquisa em neurociência e cinesiologia. Sistemas convencionais frequentemente dependem da imagem de pegada para inferência indireta da marcha, que não consegue capturar totalmente a cinemática multiarticular do membro posterior. Este estudo estabelece um sistema de análise de marcha baseado em esteira sem marcadores para roedores, integrando algoritmos personalizados de aprendizado profundo com uma esteira programável de suporte de peso, permitindo o rastreamento em tempo real de múltiplas articulações dos membros inferiores e quantificação cinemática multidimensional. O sistema extrai automaticamente parâmetros do ciclo de marcha, trajetórias articulares, padrões de distribuição de forças e suavidade do movimento sob velocidade modulada (0-300 mm/s), inclinação (±gradiente de 30°) e suporte de peso graduado (0-500 g), fornecendo uma ferramenta objetiva de avaliação para pesquisas em comportamento neuromuscular. Utilizando modelos de lesão medular (LME), os resultados demonstram a sensibilidade do sistema na detecção de diferenças multidimensionais na amplitude de movimento das articulações, continuidade da trajetória, força propulsora e suavidade do movimento entre roedores saudáveis e feridos, validando suas capacidades de discriminação e classificação de doenças. Comparada aos métodos tradicionais de pontuações subjetivas ou de pegada, esta plataforma elimina viés pessoal e limitações de dados de baixa dimensão, ao mesmo tempo em que combina arquitetura orientada por deep learning e vantagens de coleta de dados de alta produtividade. É aplicável a pesquisas envolvendo lesões de nervos centrais ou periféricos, doenças neurodegenerativas, distúrbios musculoesqueléticos e processos de envelhecimento. Por meio da integração síncrona dos módulos de neuroeletrofisiologia, o sistema possibilita ainda mais o acoplamento temporal dos sinais de marcha e neurais, estabelecendo uma estrutura metodológica para analisar mecanismos de controle centro-periférico e desenvolver estratégias neuromoduladoras.

Introduction

Na neurociência contemporânea e na pesquisa locomotora, a quantificação objetiva da marcha é agora fundamental para dissecar funções neuro-musculares, elucidar mecanismos de doenças e avaliar estratégias de^{reabilitação 1}. Sua alta resolução espaço-temporal permite capturar variações sutis nas sinergias entre comandos neurais, perfis de ativação muscular e mecânica esquelética, estabelecendo assim uma base empírica para investigar a coordenação de vias supraespinhales, feedback periférico e contextos mecânicos. Métricas cinemáticas reprodutíveis aumentam a sensibilidade à detecção para lesões, alterações degenerativas e efeitos terapêuticos, acelerando o pipeline de desenvolvimento de medicamentos e dispositivos².

Plataformas convencionais de avaliação como CatWalk, DigiGait ou análises simplificadas de pegada inferem indiretamente cinemática articular com base em padrões de contato plantares. Essas abordagens produzem métricas de baixa resolução e inconsistentes que não capturam a complexidade cinemática multiarticular dos membros^{posteriores 3,4}. O objetivo geral do nosso método é estabelecer um sistema de análise de marcha de alta precisão, sem marcadores e suportado por peso, projetado especificamente para modelos de roedores. Portanto, estabelecemos uma nova estrutura que: (i) mantém os roedores em postura ereta sob carga axial controlada (0-100% do peso corporal) durante imagens contínuas multiarticulares, (ii) localiza diretamente marcos anatômicos do plano sagital, desde análise de visão lateral até deep learning, para gerar trajetórias espaciais 2D, (iii) exporta ângulos articulares resolvidos no tempo e cinemática segmentária para modelagem estatística⁵. Fundamentalmente, essa estrutura é baseada na aplicação do deep learning a tarefas de visão computacional, o que permite extração robusta de características conjuntas a partir de dados de vídeo.

Comparado aos sistemas existentes, essa plataforma oferece quatro vantagens principais. Sua operação sem marcadores elimina etiquetas reflexivas ou implantadas, ao mesmo tempo em que reduz significativamente a complexidade processual e os artefatos de movimento⁶. O sistema integrado de suspensão com realimentação de força permite suporte corporal ponderado preciso (0-100%), facilitando uma avaliação abrangente da marcha ao longo do contínuo total de carga a descarga, que está ausente nas esteiras^{comerciais 7}. A arquitetura de aprendizado profundo permite retreinamento rápido para novas cepas, idades ou condições patológicas, superando o rastreamento manual em^{escalabilidade 8}. E coordenadas espaciais multiarticulações de alta precisão permitem análises detalhadas da cinemática entre articulações, combinadas com perfilamento quantitativo de padrões de marcha aberrantes.

