Microdissecação por captura a laser de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído para análise de RNA

Summary

Este protocolo descreve um método para isolar RNA de regiões histológicas definidas de tecido hepático de camundongo, fixado com paraformaldeído, composto de Temperatura Ótima de Corte, utilizando microdissecação por captura a laser, permitindo análise direcionada de expressão gênica a jusante.

Abstract

A microdissecção por captura a laser (LCM) proporciona acesso espacial a populações celulares específicas dentro de tecidos complexos por meio de visualização in situ e isolamento. Para possibilitar a análise transcriptômica de regiões histologicamente definidas em tecido fixo, é apresentado um protocolo detalhado de MCA para extração de RNA de seções de fígado de camundongo, fixadas em paraformaldeído (PFA), com Temperatura Ótima de Corte (OCT). O protocolo detalha a identificação e coleta de amostras em microescala (aproximadamente 1.000 células) por meio de um fluxo de trabalho que abrange fixação de tecidos, desidratação de sacarose, embutição de OCT, criossecção, coloração por hematoxilina e captura a laser de áreas histológicas alvo. Usando esse método, obteve-se um RNA de alta pureza (A₂₆₀/A₂₈₀: 1,9-2,1). O número de integridade do RNA (RIN) foi de 6,7 ± 0,9, refletindo a fragmentação esperada associada à fixação de PFA. No entanto, a PCR quantitativa para β-actina produziu valores de Ct de 17 a 19, e o sequenciamento de RNA realizado usando preparação de biblioteca otimizada para fragmentação gerou leituras de alta qualidade, com >90% das bases atendendo aos limiares Q20 e Q30, confirmando que o RNA é adequado para análises sensíveis a jusante. Portanto, esse protocolo possibilita uma análise espacial e direcionada da expressão gênica, fornecendo RNA de pureza e integridade definidas a partir de regiões histológicas específicas do tecido hepático fixado ao PFA.

Introduction

A aquisição precisa de perfis de expressão gênica espacialmente resolvidos é crucial para entender a heterogeneidade dos tecidos na saúde e na doença. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) oferece alta resolução^{celular 1,2}, mas perde o contexto espacial nativo e pode alterar os perfis transcricionais durante a dissociação^{tecidular 3,4}. Para tipos celulares que não possuem marcadores específicos identificados publicamente, obter populações puras usando triagem baseada em imunofluorescência ou isolamento imunomagnético continua sendo^{difícil 5,6}. Tecnologias de transcriptômica espacial como Visium e GeoMx permitem a captura in situ de dados de expressão gênica de alta capacidade, mas sua resolução espacial é limitada no nível de célula única ou subcelular ^7,8. Por outro lado, a transcriptômica espacial baseada em imagem pode alcançar resolução em nível nanométrico, mas possui taxa limitada de detecção^{gênica 9}. Isso destaca uma lacuna persistente para a análise baseada em hipóteses de regiões morfológicas específicas.

A microdissecção de captura a laser (LCM) permite a seleção e isolamento guiados por microscópio de células específicas de seções de tecido ou culturas celulares vivas com base no fenótipo observável. Essa abordagem preserva a estrutura celular e a informação espacial¹⁰. Essa técnica tem sido amplamente aplicada em pesquisas sobre doenças hepáticas para análises posteriores. Por exemplo, a LCM tem sido usada para coletar células epiteliais biliares de biópsias hepáticas para elucidar seu papel imunoregulador na colangite biliar^{primária 11}. Além disso, tem sido usado para isolar tecido positivo γ-glutamiltransferase (GGT) de modelos experimentais para confirmar a expressão genética específica do local Ggt1 ¹². Mas esses estudos têm focado principalmente em tecidos frescos congelados, que frequentemente carecem de anotações clínicas ou acompanhamento^{de longo prazo 13}. Em contraste, tecidos quimicamente fixados oferecem vantagens para diagnóstico^{histopatologico.} Embora o sequenciamento de RNA baseado em LCM (RNA-Seq) tenha sido aplicado com sucesso em amostras hepáticas arquivadas, fixadas em formol e embutidas em parafina^{(FFPE) em grande escala 15}. No entanto, falta um protocolo robusto de perfil de expressão gênica baseado em LCM, especificamente para amostras em microescala de tecidos hepáticos embutidos com paraformaldeído (PFA) e composto embutido com Temperatura Ótima de Corte (OCT).

