Method Article

Sequenciamento de RNA de célula única para perfilamento de segmentos do cólon ganglionar e aganglionar de pacientes com doença de Hirschsprung

DOI:

10.3791/69825

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de sequenciamento de RNA unicelular para analisar a infiltração das células imunológicas e as diferenças transcricionais específicas de tipo celular entre segmentos do cólon ganglionar e aganglionar na doença de Hirschsprung.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A doença de Hirschsprung (HSCR) é um distúrbio congênito da motilidade intestinal caracterizado pela ausência de neurônios entéricos no intestino distal. Comparado ao sequenciamento de RNA em massa, o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) permite o perfilamento de expressão gênica no nível de célula única, resolvendo a heterogeneidade celular que é mascarada nas análises com média populacional. Foi estabelecido um fluxo de trabalho padronizado de scRNA-seq para caracterizar o cenário transcricional de segmentos ganglionares e aganglionares de pacientes com HSCR. Tecidos do cólon foram coletados, e foi realizada coloração de hematoxilina e eosina para identificar regiões ganglionares e aganglionares. Os tecidos foram dissociados enzimática e mecanicamente em suspensões unicelulares, seguidas por filtração, avaliação de viabilidade e construção de bibliotecas de transcriptoma unicelular. Bibliotecas que passavam pelo controle de qualidade eram sequenciadas, e os dados brutos eram processados para quantificação de células e filtragem de qualidade para remover células de baixa qualidade e artefatos técnicos. Após a normalização e redução da dimensionalidade, as células foram agrupadas e anotadas com base em genes marcadores estabelecidos. Análises posteriores compararam a composição do tipo celular entre tecidos ganglionares e aganglionares e identificaram genes expressos diferencialmente dentro de subconjuntos chave de células imunológicas. Os resultados revelam diferenças substanciais no microambiente imunológico entre os segmentos ganglionar e aganglionar no HSCR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A doença de Hirschsprung (HSCR) é um dos distúrbios congênitos de motilidade intestinal mais comuns, com uma incidência de aproximadamente 1 em cada 5.000 nascimentos vivos no mundo1. A doença surge devido à falha das células da crista neural entérica (ENCCs) em migrar para o intestino distal durante as semanas embrionárias 5–12, resultando na ausência de gânglios entéricos nos segmentosafetados 2. O segmento aganglionar apresenta, consequentemente, contração espástica persistente e peristaltismo comprometido, levando à dilatação intestinal proximal. Clinicamente, isso se manifesta como obstrução funcional, causando constipação, distensão abdominal e vômitos, podendo ser potencialmente fatais em casos graves. A resseção cirúrgica do segmento aganglionar continua sendo o tratamento principal para HSCR; No entanto, uma proporção substancial dos pacientes apresenta complicações pós-operatórias, incluindo constipação, enterocolite e sujeira fecal, que comprometem significativamente a qualidadede vida 3. Além disso, a síndrome do intestino curto (SBS) pode ocorrer após resseção intestinal extensa, resultando em absorção prejudicada de nutrientes e aumento dos desafios clínicos no manejo. Portanto, a elucidação dos mecanismos subjacentes da HSCR e a identificação de novos alvos terapêuticos continuam sendo necessidades clínicas críticas.

Nos últimos anos, o sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) tem sido amplamente aplicado para investigar mecanismos moleculares associados a doenças. Ao contrário do sequenciamento convencional de RNA em massa, o scRNA-seq permite a análise de expressão gênica em resolução de célula única, possibilitando a identificação da heterogeneidade celular e de subpopulações raras que são mascaradas em análises emmassa 4. Consequentemente, o scRNA-seq emergiu como uma ferramenta poderosa para dissecar heterogeneidade celular e comunicação intercelular, avançando a pesquisa em biologia emedicina 5. Essa abordagem revelou novos mecanismos patogênicos e alvos terapêuticos em doenças complexas, incluindo Alzheimer6, artritereumatoide 7, câncer depulmão 8 e diabetestipo 2 9.

Neste estudo, o scRNA-seq foi aplicado para caracterizar a paisagem transcricional das células imunes e os padrões de infiltração em tecidos do cólon ganglionar e aganglionar de pacientes com HSCR. O fluxo de trabalho compreendia três etapas principais: preparação e avaliação de qualidade de suspensões de célula única, construção de bibliotecas de RNA-seq de célula única de 3′ e análise bioinformática posterior. As amostras de tecido foram preservadas em uma solução dedicada de preservação unicelular imediatamente após a resseção e foram dissociadas enzimaticamente em suspensões unicelulares dentro de 48 horas. A viabilidade celular ultrapassou 80%, e a concentração celular final foi ajustada para 700–1.500 células/μL antes da preparação da biblioteca. A infiltração de células imunes entre segmentos ganglionares e aganglionares foi comparada, e subpopulações de células imunes apresentando diferenças transcricionais pronunciadas foram identificadas. Essas análises delineam alterações das células imunológicas associadas à patologia do cólon no HSCR.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Afiliado da Universidade Médica de Zunyi (Aprovação nº: KYLL-2024-030). O estudo está em conformidade com a Declaração de Helsinque. O consentimento informado (oral e escrito) foi obtido de todos os participantes e seus responsáveis. A Tabela 1 apresenta as informações sobre pacientes com HSCR.