Este protocolo é amplamente aplicável. Ele permite a investigação do controle supraespinal, loops de retroalimentação proprioceptiva e sinergias musculares sob demandas mecânicas^{moduladas 9}. Fisiopatologicamente, fornece biomarcadores locomotores sensíveis para lesão da medula espinhal (LME), AVC, neurodegeneração, neuropatias periféricas e distúrbios neuromusculares ^8,10. Terapêuticamente, apoia a avaliação longitudinal de intervenções farmacológicas ou baseadas em dispositivos com potência estatística aprimorada pela cinemática^{de alta resolução 11}. A arquitetura modular permite a integração perfeita com plataformas complementares, por exemplo, eletromiograma (EMG) ou sinais cerebrais, facilitando a decodificação mecanicista de correlatos neurais no movimento dos membros inferiores.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal do Instituto de Pesquisa Cerebral de Pequim e cumpriram as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Nenhum evento adverso relacionado ao procedimento foi observado.

1. Preparação de equipamentos

1. Ligue a fonte de alimentação do sistema da esteira e selecione o botão Controle de Velocidade na tela sensível ao toque.
2. Deixe a correia funcionar em baixa velocidade por 30 segundos para observar se a esteira desvia.
3. Selecione o botão de Controle de Inclinação , depois defina a inclinação para 0°, clique em Zero e confirme se o valor exibido coincide com a bolha de nível.
4. Entre na interface de suspensão , coloque um peso de 10 g e verifique se a leitura de tensão está próxima de 0,10 N.
5. Ligue o Computador Pessoal Industrial (IPC) e insira o software de aquisição e análise de vídeo.
6. Crie um diretório para o experimento do dia, incluindo informações como nome do experimento, identificação do animal, grupo experimental, velocidade, inclinação e percentual de redução de peso.
7. Fixe a câmera industrial de alta velocidade (UC70, resolução: 1280X1024, taxa de quadros: 60 fps), equipada com uma lente de foco manual (f = 12 mm), em um suporte de perfil de alumínio. Posicione a lente da câmera perpendicular ao eixo longitudinal da esteira para capturar uma visão estritamente lateral, mantendo uma distância horizontal de trabalho de 15 cm a partir do plano da correia.
8. Coloque a lente horizontalmente usando um nível de bolha e certifique-se de que o torso do rato ocupe os 2/3 centrais da armação. Ajuste o foco e a abertura até que as linhas de escala na régua traseira (grade de 1 cm) fiquem claramente visíveis.
9. Clique em Pré-visualização para confirmar que não há retaguarda e que o brilho de fundo está uniforme. Se a imagem estiver muito escura, use um retroiluminação de diodo emissora de luz (LED) para aumentar o brilho; Se estiver superexposto, reduza o ganho e estreite a abertura adequadamente.
10. Clique em Iniciar Gravação para testar a qualidade da gravação dos dados. Clique em Parar Gravação e defina o caminho de armazenamento de dados. Após concluir os testes de equipamento acima, inicie os testes em animais.