Para atender a essa necessidade não atendida, um protocolo abrangente foi otimizado usando criosseções fixas em PFA e embutidas em OCT. Este protocolo aborda as limitações dos fluxos de trabalho FFPE (por exemplo, processamento prolongado e produtos químicos agressivos) para aplicações sensíveis de^{LCM-RNA 16}. Em contraste, o processo de fixação e incorporação de amostras fixadas em PFA e embutidas em OCT é relativamente mais simples e flexível, permitindo a preparação rápida de seções de alta qualidade que preservam tanto a integridade do RNA quanto a morfologia tecidual. Além disso, esse protocolo é realizado usando um sistema LCM baseado em laser ultravioleta (UV). Comparado aos sistemas infravermelhos, o UV-LCM oferece resolução de corte mais fina e permite a coleta direta e sem contato de amostras, minimizando a contaminação e tornando-o adequado para o isolamento preciso de regiões em microescala de arquiteturas teciduais^{complexas 17,18}. Portanto, o valor operacional deste protocolo reside em sua capacidade de realizar a captura de regiões em microescala (~1.000 células) que preservam a morfologia a partir de seções hepáticas fixadas com PFA. Ela produz RNA adequado para análise direcionada de expressão gênica, permitindo correlação direta entre características histopatológicas e perfis transcriptômicos locais.

Aqui, descrevemos um protocolo para microdissecação de captura a laser de tecido em microescala (~1.000 células) a partir de seções de fígado de camundongos fixadas em PFA e embutidas em OCT, seguido pela extração de RNA e análise a jusante por PCR e sequenciamento de RNA por transcrição reversa quantitativa. Esses procedimentos podem ser concluídos em até cinco dias.

Para orientar os leitores na avaliação da aplicabilidade deste protocolo, o escopo principal e as limitações são resumidos abaixo. Este protocolo é especificamente otimizado para amostragem guiada por hipóteses e morfologia de regiões histológicas específicas de tecidos fixados em PFA e embutidos em OCT, com aplicação principal no fígado de camundongo. É adequado para pesquisadores que precisam correlacionar dados transcriptômicos espacialmente resolvidos com características histopatológicas precisas preservadas em espécimes fixos. O fluxo de trabalho é particularmente valioso ao trabalhar com tecidos fixos arquivados ou clinicamente anotados, onde amostras frescas congeladas não estão disponíveis. No entanto, esse protocolo não é ideal para estudos que exigem RNA não fragmentado e de alta integridade (por exemplo, número de integridade de RNA (RIN) > 8), pois a fragmentação inerente causada pela fixação química limita seu uso em aplicações que dependem de transcritos de comprimento completo.

Protocol

Todos os procedimentos de manuseio e cuidado de animais foram realizados de acordo com diretrizes éticas e aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Southern Medical University. O método descrito utilizou camundongos machos adultos C57BL/6J e foi mantido em uma dieta rica em gordura, açúcar e deficiente em colina para modelar a esteatohepatite metabólica associada (MASH). Antes da colheita do tecido hepático, os animais eram eutanasiados por decapitação.

1. Preparação de espécime fixado com PFA

1. Fixe amostras frescas de tecido hepático (lóbulos individuais, 5 mm de espessura ou menos) em 30 mL de PFA frio a 4% (recém-preparado) a 4 °C por 24 horas.
   NOTA: Recomenda-se perfundir o fígado com solução salina tamponada com fosfato (PBS, 1×, tipicamente composta por 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na₂HPO₄ e 1,8 mM de KH₂PO₄, pH 7,4) em concentração de 1× por 5 minutos, seguida de fixação por perfusão com 4% de PFA por 5 minutos. Alternativamente, o tecido também pode ser fixado em solução de formalina a 10%.
   ATENÇÃO: O fixador do PFA é tóxico. Todos os resíduos da PFA devem ser coletados em um recipiente de resíduos químicos designado e devidamente rotulado, em conformidade com as regulamentações institucionais e locais.
2. Lave as amostras de tecido fixas 3× vezes por 5 minutos com solução de PBS 1× livre de RNase.
3. Coloque o tecido hepático fixo em um tubo de 50 mL preenchido com 50 mL de sacarose a 30% (recém-preparado em PBS estéril de 1×). Mantenha as amostras a 4 °C por 10-12 horas.
4. Remova as amostras de tecido da solução de sacarose. Aparar as amostras para obter blocos fáceis de manusear (aproximadamente 5 mm × 3 mm × 5 mm), depois incorporar as amostras em um criomold (7 mm × 7 mm × 5 mm) contendo composto OCT.
   NOTA: Ajuste a orientação do tecido com pinças, se necessário.
5. Adicione composto OCT por cima para cobrir completamente as amostras de tecido, depois imediatamente coloque o bloco de tecido embutido em OCT sobre nitrogênio líquido ou gelo seco para congelar rapidamente o composto OCT e formar um bloco sólido. Esse congelamento rápido é essencial para obter criosseções de alta qualidade.
   ATENÇÃO: Use luvas resistentes à criogenia para proteger as mãos ao manusear materiais criogênicos.
6. Coloque os blocos embutidos com OCT a -80 °C até a criossecção.

