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Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Este estudo identifica uma assinatura relacionada ao estresse oxidativo de 10-lncRNA no carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC) usando dados do Atlas do Genoma do Câncer. Embora a validação tenha mostrado desempenho preditivo clínico limitado, a assinatura diferenciava padrões de microambiente imunológico e ensaios in vitro LINC01615 apoiavam como candidato relacionado à invasão migratória para investigação mecanicista adicional.
O RNA não codificante de cadeia longa (lncRNA) influencia significativamente o valor prognóstico do carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) e a infiltração imunológica. Este estudo teve como objetivo demonstrar como os lncRNAs relacionados ao estresse oxidativo impactam o carcinoma de células escamosas pulmonares (CCE). O conjunto de dados Cancer Genome Atlas (TCGA) reuniu informações do transcriptoma e dados clínicos relacionados para o LUSC. Para construir um modelo prognóstico, 10 genes relacionados ao prognóstico foram identificados por meio de uma série de análises bioinformáticas que compararam a expressão aberrante do gene OS em tecidos tumorais e saudáveis, bem como sua associação com malignidade. Os participantes foram estratificados em grupos de alto e baixo risco com base na pontuação mediana de risco derivada da assinatura de 10 genes. Embora o modelo matemático de risco tenha demonstrado desempenho preditivo independente limitado na coorte de validação (AUC ~ 0,5), avaliações funcionais e imunológicas revelaram diferenças significativas no microambiente tumoral (TME) entre as camadas de risco. Especificamente, pacientes de alto risco apresentaram perfis distintos de infiltração imunal e escores imunológicos alterados em relação aos seus equivalentes de baixo risco. Portanto, em vez de servir como uma ferramenta direta de predição clínica, essa assinatura de lncRNA relacionada ao estresse oxidativo fornece valiosos insights biológicos sobre o cenário imunológico do LUSC e destaca potenciais alvos terapêuticos para investigações mecanicistas adicionais.
O câncer de pulmão apresenta a maior incidência e mortalidade global entre asmalignidades 1. Dentro das variantes histológicas do câncer de pulmão não de pequenas células (NSCLC), o carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC) é um subtipo predominante, frequentemente correlacionado a desfechos clínicos desfavoráveis e à falta de tratamentos direcionados altamente eficazes em comparação com o adenocarcinomapulmonar 2. Embora as abordagens terapêuticas primárias abrangam intervenção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia, pacientes com LUSC avançada frequentemente apresentam resistênciaterapêutica 3. Consequentemente, há uma necessidade urgente de identificar biomarcadores moleculares robustos para melhorar a estratificação prognóstica e orientar estratégias terapêuticas exploratórias para aLUSC 4.
O estresse oxidativo, caracterizado pelo acúmulo patológico de espécies reativas de oxigênio (ROS), desempenha um papel crítico na iniciação, crescimento e metástase do tumor. Na ausência de mecanismos eficientes de eliminação de ROS, níveis elevados de ROS induzem danos ao DNA e genotoxicidade, resultando, em última análise, em várias alterações genômicas que contribuem para o desenvolvimento do câncer. Notavelmente, estudos demonstraram consistentemente um aumento nos níveis de ROS e no estresse oxidativo, especificamente na patogênese do câncer depulmão 5,6. Pesquisas recentes destacaram ainda mais que agrupamentos de genes ligados ao estresse oxidativo podem funcionar como biomarcadores prognósticos prospectivos em malignidadespulmonares 7. RNAs longos não codificantes (lncRNAs) surgiram como reguladores cruciais da expressão gênica e representam biomarcadores prognósticos promissores em várias malignidades. Embora um estudo anteriornotável tenha estabelecido com sucesso um modelo prognóstico de lncRNA relacionado ao estresse oxidativo para adenocarcinoma pulmonar (LUAD), o cenário prognóstico específico e as implicações imunológicas desses lncRNAs no LUSC permanecem amplamente inexplorados.
