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O fluxo experimental para avaliar a eficácia de inoculantes microbianos no aumento da tolerância ao estresse hídrico na alface romana (Lactuca sativa L. var. Paspartu) é resumido na Figura 1. O protocolo integrou monitoramento contínuo de regimes precisos de irrigação com aquisição periódica de dados fisiológicos e térmicos. Dois produtos microbianos distintos foram utilizados: (I) consórcio microbiano, um consórcio complexo de 67 cepas compostas por PGPR, actinomicetos e fungos benéficos, projetado para atuar como um tampão fisiológico por meio da colonização radicular e secreção de exopolissacarídeos (EPS); e (II) Trichoderma harzianum, um inoculante de cepa única de Trichoderma harzianum com o objetivo de induzir resistência sistêmica e modificar a arquitetura radicular. Os reagentes, equipamentos e softwares utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Inoculação microbiana
Foi implementado um regime padronizado de inoculação para ambos os tratamentos microbianos, consistindo em seis aplicações encharcadas de solo que visaram a rizosfera usando micropipetas de alta precisão para simular dosagens em escala de campo. A primeira fase ocorreu durante a fase de muda, aos 5 e 15 dias após o semeaio (DAS). Com 30 DAS, as mudas foram transplantadas para bandejas de cavidades maiores, com a segunda fase de inoculações realizada 1 dia após o transplante (DAT), seguida por aplicações sucessivas em 7, 15 e 20 DAT.
Para o consórcio microbiano, as dosagens foram ajustadas de acordo com a fenologia vegetal: as duas aplicações iniciais foram aplicadas a 500 g/ha (3 mL/planta), seguidas por uma dose de alta concentração de 2 kg/ha no transplante, e concluindo com três doses de manutenção de 300 g/ha. De forma semelhante, T. harzianum foi aplicado a 1 L/ha nas duas primeiras etapas, 3 L/ha no transplante e 1 L/ha nas três aplicações finais. Essa abordagem faseada foi projetada para garantir uma colonização radicular robusta e manter o papel da população microbiana como um amortecedor fisiológico durante os períodos críticos de crescimento e indução de estresse.
2. Preparação das culturas
Sementes certificadas de alface romana (Lactuca sativa L. var. Paspartu) foram germinadas em bandejas de poliestireno com 311 cavidades (11 mL por cavidade) usando um substrato profissional à base de musgo de turfa a uma profundidade de 1 cm. A germinação foi realizada em uma câmara bioclimática controlada, mantida em uma faixa de temperatura de 15 °C a 22 °C e umidade relativa de 60%–70%. Ao atingir 90% de germinação (aproximadamente 3–5 dias após a semeadura), as mudas eram transplantadas para bandejas maiores com capacidade de 55 mL de torrão para permitir o desenvolvimento irrestrito das raízes (Figuras 2 e Figuras 3). O ensaio foi organizado em um desenho completamente randomizado (CRD), com 9 unidades experimentais (bandejas) e 20 mudas por bandeja. Essa configuração foi estruturada para acomodar um sistema fatorial 3 × 3 (3 tratamentos microbianos × 3 regimes de irrigação). Propriedades físico-químicas detalhadas do substrato e programação específica da câmara bioclimática14são apresentadas na Figura 3, Tabela Suplementar 1, Tabela Suplementar 2 e Tabela Suplementar 3.
Bandejas experimentais foram distribuídas usando um layout completamente aleatório dentro da câmara bioclimática para eliminar efeitos de borda e garantir exposição uniforme. A câmara foi programada para simular condições dinâmicas semelhantes a campos, utilizando um regime de alta temperatura para replicar o estresse térmico em campo aberto. Durante a fase vegetativa, os parâmetros ambientais foram mantidos dentro de uma faixa variável de umidade relativa, e um fotoperíodo de 9 horas fornecido por iluminação LED de alta intensidade (ajustada acima de 50% da capacidade máxima para garantir radiação fotossinteticamente ativa adequada)15. Após a fase de estabelecimento, o programa ambiental foi ajustado para refletir as exigências crescentes dos tratamentos com déficit hídrico, conforme ilustrado nas transições atmosféricaspasso a passo 15 (Figura 4 e Figura 5). Pontos de ajuste diurnos/noturnos específicos para temperatura, umidade e intensidade luminosa são detalhados na Tabela Suplementar 1 e na Tabela Suplementar 2 para simplificar o protocolo principal.
A estratégia de fertilização foi projetada para atender aos requisitos fenológicos específicos da alface romana, mantendo um fluxo de nutrientes equilibrado ao longo do ciclo vegetativo. Durante a fase de muda (12 a 24 DAS), os nutrientes foram fornecidos por meio de aplicações direcionadas de Nitrato de Potássio (KNO3), Fosfato de Monopotássio (KH 2PO4) e Nitrato de Cálcio (Ca(NO3)2). Para potencializar o estabelecimento precoce, um bioestimulante comercial foi suplementado durante os primeiros 24 dias16.
Do 26 DAS até a avaliação final no 76 DAS, o programa de fertigação passou para um regime de manutenção onde o bioestimulante foi eliminado para isolar os efeitos específicos dos inoculantes microbianos. Todas as aplicações foram calibradas para manter a condutividade elétrica (CE) e o pH ótimos dentro da rizosfera. O cronograma completo das concentrações minerais e os volumes de dosagemespecífica 16estão detalhados na Tabela Suplementar 3.