2. Criosseção para microdissecção por captura a laser

1. Expor as lâminas de membrana de polietileno naftalato (PEN) à luz UV por 30 minutos, depois revestir as lâminas com 0,1 mg/mL de poli-L-lisina, seguida de secagem ao ar. Depois, sele as bordas do slide de membrana da PEN com um meio de montagem neutro.
   NOTA: Irradiação UV e tratamento com poli-L-lisina com lâminas de membrana PEN podem melhorar a adesão das amostras de tecido às lâminas de membrana PEN. Selar o perímetro com um meio de montagem neutro previne a infiltração de água ou a formação de bolhas sob a membrana, o que é fundamental para manter a eficiência do LCM.
   ATENÇÃO: Proteja a pele e os olhos da luz UV. Use óculos de proteção que bloqueiam UV ou uma viseira facial (classificada para proteção UV), além de jaleco, luvas de nitrilo e mangas longas para cobrir a pele exposta.
2. Limpe todas as superfícies acessíveis do crióstato e todas as ferramentas com um agente de descontaminação RNase, e limpe a escova com etanol a 75%.
   ATENÇÃO: Descarte lenços e soluções de etanol usados de acordo com os protocolos locais de saúde e segurança ambiental institucional.
3. Permita que o instrumento atinja e estabilize a −20 °C.
4. Retire as amostras de fígado a -80 °C e coloque-as no crióstato por pelo menos 15 minutos.
5. Aplique uma camada fina (2-3 mm) de composto OCT sobre a superfície da etapa da amostra. Coloque a etapa da amostra em uma prateleira de congelamento rápido (ou na câmara do crióstato) para pré-solidificar a camada OCT.
6. Aplique uma pequena quantidade de OCT sobre a camada de OCT pré-solidificada na etapa da amostra. Retire o bloco de tecido equilibrado (do passo 2.4) e imediatamente coloque o bloco horizontalmente sobre esse OCT, mantenha-o no lugar por 10-15 segundos para permitir congelamento parcial e aderência. Uma vez fixado, montar o estágio da amostra (com o bloco de tecido acoplado) na cabeça da amostra criostática.
7. Insira cuidadosamente a lâmina entre as placas de fixação e as placas traseiras de um lado do criostato, e então prenda a alavanca de fixação.
8. Ajuste a espessura do criostat para 10 μm.
   NOTA: Ajuste a espessura da fatia conforme necessário para o tecido, mas mantenha a espessura entre 5-15 μm¹⁹.
9. Corte e monte as seções diretamente sobre as lâminas de membrana PEN pré-tratadas dentro da câmara do criostato mantida a -20 °C.
   NOTA: Cada lâmina de membrana PEN pode acomodar de 6 a 8 seções de tecido. Recomenda-se que todo o processo de separação seja concluído em até 1 hora. Limitar o tempo de separação minimiza a exposição dos tecidos às condições ambientes, reduzindo assim os riscos de degradação do RNA, desidratação do tecido e artefatos morfológicos, que são críticos para preservar a qualidade do RNA e a integridade histológica para a LCM e análise a jusante.