2. Preparação animal e testes realizados

1. Transfira o rato junto com sua gaiola original para a sala experimental e deixe-o descansar por 10 minutos. Durante esse período, permitir acesso livre a alimentos e água.
2. Registre o peso corporal usando uma balança eletrônica (com precisão de 0,1 g). Inclua ratos com peso corporal correspondente (±10 g) para minimizar os efeitos de confusão do tamanho corporal.
3. Se a cor do pelo dos membros posteriores não contrastar suficientemente com o fundo, use um barbeador elétrico para remover delicadamente uma faixa de pelo de 1 cm de largura na parte externa da coxa e na parte de trás da perna inferior, melhorando a precisão do reconhecimento articular.
4. Depois, use uma fita macia para medir a distância em linha reta do quadril até o tornozelo (mm), que servirá de base para a normalização subsequente da passada.
5. Coloque luvas, segure o rato e passe a alça elástica do peito na axila da frente, prendendo-a ao trilho ajustável. Certifique-se de que a alça esteja frouxa o suficiente para inserir um dedo sem afetar a respiração do animal.
6. Gire lentamente a alavanca do braço da suspensão enquanto observa o valor de tensão na tela, aumentando gradualmente até a razão de redução de peso alvo. Confirme que os membros traseiros do rato ainda estão totalmente em contato com o chão.
7. Ajuste a altura da barra de grip. Afrouxe o botão superior e posicione a barra frontal de empunhadura um pouco abaixo da ponta do nariz do rato quando estiver em pé, garantindo que o animal possa segurá-la facilmente sem precisar inclinar excessivamente a cabeça para trás ou se curvar.
8. Na tela de controle sensível ao toque, ajuste a velocidade para 150 mm/s e a inclinação para 0°. Realize uma sessão de aclimatação de 10 minutos para adaptar o animal ao nível específico de suporte com o peso corporal. Monitore o rato para sinais de estresse, por exemplo, congelamento, defecação.
   1. Se a marcha permanecer irregular (definida como [>3 interrupções/min]), estenda a duração em incrementos de 2 minutos, até um máximo de 20 minutos.
9. A aclimatação é considerada bem-sucedida quando o rato mantém uma passada contínua e uniforme por pelo menos 60 segundos sem arrastar a pata, e a cauda fica naturalmente pendurada sem rigidez. Exclua animais que não atendam a esses critérios após o período máximo de aclimatação.
10. Insira os parâmetros necessários para o experimento formal. Insira sequencialmente a velocidade desejada (qualquer valor entre 0-300 mm/s) e inclinação (−30° a +30°) na tela sensível ao toque, e selecione a direção da correia da esteira.
11. Depois de iniciar a esteira, observe a postura do rato ao andar. Se desviar da área central de 1/3, dê um toque suave na parede do lado direito uma vez com o nó do dedo. A maioria dos animais corrige sua posição sozinha. Se duas correções consecutivas não forem eficazes, reposicione o rato e grave novamente o teste.
12. Após a estabilização, clique em Iniciar Gravação e capture continuamente pelo menos cinco ciclos completos de marcha.
13. Ao final de cada tentativa, reduza imediatamente a velocidade para 0, desprenda a cinta peitoral e retorne o rato à sua gaiola correspondente.
14. Administre água durante o tempo de descanso, com pelo menos 3 minutos entre os testes.
15. Registrar pelo menos três testes sob as mesmas condições. Se um animal correr continuamente por mais de seis tentativas, adicione um descanso adicional de 2 minutos para evitar fadiga acumulada.
16. Realize o pré-treinamento por cinco dias consecutivos antes do experimento formal: caminhe por 10 minutos diários a 150 mm/s, inclinação 0° e perda de peso zero, observando a marcha.

3. Extração de dados de marcha

1. Primeiro, extraia segmentos que contêm a marcha alvo, geralmente em torno de 10 s, o que deve incluir pelo menos 10 ciclos de marcha estáveis e analisáveis.
2. Importe o arquivo .mov para o software de análise e registre as informações individuais dos ratos, incluindo número de identificação, grupo e condições experimentais.
   NOTA: O sistema emprega a arquitetura YOLO-NAS Pose, uma rede neural de última geração otimizada para estimativa de pose de alto desempenho.
   Construção de Conjunto de Dados: O modelo foi treinado com um conjunto robusto de 6.000 quadros de vídeo. Essas estruturas eram anotadas manualmente com as coordenadas de cinco articulações principais dos membros posteriores (crista ilíaca, quadril, joelho, tornozelo e dedo do pé) usando a interface gráfica do DeepLabCut para garantir precisão absoluta.
   Treinamento: A rede passou por aprendizado de transferência em uma GPU NVIDIA RTX 3080 para adaptar os pesos da POSE YOLO-NAS às características específicas do membro traseiro do rato.
   Inicialização: No software, selecione o modelo pré-treinado 'Rat_Hindlimb_YOLO_v1' e defina o Limiar de Confiança para 0,8 para excluir pontos-chave de baixa certeza.
   Durante a fase de análise, o modelo YOLO-NAS Pose processa o fluxo de vídeo quadro a quadro. Diferentemente dos métodos tradicionais de visão computacional que dependem da subtração em segundo plano, essa arquitetura de aprendizado profundo localiza diretamente o rat e prevê coordenadas conjuntas dentro da caixa delimitadora.
   Pós-Processamento: O algoritmo extrai as coordenadas x e y dos mapas de probabilidade. Para mitigar o jitter de alta frequência, um filtro mediano (tamanho da janela: 3 quadros) é aplicado às trajetórias brutas.
   Saída: O sistema trava com sucesso nas cinco articulações alvo dentro do quadro de vídeo, gerando coordenadas espaciais resolvidas no tempo para toda a sequência de marcha. Esses dados são automaticamente exportados como arquivos .csv para cálculo cinemático. Usando a régua de backboard (grade de 1 cm) capturada simultaneamente, o sistema estabelece uma relação de conversão, calcula automaticamente o fator de escala e converte em lote as coordenadas dos pixels em milímetros.
3. Exporte as coordenadas de posição espacial de cada articulação ao longo do tempo como um arquivo .csv para cálculo subsequente do índice.
   NOTA: O software calcula automaticamente o comprimento da passada, a frequência dos passos e a altura dos pés, e exporta as mudanças na posição espacial e nos ângulos das cinco articulações dos membros inferiores ao longo do tempo. Com base na altura dos dedos, o software divide automaticamente cada passo em fase de swing e fase de postura, e calcula a proporção entre a fase de swing e a fase de postura dentro de cada ciclo de marcha.