Nesta investigação, os autores analisaram sistematicamente conjuntos de dados TCGA para construir uma nova assinatura de lncRNA relacionada ao estresse oxidativo especificamente adaptada para o LUSC. Além disso, ao contrário das análises puramente bioinformáticas, o presente estudo incorpora validação experimental in vitro para confirmar o papel funcional biológico dos principais lncRNAs identificados (por exemplo, Linc01615). Em vez de reivindicar aplicabilidade clínica imediata para decisões diagnósticas e de tratamento, esta pesquisa busca principalmente explorar os potenciais mecanismos do estresse oxidativo no LUSC e sua correlação com o microambiente imunológico tumoral. Essas descobertas têm como objetivo fornecer valiosos insights biológicos e destacar potenciais alvos terapêuticos para futuras investigações mecanicistas.
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Aquisição e pré-processamento de dados
Todos os dados analisados neste estudo foram obtidos do banco de dados público da TCGA listado na Tabela de Materiais. Este estudo seguiu rigorosamente a Política de Compartilhamento de Dados Genômicos do Instituto Nacional de Saúde (NIH) e as diretrizes de publicação fornecidas pela TCGA. Como os conjuntos de dados consistem em dados clínicos e multi-ômicos desidentificados, disponíveis publicamente, este estudo foi isento de aprovação adicional do Conselho de Revisão Institucional (IRB). Os dados do transcriptoma e as informações clínicas correspondentes para o LUSC foram baixados do banco de dados Cancer Genome Atlas (TCGA). Inicialmente, a coorte compreendia 551 amostras (502 tumorais e 49 normais). Para garantir a robustez desse modelo prognóstico, pacientes sem dados completos de sobrevivência geral (OS), status de sobrevivência ou características clínicas essenciais foram excluídos da análise de sobrevivência a jusante. Após esse rigoroso processo de filtragem, foi estabelecida uma coorte analítica final de 470 pacientes com LUSC. Esses 470 pacientes foram posteriormente divididos aleatoriamente em um conjunto de treinamento (n = 235) e um conjunto de testes (n = 235) para construção e validação do modelo de risco. Um total de 792 genes relacionados ao estresse oxidativo foram coletados por meio do banco de dados GeneCards, listado na Tabela de Materiais, utilizando um critério de inclusão com pontuação de relevância ≥ 7. O pacote limma (versão 3.66.0) foi utilizado para rastrear genes de estresse oxidativo diferencialmente expressos. Os plots de vulcão foram produzidos usando o pacote ggplot2 (versão 4.0.2). Entre o grupo de treinamento e o grupo de testes, não houve variação apreciável nas características clínicas (p > 0,05). O conjunto de treinamento era usado para construção de modelos, e o conjunto de testes era usado para validação interna.
Construção e verificação do modelo de risco
Para identificar lncRNAs associados ao estresse oxidativo, foi realizada uma análise de coexpressão de Pearson. Os autores avaliaram a correlação entre os perfis de expressão dos genes relacionados ao estresse oxidativo diferencialmente expressos identificados e todos os lncRNAs anotados dentro do conjunto de dados TCGA-LUSC. Os critérios de correlação para selecionar lncRNAs coexpressos foram definidos em um coeficiente de correlação |R| > 0,4 e um valor-p < 0,001. Com base nesses limiares, um total de 6.088 candidatos a lncRNAs relacionados ao estresse oxidativo foram derivados e extraídos. Posteriormente, esses 6.088 lncRNAs candidatos foram avaliados por meio de regressão LASSO e abordagens analíticas complementares para construir o modelo prognóstico de risco. Utilizando os dados processados, os participantes dos pacientes foram categorizados em camadas de alto e baixo risco.
Fatores independentes e curvas ROC
Modelos de regressão de Cox univariada e multivariada foram utilizados para identificar variáveis prognósticas independentes. Especificamente, para controlar a taxa de erro familiar durante as múltiplas análises univariadas de regressão de Cox (n = 236 testes), foi aplicada a correção de Bonferroni, estabelecendo o limiar de significância rigorosamente ajustado em p < 0,00021 (calculado como 0,05 / 236).
Análise de sobrevivência e análise de componentes principais
O pacote de sobrevivência (versão 3.8-6) foi usado para calcular as taxas de sobrevivência geral (OS), e a análise de componentes principais (PCA) foi usada para avaliar a robustez do modelo de risco.