3. Coloração por hematoxilina para microdissecação por captura a laser

1. Descongele os slides em temperatura ambiente (RT) por 20 minutos antes do uso.
2. Lave as lâminas com PBS 1× sem RNase (3 vezes, 10 s cada).
3. Imerga as lâminas de tecido em solução filtrada de hematoxilina de Mayer (composta por 1,0 g/L de hematoxilina, 0,2 g/L de iodato de sódio, 50 g/L de dodecahidrato de sulfato de amônio de alumínio, 50 g/L de cloral hidrato e 1,0 g/L de ácido cítrico) por 5 a 10 segundos.
   NOTA: Passe a solução de trabalho de hematoxilina por uma membrana filtrante de seringa de 0,22 μm antes de tingir.
4. Lave as lâminas com água sem RNase (3 vezes, 10 segundos cada) para remover a solução residual de hematoxilina.
5. Avalie a qualidade da coloração ao microscópio.
   NOTA: Núcleos idealmente tingidos devem parecer nítidos de azul-púrpura contra um fundo claro. A coloração insuficiente gera núcleos fracos, enquanto a supercoloração obscurece os detalhes celulares. Somente os slides que atendam a esses critérios ótimos de coloração devem avançar para a próxima etapa.
6. Sece as lâminas usando papel absorvente e depois sece completamente ao ar (10-15 min).
   NOTA: Certifique-se de que os slides estejam totalmente secos antes de prosseguir com o LCM. Depois, coloque os slides nos tubos da centrífuga de 50 mL e armazene-os temporariamente no gelo até que o LCM seja realizado.

4. Microdissecação por captura a laser

NOTA: A duração do experimento LCM para cada lâmina deve ser mantida entre 30 min e 1 hora. Recomenda-se que todo o experimento de LCM seja concluído em até 4 horas. Esse limite é definido para minimizar a degradação do RNA na RT e para evitar a evaporação do buffer de coleta na tampa do tubo, o que é crucial para a coleta eficiente da amostra. Na prática, o rendimento alvo de aproximadamente 1.000 células de regiões morfologicamente definidas pode ser colhido de forma confiável em até 4 horas.

1. Limpe as superfícies da bancada de laboratório usando o agente de descontaminação RNase.
2. Ligue o controlador e permita que o microscópio complete seu processo de inicialização.
3. Gire a chave no sentido horário da posição Desligado para a Ligada para iniciar o sistema laser.
   NOTA: O sistema de laser leva cerca de 10 minutos para aquecer.
4. Ligue o computador e abra o software LCM, depois aguarde o processo de inicialização ser concluído.
5. Insira um tubo PCR estéril de 0,2 mL (tubo coletor) no dispositivo coletor.
6. Adicione 10 μL de um tampão de digestão K com proteinase (veja a Tabela de Materiais) à tampa do tubo de PCR.
   NOTA: O volume total do tampão de digestão da proteinase K será elevado para 150 μL em uma etapa subsequente (ver Passo 5.4.1) como parte do procedimento completo de lise.
7. Coloque o dispositivo de coleta no suporte para amostras do microscópio.
8. Dentro da janela de Alterar Dispositivo Coletor , primeiro selecione o botão Mover para o Ponto de Referência . Em seguida, ajuste o foco da câmera para garantir uma visão clara do ponto de referência. Se necessário, use as setas na janela para centralizar o ponto de referência no campo de visão.
9. Carregue uma seção de tecido no suporte da amostra, garantindo que a seção de tecido esteja orientada para baixo e que o rótulo esteja à direita.