4. Comparações cinemáticas intergrupos

1. Normalize cada ciclo de marcha dentro do grupo de 0% (contato com os pés) a 100% (mesmo contato com os pés) para unificar os diferentes comprimentos de ciclo, facilitando a média e a comparação dos grupos. Os tipos de imagens que podem ser gerados para ilustrar a dinâmica da marcha são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

5. Análise estatística

1. Realize todas as análises estatísticas usando o software GraphPad Prism.
2. Verifique a normalidade da distribuição dos dados usando o teste de Shapiro-Wilk.
3. Para a validação cinemática e comparações de demonstração do índice de massa corporal (IMC), apresente os dados como Média ± SEM.
4. Avalie as diferenças entre as duas condições experimentais usando um teste t de Student não pareado.
5. Defina limiares de significância estatística como *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,005. Note que um total de n = 3 ratos foi incluído neste estudo piloto de validação.

6. Incorporação do módulo eletrofisiológico

1. Após concluir a modelagem animal, implante o dispositivo de registro eletrofisiológico.
2. Para registro neural, coloque eletrodos na superfície do crânio, no espaço epidural ou no córtex cerebral para registrar sinais cerebrais.
3. Para o registro da medula espinhal, insira eletrodos de gravação no espaço epidural do forame intervertebral.
4. Para gravação de EMG, enterre fios de prata bipolares nos músculos para registrar a atividade elétrica muscular.
5. Após a implantação, deixe o animal se recuperar por 5 a 7 dias, verificando diariamente a ferida e a marcha para garantir que não haja sinais de infecção ou dor antes de prosseguir para o experimento na esteira.
6. Conclua os preparativos do equipamento e dos animais conforme descrito acima.
7. Sincronize a coleção de parâmetros eletrofisiológicos e vídeos de movimento, garantindo que os dados eletrofisiológicos e de vídeo compartilhem o mesmo carimbo de tempo.
8. Após a coleta dos dados, alinhe os sinais neurais com quadros de vídeo durante a análise para observar intuitivamente os padrões eletrofisiológicos em diferentes fases do ciclo da marcha, fornecendo evidências diretas para a exploração do mecanismo de acoplamento central-periférico.

Results

O diagrama esquemático e a foto real da estrutura do sistema da esteira são mostrados nas Figuras 1A e B, respectivamente. O dispositivo é capaz de obter imagens laterais de alto contraste sem marcadores. A esteira suporta ajustes para velocidade, inclinação, direção e redução de peso, e está equipada com um painel de controle numérico. A interface de software acompanhante inclui uma interface de monitoramento e aquisição em tempo real, além...

Discussion

Esse protocolo delimita um sistema de análise de marcha baseado em esteira para ratos e seus procedimentos operacionais, fornecendo uma ferramenta multidimensional e objetiva de avaliação para pesquisas comportamentais neuromusculares. Como demonstrado nas comparações intergrupos dos parâmetros de marcha entre LME e ratos saudáveis dentro do estudo exemplar, o sistema adquire coordenadas brutas de movimento espacial dos membros inferiores dos sujeitos por meio de videografia contínua de ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anotação e Anotação de IA de Andar; Software de Aquisição	Shanghai ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MouseAI	MouseAI é o software integrado de análise para a esteira MOVEMETRICS, unificando gravação de vídeo, registro de metadados e análise automatizada da marcha em um único fluxo de trabalho.
Impacto mecânico	RWD Ciências da Vida, Shenzhen, China
Sistema de gravação lógica eletrofisiológica multicanal	Kedou (suzhou) Empresa de Tecnologia Cerebral-Computador,	KedouBC RHD128A	KedouBC RHD128A é um sistema compacto de aquisição eletrofisiológica in vivo com 128 canais , projetado para registro neural de alta resolução em animais de laboratório pequenos a grandes. Integrando headstages leves, plug-and-play (&le), conversão A/D de 16 bits e amplificadores programáveis, captura EEG, ECoG, LFP, spikes, sinais EMG e ECG de 0,1 Hz a 30 kHz com ≤ 2.4 & micro; Ruído do sistema V e > 10 GΩ impedância de entrada. RHD128A fornece dados neurais robustos e escaláveis pelo usuário para acelerar estudos em interfaces cérebro-máquina, neurodegeneração e reabilitação.
Esteira	Shanghai ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MOVEMÉTRICAS	MOVEMETRICS é uma esteira instrumentada de alta precisão para análise avançada da marcha de roedores.