Nomograma
O índice de ajuste foi avaliado usando o pacote rms em R para avaliar a confiabilidade do nomograma. A carga mutacional tumoral (TMB) foi avaliada e visualizada usando o pacote maftools (versão 2.22.0). Algoritmos, incluindo o ssGSEA, foram usados para detectar infiltração imunológica. Além disso, o pacote ggpubr (versão 0.6.3) foi usado para comparar pontos de verificação imunológico entre grupos de risco. O algoritmo ESTIMATE foi utilizado para caracterizar o microambiente tumoral (TME).
Análise funcional
O pacote clusterProfiler (versão 4.14.6) em R era usado para análise de enriquecimento. Para explorar mais a fundo as vias funcionais, foi realizada uma análise GSEA. Usando o Cytoscape, foi criada uma rede de coexpressões para observação.
Métodos experimentais
Condições e agrupamento da cultura celular
A linhagem celular de carcinoma escamoso pulmonar humano NCI-H520 (RRID: CVCL_1566; listada na Tabela de Materiais) foi cultivada em meio RPMI-1640 suplementado com 10% (v/v) soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. Células em fase logarítmica foram semeadas em placas de cultura de 6 poços. Após adesão bem-sucedida, as células foram alocadas aleatoriamente em três grupos experimentais distintos: um grupo controle em branco mantido sob condições padrão de cultura, um grupo controle negativo (si-NC) transfectado com siRNA não direcionado, e um grupo experimental de knockdown (si-LINC01615) transfectado com siRNA específico para LINC01615.
Transfecção celular
Os reagentes si-LINC01615 e si-NC foram descongelados no gelo. Para a preparação do complexo de transfecção, 95 μL de meio RPMI-1640 sem soro foram pipetados em tubos de centrífuga estéreis, seguidos pela adição sequencial de 3 μg do respectivo siRNA e 5 μL do reagente de transfecção Lipo3000. O procedimento idêntico foi aplicado tanto para o gruposi LINC01615 quanto para o siNC. As soluções foram suavemente misturadas e incubadas em temperatura ambiente por 5 minutos para facilitar a formação complexa, resultando em um volume total de aproximadamente 200 μL por tubo. Posteriormente, essa mistura foi distribuída uniformemente nos poços de cultivo designados contendo 800 μL de meio basal RPMI-1640. Após um período de incubação de 6 horas a 37 °C, o meio de transfecção foi cuidadosamente aspirado e substituído por meio de cultivo fresco e completo.
Ensaio de cicatrização de feridas (scratch)
Para o ensaio de cicatrização de feridas, células NCI-H520 (RRID: CVCL_1566) que crescem logarítmicamente foram semeadas em placas de cultura de 6 poços com uma densidade de 5,6 × 10 célulasde 5 por poço. Ao atingir 95–100% de confluência, uma ferida linear foi criada artificialmente ao riscar a monocamada celular verticalmente pelo centro do poço usando uma ponta estéril de pipeta de 200 μL. Os poços foram posteriormente lavados três vezes com PBS para remover células destacadas e detritos celulares, e depois incubados em meio RPMI-1640 sem soro. Imagens das áreas idênticas feridas foram capturadas às 0, 24 e 48 horas utilizando um microscópio invertido. A área de cicatrização da ferida foi quantificada medindo a distância da lacuna usando o ImageJ (RRID: SCR_003070; listada na Tabela de Materiais), e a taxa de migração foi calculada em relação à área inicial da ferida em 0 h.
Migração transwell e ensaios de invasão
As capacidades de migração e invasão celular foram avaliadas utilizando câmaras Transwell de 24 poços equipadas com inserções de membrana de policarbonato de 8,0 μm do tamanho de um poro listadas na Tabela de Materiais. Para o ensaio de invasão, as câmaras apicais foram pré-revestidas com 50 μL de Matrigel (diluído 1:8 em meio sem soro; listado na Tabela de Materiais) e incubadas a 37 °C por 2 horas para polimerização, enquanto o ensaio de migração utilizou inserts não revestidos. Após transfecção celular e um período de fome sérica de 24 horas, as células NCI-H520 foram colhidas, ressuspensas em meio RPMI-1640 sem soro e semeadas nas câmaras apicais com densidade de 1,8 × 105 células/poço em 200 μL. As câmaras basais foram preenchidas com 600 μL de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS como quimioatrativo. Após uma incubação de 48 horas a 37 °C com 5% de CO₂, os inserts foram removidos e lavados três vezes com PBS. As células remanescentes na superfície apical da membrana foram cuidadosamente removidas com um cotonete úmido. As células que migraram ou invadiram a superfície basolateral foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 20 minutos e coradas com solução de Giemsa listada na Tabela de Materiais por 30 minutos em temperatura ambiente. As células migradas e invasas foram visualizadas e enumeradas em três campos ópticos selecionados aleatoriamente por inserto usando um microscópio invertido com ampliação de 40x.