10. Selecione a lente objetiva de 10×, identifique e delinee regiões de interesse que exibam características patológicas específicas, como esteatose microvesicular (caracterizada por hepatócitos com numerosos vacúolos citoplasmáticos pequenos e claros e núcleos centralmente localizados). Depois, navegue até o menu Laser e clique no botão Calibrar . Confirme a mensagem na tela selecionando Sim e prossiga com a calibração.
    NOTA: A lente objetiva de 10× não é exclusiva para microdissecação; Outras lentes de ampliação (por exemplo, 20×) podem ser selecionadas com base na clareza da amostra e na resolução desejada.
11. No painel de controle do laser, defina os parâmetros de corte para: Potência do laser = 50, Abertura (diâmetro do feixe do laser) = 5 e Velocidade = 9.
    NOTA: Os valores dos parâmetros listados acima servem como referência para o sistema UV-LCM com as amostras de tecido usadas neste protocolo. Usuários de outros sistemas UV-LCM devem considerar esses sistemas como ponto de partida e provavelmente precisarão ajustar as configurações empiricamente. As configurações ótimas podem variar conforme o tipo de tecido, espessura da seção e outros sistemas de LCM.
12. Desenhe um círculo ao redor da área alvo usando a barra de ferramentas gráfica. Selecione a Forma Única, clique no botão Start Cut para realizar o LCM e então posicione o dispositivo de coleta para coletar o tecido dissecado.
    NOTA: O destacamento bem-sucedido é indicado pela separação da área selecionada, frequentemente com uma abertura visível ou movimento de fragmentos. Para consistência, colete de um número pré-definido de regiões de tamanho semelhante por amostra. Se a área alvo não se soltar automaticamente, clique no botão Mover e Cortar para cortar a amostra manualmente usando o mouse. Para uma estimativa mais precisa do número de células, o software LCM pode registrar automaticamente a área total de corte. Esse valor pode ser dividido pela área média da seção transversal de uma célula-alvo para aproximar o número total de células capturadas.
    ATENÇÃO: Durante o processo LCM, não olhe diretamente para o feixe de laser para evitar exposição à radiação laser.
13. Opcionalmente, capture uma imagem Antes e Depois do local de dissecação selecionando o comando Salvar Imagem Como no menu Arquivo . Na caixa de diálogo, escolha um local, nome de arquivo e salve em um formato preferido (por exemplo, .tif).
14. Ao coletar o número desejado de células, clique no botão Descarregar para remover o coletor do palco. Antes de selar o tubo PCR, verifique se o volume tampão de digestão da proteinase K na tampa permanece em 10 μL; reabastecer o tampão se ocorrer evaporação durante a LCM (ver Passo 4.6).
    NOTA: Adicionar 10 μL do tampão garante que a superfície da tampa esteja totalmente molhada, o que facilita a transferência eficiente do pellet de tecido microdissecado durante a centrifugação no Passo 4.16.
15. Faça um vórtice nos tubos de coleta cuidadosamente.
16. Gire brevemente os tubos de coleta e armazene os tubos da amostra a -80 °C até a extração de RNA.
    NOTA: Repita os passos 4,5 a 4,16 para a próxima amostra. O protocolo pode ser pausado até a extração de RNA.