3. Tratamento com microrganismos
Para avaliar a eficácia das intervenções biológicas contra o estresse hídrico, foram estabelecidos três tratamentos distintos: (I) consórcio microbiano, um consórcio microbiano de alta diversidade composto por 67 cepas benéficas, incluindo Rizobactérias Promotoras do Crescimento Vegetal (PGPR), Actinomicetos e fungos; (II) T. harzianum, uma formulação especializada de cepa única de Trichoderma harzianum; e (III) um Controle não inoculado. Esses tratamentos foram selecionados com base em seu potencial para Tolerância Sistêmica Induzida (IST), principalmente por meio de mecanismos como modificação da arquitetura radicular, produção de desaminase de ACC-deaminasa e secreção de exopolissacarídeos (EPS).
A inoculação seguiu uma abordagem estratégica faseada. A aplicação inicial (3 mL por planta) foi realizada por micropipeta de alta precisão diretamente na rizosfera no segundo estágio verdadeiro da folha para garantir a colonização precoce das raízes. Aplicações subsequentes foram calibradas para equivalentes em escala de campo (simulando uma densidade de 75.000 plantas/ha). Para T. harzianum, foi aplicada uma concentração de 2 L/ha, enquanto o consórcio microbiano foi administrado a 1 kg/ha. Essas formulações eram dissolvidas na água de irrigação e aplicadas a cada 15 dias para manter uma população microbiana estável como um amortecedor fisiológico durante todo o ciclovegetativo 17.
4. Diferentes tratamentos de irrigação
Para avaliar a plasticidade fisiológica e agronômica de L. sativa sob condições hídricas variadas, três regimes de irrigação foram implementados baseados na substituição da evapotranspiração das culturas (ETc). O teor volumétrico de água foi calibrado em relação à capacidade de campo (FC) do substrato para garantir indução precisa de tensões. Os regimes foram definidos da seguinte forma: (I) Controle/Poço de Água (CC-100% ETc), onde a evapotranspiração completa foi reabastecida; (II) Déficit Hídrico Moderado (75% ETc), projetado para induzir limitação hidráulica intermediária; e (III) Déficit Hídrico Severo (50% ETc), com o objetivo de gerar estresse hídrico crítico. A irrigação foi administrada diariamente após capturar imagens térmicas usando pipetas graduadas para garantir a substituição precisa do volume de água perdido pelaevapotranspiração 18.
5. Gravação de dados e imagens
Para avaliar a distribuição térmica e o estado da água das plantas, imagens térmicas infravermelhas foram capturadas diariamente de segunda a sexta-feira durante todo o período experimental. Todas as gravações fotográficas foram realizadas entre 12h e 14h para padronizar medições durante o período de máxima transpiração e intensidade solar. É fundamental tirar essas imagens imediatamente antes dos tratamentos diários de irrigação para registrar o estresse hídrico acumulado experimentado pelas plantas ao longo do ciclo anterior de 24 horas. Para aquisição de imagem, a câmera térmica infravermelha era conectada a um dispositivo móvel e mantinha uma orientação perpendicular em relação à parte de trás das plantas de alface em uma distância consistente de 60–70 cm. O software foi configurado com uma paleta térmica multicolorida na qual os gradientes de temperatura são representados do menor ao mais alto: começando pelo roxo (mais frio), passando por azul real, turquesa, verde (ponto médio), amarelo, laranja e, por fim, vermelho (mais quente). Dentro da interface de software, a área específica da bandeja contendo a copa da planta era selecionada manualmente para capturar os dados térmicos. Essa escala de cores serve como um indicador fisiológico: plantas bem hidratadas apresentam temperaturas do dossel mais frias (roxo/azul) devido à transpiração ativa, enquanto plantas desidratadas apresentam temperaturas mais altas (laranja/vermelho) devido ao fechamento dos estomas e ao resfriamento evaporativo reduzido. Posteriormente, essas imagens de alta resolução foram processadas usando a função de medição de três pontos sobre regiões específicas de interesse (ROI) para extrair valores precisos de temperatura do dossel (Tc) para o cálculo do Índice de Estresse Hídrico das Culturas (CWSI).
Se o CWSI for:
0, então a cultura não está sob estresse hídrico
1 então a cultura fica sob forte estresse hídrico
Onde:
Tc é a temperatura da copa da plantação, medida por imagem infravermelha. Aviso é a temperatura da copa sob condições sem estresse hídrico. Td é a temperatura da copa sob condições de máximo estressehídrico 19.
Indicadores de crescimento, desenvolvimento e condição fisiológica das plantas, como altura, número de folhas e temperatura das folhas, avaliados por termograma infravermelha, são apresentados na Tabela Suplementar 4 , juntamente com as variáveis do estudo e definições conceituais e operacionais utilizadas no experimento. A combinação dessas variáveis permitiu uma avaliação abrangente do impacto dos tratamentos experimentais no desempenho fisiológico e no desenvolvimento de cada planta.
6. Análise de dados
Dados fisiológicos e morfológicos foram analisados usando uma ANOVA Unidirecional para cada regime de irrigação para determinar o efeito dos diferentes tratamentos microbianos. Todos os procedimentos estatísticos foram realizados usando software estatístico. Antes de realizar a análise inferencial, os requisitos fundamentais para estatísticas paramétricas foram verificados para garantir a confiabilidade dos resultados. A normalidade dos resíduos foi confirmada usando o teste de Anderson-Darling (p > 0,100), indicando normalidade. Além disso, a homogeneidade das variâncias foi validada usando o teste de Levene (p = 0,989), confirmando alta homoscedasticidade entre os grupos. Como ambas as suposições foram atendidas, o teste pós-hoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) foi usado para identificar diferenças significativas (p < 0,05) entre as médias do tratamento. A planta individual foi definida como a unidade experimental para todas as avaliações estatísticas.