Análise estatística
Todas as análises estatísticas e visualizações de dados foram realizadas usando o software R (versão 4.1.2; RRID: SCR_001905; listados na Tabela de Materiais). Os números de versão específicos de todos os pacotes R utilizados neste estudo foram explicitamente detalhados em suas respectivas subseções metodológicas. Um valor significativo era convencionalmente definido como p < 0,05, a menos que fosse informado de outra forma. Quando múltiplas comparações foram realizadas (por exemplo, as múltiplas regressões univariadas de Cox), o método de Bonferroni foi aplicado rigorosamente para manter a taxa de erro familiar (FWER), com o limiar ajustado exato (por exemplo, p < 0,00021) detalhado na respectiva subseção metodológica. Os dados quantitativos in vitro foram expressos como média ± desvio padrão e analisados usando o teste t de Student ou ANOVA unidirecional, conforme apropriado.
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Identificação de genes diferencialmente expressos para estresse oxidativo
O fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1. As características clínicas da coorte analítica final, composta por 470 pacientes com LUSC, são detalhadas na Tabela 1. Com base no limiar definido de uma pontuação de relevância ≥ 7, os autores recuperaram um total de 792 genes relacionados ao estresse oxidativo do banco de dados ...
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O carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC) é um subtipo histológico predominante e altamente agressivo de câncer de pulmão não de pequenas células, frequentemente caracterizado por taxas de sobrevivência precárias e resistência a modalidades terapêuticasconvencionais 8,9. Evidências emergentes destacam o estresse oxidativo como um fator fundamental na patogênese e progressão de várias malignidades. O acúmulo patológico de...
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Os autores declaram não haver interesses concorrentes. Nenhuma ferramenta de inteligência artificial (IA) ou tecnologias assistidas por IA foram usadas durante a preparação do manuscrito; Todo o conteúdo científico, análises, dados brutos e conclusões foram gerados, revisados e aprovados de forma independente pelos autores.
Esse trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Bolsa nº 8200430). Agradecemos sinceramente aos colaboradores e instituições envolvidas, incluindo a Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Hunan e o Hospital Afiliado da Academia de Medicina Tradicional Chinesa de Hunan, por seus recursos e apoio. Também expressamos nossa gratidão a todos os pesquisadores e participantes que contribuíram para este estudo.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime | P0099 | Usado para fixação de células |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | Usado para criação de rede de co-expressão |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Concentração final 10% (v/v) |
| GeneCards database | GeneCards Human Gene Database | https://www.genecards.org/ | Triagem de genes relacionados ao estresse oxidativo |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldrich | GS500 | Usado para coloração de células migradas/invasoras |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Usado para quantificação de fenda de ferida |
| Lipo3000 Transfection Reagent | GLPBIO | GK20006 | Usado para transfecção de siRNA |
| Matrigel | Corning | 356234 | Diluído 1:8 em meio sem soro |
| NCI-H520 human lung squamous cell carcinoma | ATCC | HTB-182 | Usado para ensaios de validação in vitro |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Gibco | 10010-023 | Usado para lavagem celular |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140-122 | Suplemento antibiótico para cultura celular |
| R software (v4.1.2) | R Foundation | https://www.r-project.org/ | Análise estatística e visualização |
| RPMI-1640 Medium | Gibco | 11875-093 | Meio de cultura celular |
| The Cancer Genome Atlas (TCGA) | Genomic Data Commons | https://portal.gdc.cancer.gov/ | Fonte de dados clínicos e do transcriptome |
| Transwell Chambers (8.0 μm) | Corning | 3422 | Usado para ensaios de migração e invasão |