5. Extração total de RNA de amostras microdissecadas

1. Limpe as superfícies da bancada de laboratório usando o agente de descontaminação RNase.
2. Transfira as amostras de LCM do freezer de -80 °C para um banho de gelo. Se desejado, agrupe diferentes lotes das mesmas amostras capturadas.
3. Incube os tubos microdissecados de cabeça para baixo a 42 °C por 30 minutos.
   NOTA: Essa inversão garante que qualquer tecido remanescente aderido à tampa após uma breve centrifugação (Passo 4.16) seja liberado no tampão de digestão. Isso garante a máxima transferência da amostra para o buffer antes do ajuste de volume e da centrifugação em alta velocidade no Passo 5.4.1.
4. Isolar o RNA total de amostras de LCM usando um kit padrão de extração de RNA otimizado para tecidos fixos (veja a Tabela de Materiais).
   1. Ajuste o volume em cada tubo de amostra para um final de 150 μL com o buffer de digestão da proteinase K (veja a Tabela de Materiais). Gire os tubos a 11.000 × g (1 min), depois transfira as amostras para um tubo estéril de 1,5 mL.
   2. Adicione 10 μL de proteinase K (20 mg/mL) por tubo e depois misture suavemente as amostras através de pipeteamento repetido. Isso resulta em um volume final de 160 μL e uma concentração final de proteinase K de aproximadamente 1,25 mg/mL na reação digestiva por amostra.
   3. Realize uma incubação de amostra em duas etapas: primeiro a 56 °C por 15 minutos, seguido por 15 minutos a 80 °C. Durante cada incubação, faça um vórtice breve nos tubos a cada 5 minutos.
      NOTA: Para um fluxo de trabalho ideal, use dois banhos-maria pré-aquecidos. Se usar um banho único, faça uma pausa após a incubação a 56 °C: mantenha as amostras em RT enquanto o banho aquece a 80 °C, e então prossiga.
   4. Coloque as amostras por 3 minutos no gelo, seguido de centrifugação a 20.000 × g (15 min).
   5. Aspire o sobrenadante clarificado em um novo tubo de 1,5 mL, tomando cuidado para evitar o pellet.
   6. Adicione 16 μL de tampão de incubação de DNase e 10 μL da enzima DNase I (2,73 unidades/μL, veja a Tabela de Materiais) a cada amostra. Depois, misture bem o conteúdo invertendo suavemente os tubos. Isso resulta em um volume final de 186 μL e uma concentração final de DNase I de aproximadamente 0,15 unidades/μL na reação digestiva por amostra.
   7. Faça uma rápida rotação para coletar líquido residual das paredes do tubo.
   8. Incube os tubos da amostra em RT por 15 minutos.
   9. Transfira 320 μL de tampão de lavagem com alto teor de sal (veja a Tabela de Materiais) para cada amostra e misture as amostras cuidadosamente. Isso resulta em um volume final de 506 μL por amostra.
   10. Transfira 720 μL de etanol absoluto para cada tubo, misture as amostras por pipeteamento (sem centrifugação) e prossiga imediatamente. Isso resulta em um volume final de 1.226 μL por amostra.
       ATENÇÃO: O etanol absoluto é altamente inflamável. Colete etanol residual em um recipiente designado para solventes orgânicos não halogenados para descarte adequado.
   11. Transfira 700 μL da mistura da amostra para uma coluna de purificação (colocada em um tubo coletor de 2 mL, veja a Tabela de Materiais). Feche suavemente a tampa e centrifuge a 8.000 × g (15 s).
   12. Descarte o fluxo do tubo coletor. Mantenha a coluna de purificação.
   13. Repita os passos 5.4.11 a 5.4.12.
   14. Adicione 500 μL de tampão de lavagem à base de etanol (veja a Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra. Feche suavemente as tampas e centrifuge a 8.000 × g (15 s). Depois, descarte o fluxo do tubo de coleta.
   15. Repita o Passo 5.4.14 em sua totalidade, com a única modificação de aumentar o tempo de centrifugação para 2 minutos a 8.000 × g.
   16. Transfira cada coluna de purificação para um novo tubo de 2,0 mL. Centrifuge a 14.000 × g (5 min) com a tampa aberta, depois descarte o tubo e o líquido residual.
   17. Transfira cada coluna de purificação para um novo tubo de 1,5 mL. Pipete 16 μL de água livre de RNase sobre a membrana, feche a tampa e centrifuge a 14.000 × g ( 5 min) para facilitar a elução do RNA total.
       NOTA: Mantenha todas as amostras de RNA eluídas no gelo para os Passos 5.5 e 5.6 para evitar degradação.
5. Quantifique as amostras de RNA e verifique a pureza (razão A₂₆₀/_{A 280} ) por espectrofotometria.
   NOTA: A medição de concentração e pureza (razão_{A 260}/_{A 280} ) nesta etapa, juntamente com a avaliação de integridade no Passo 5.6, serve como o ponto de verificação quantitativo definitivo para a recuperação bem-sucedida do RNA. Espera-se um eluado claro de RNA.
6. Realize eletroforese em gel de agarose com concentração de gel de 1% e determine o número de integridade do RNA (RIN) usando um sistema de bioanalisador para avaliar a qualidade do RNA.
7. Armazene as amostras de RNA a -80 °C até realizar qRT-PCR ou RNA-Seq.

6. Análise de RNA

NOTA: a qRT-PCR é descrita nos Passos 6.1 e 6.2, e o RNA-Seq é descrito no Passo 6.3.

1. Prepare a mistura de reação de transcrição reversa e adicione 50 ng de RNA total por reação no gelo. Prossiga com a reação de transcrição reversa usando um ciclador térmico conforme as instruções fornecidas (veja a Tabela de Materiais).
2. No gelo, prepare mistura mestra quantitativa de PCR para β-actina conforme as instruções do fabricante (veja a Tabela de Materiais para sequências de primer). Realize amplificação por PCR em tempo real em um sistema quantitativo usando o protocolo de ciclagem recomendado pelo fabricante com 10 ng de cDNA por reação.
3. Usando um kit de cadeia de baixa entrada (veja a Tabela de Materiais), construa bibliotecas de RNA-Seq a partir de 50 ng de RNA total. Determine o tamanho e a concentração da biblioteca com um sistema de bioanalisador (veja a Tabela de Materiais) e então realize sequenciamento de extremidades pareadas em uma plataforma de alto rendimento (veja a Tabela de Materiais).

Results

O fluxo de trabalho experimental, que inclui fixação de PFA, desidratação de sacarose a 30%, embutição e criosseção de OCT, coloração por hematoxilina, identificação e coleta precisa da região-alvo (~1.000 células) por LCM, lise celular, isolamento de RNA, métricas de controle de qualidade de RNA e as duas principais aplicações analíticas, está descrito na Figura 1. A seção hepática colorida com hematoxilina na lâmina PEN é mostrada ao microscópio antes (

Discussion

A força da MCL reside em sua captura precisa e in situ de células ou regiões de tecido selecionadas, facilitando o estudo de áreas específicas dentro de um tecido heterogêneo. Mas seu baixo rendimento amostral, processo demorado, alto custo e necessidade de equipamentos especializados limitam a ampla aplicação dessa técnica em^{laboratórios 23}. Neste estudo, o protocolo LCM-RNA foi estabelecido para superar limitações históricas importantes. Esse protocolo ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Tubos de parede fina de 0,2 ml	Axygen	PCR-02-C	Tubos para coleta LCM
Tubo centrífugo de 1,5 mL	Axygen	339653
4% de paraformaldeído	Leagene	DF0135
Tubo centrífuga de 50 mL	ThermoFisher Scientific	339653
DEPC (pirocarbonato de dietílico)	Sigma	D-5758
Conjunto de digestão DNase I	Qiagen	73504	Componente do Kit FFPE RNeasy inclui a solução original DNase I e o DNase Booster Buffer
Etanol (100%)	Thermo Fisher Scientific	BP2818	Purificado para biologia molecular
Buffer de lavagem à base de etanol	Qiagen	73504	RPE de buffer (componente do Kit FFPE RNeasy)
Buffer de lavagem com alto teor de sal	Qiagen	73504	RBC de buffer (componente do Kit FFPE RNeasy)
Lâminas microtome de perfil baixo	Leica Biosystems	819
Mayer' s hematoxilina	Leagene	DH0001
Composto OCT	Sakura	4583
Slide revestido por membrana PEN	Leica	11505188
Soro salino tamponado com fosfato	Leagene	CC0010	Livre de DNase/RNase
Poli-L-lisina	Macklin	P875131S
Buffer de digestão K da proteinase	Qiagen	73504	PKD de buffer (componente do Kit FFPE RNeasy)
Coluna de purificação	Qiagen	73504	Coluna de spin RNeasy MinElute (componente do Kit RNeasy FFPE)
Master mix de PCR quantitativo	Biografia de Takara	RR820A	TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)
Kit de transcrição reversa	Qiagen	205411	Kit de Transcrição Reversa QuantiNova
Kit de extração de RNA	Qiagen	73504	RNeasy FFPE Kit
Kit de Sequenciamento de RNA (Baixa Entrada, Encadeado)	Biografia de Takara	634412	Kit SMARTer de RNA-seq total em cadeia - entrada pico mamífero v2
Agente de descontaminação RNase	Solarbio	SR0040	Limpeza
Sacarose	Macklin	S818049
Animais e Dieta
Mouse: C57BL/6J	Centro de Animais de Laboratório da Província de Guangdong	03
Especial & Dieta Especial Beber água
Dieta rica em gordura e deficiente em colina (Dieta base)	TROPHIC Animal Feed High-Tech Co., Ltd.	TP36310M	Macronutrientes: proteína, 14 kcal%; carboidratos, 26 kcal%; gordura, 60 kcal%
Água potável com suplemento de açúcar	Macklin	N/A (preparado internamente)	Uma mistura de D-glicose (Macklin, Cat# F87500) e D-frutose (Macklin, Cat# S818049) foi adicionada à água potável autoclavada em uma concentração final de 42 g/L, com uma proporção glicose-frutose de 55:45 (peso e volta)
fortes
β-actin (Atacante: AGAGGGAAATCGTGCGTGAC)	Sequenciamento BGI	Personalizado	HPLC purificado
β-actina (Reverso: CAATAGTGATGACCTGGCCGT)	Sequenciamento BGI	Personalizado	HPLC purificado
Equipamento
Microtomo de crióstato	Leica Biosystems	CM3050 S
Sistema de bioanalisador	Agilent	G2939BA
Plataforma de sequenciamento de alta taxa	Illumina; Inc.	Sistema NovaSeq 6000
Sistema de Microdissecação por Captura a Laser	Leica Microsystems	Leica LMD6500
Sistema quantitativo de PCR	Biossistemas Aplicados	Sistema de PCR em Tempo Real QuantStudio 5
Espectrofotômetro	ThermoFisher Scientific	NP80	NanoDrop
Ciclador térmico	BioRad	T100
Software
Adobe Illustrator CC 2019 (versão 23.0.2)	Adobe	https://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad Prism (versão 8.3.0)	GraphPad Software	https://www.graphpad.com