Colete tecidos do cólon, incluindo segmentos ganglionares e aganglionares, de pacientes com HSCR diagnosticados e submetidos a cirurgia no Departamento de Cirurgia Pediátrica do Hospital Afiliado da Universidade Médica de Zunyi. Inclua segmentos ganglionares e aganglionares de dois pacientes masculinos com HSCR. Informações clínicas detalhadas são fornecidas na Tabela 1. Todos os reagentes, produtos químicos, equipamentos e softwares estão listados na Tabela de Materiais.

1. Coloração de hematoxilina e eosina

  1. Coleta e fixação de tecidos
    1. Fixe amostras de tecido intestinal em solução de fixação de paraformaldeído a 4% por pelo menos 24 horas.
      ATENÇÃO: O paraformaldeído é tóxico e libera vapores de formaldeído. Realize todos os procedimentos em uma exaustão química e utilize equipamentos de proteção individual adequados.
    2. Corte os tecidos para aproximadamente 5 × 5 × 2mm 3 usando um bisturi. Coloque os lenços em cassetes de embeding e enxágue sob água da torneira corrente por 24 horas.
      NOTA: Remova as bordas dos tecidos e prepare blocos com pelo menos uma superfície plana. Se não for uniforme, coloque um papel entre os papéis de filtro após o enxágue.
  2. Desidratação graduada por etanol
    1. Imergir os tecidos sequencialmente em soluções de etanol: 70% etanol durante a noite, 80% etanol por 3 horas, 90% etanol por 2 horas, 95% etanol I por 2 horas, 95% etanol II por 1 hora, 100% etanol I por 1 hora e 100% etanol II por 30 minutos.
      NOTA: Diluir etanol (≥99,7%) com água ultrapura até as concentrações indicadas.
      ATENÇÃO: Realize o manuseio de etanol em uma exaustão química.
    2. Remova a cesta de desidratação e escorra bem entre as etapas.
  3. Clareira
    1. Transfira tecidos para xileno por 30 segundos para alcançar transparência.
  4. Infiltração e incorporação de parafina
    1. Derreta a cera de parafina a 60 °C com um dia de antecedência. Submeta cera fresca a três ciclos de congelamento-descongelamento para remover bolhas. Filtre a parafina derretida através de papel de filtro após o terceiro ciclo.
    2. Infiltre tecidos em cera pura de parafina (cera de parafina I) por 1 hora.
    3. Infiltrar tecidos na mistura de parafina (cera de parafina II; cera pura de parafina: cera de abelha = 8:1) por 2 horas.
      NOTA: Derreta completamente a cera de abelha e filtra antes de usar.
    4. Despeje cera de parafina II em moldes de embutição. Coloque os blocos de papel de seda na vertical e planos, insira etiquetas e deixe solidificar.
  5. Seccionamento
    1. Corte os blocos de parafina para obter superfícies lisas sem cortar o tecido.
    2. Monte blocos em um microtomo. Ajuste a orientação e remova o excesso de parafina. Corte seções seriadas com espessura de 4 μm. Faça as seções flutuantes em um banho-maria a 50 °C e transfira para slides de vidro.
    3. Deslize a seco em um forno a 60 °C para remover a umidade residual.
      NOTA: Secos por 12–48 horas.
  6. Deparafinização
    1. Realize incubação sequencial: xileno I (15 min), xileno II (15 min), 100% etanol I (5 min), 100% etanol II (5 min), 90% etanol (5 min), 80% etanol (5 min), 70% etanol (5 min) e água destilada (5 min).
  7. Coloração por hematoxilina
    1. Tinga as seções com hematoxilina por 50 s.
    2. Enxágue sob água da torneira por 10 minutos.
  8. Coloração por eosina
    1. Tinga seções com eosina por 40 segundos.
  9. Desidratação
    1. Imerga seções sequencialmente em 95% etanol I (30 s), 95% etanol II (30 s), 100% etanol I (30 s) e 100% etanol II (30 s).
  10. Clareira
    1. Transfira as seções para xileno I por 10 minutos e xileno II por 10 minutos.
  11. Montagem e observação
    1. Adicione um meio de montagem. Cubra com uma capa de vidro e remova as bolhas de ar.
    2. Deixe o meio de montagem solidificar. Examine as seções sob um microscópio óptico.

2. Sequenciamento de RNA de célula única

  1. Preparação da suspensão de célula única
    1. Triturar os tecidos intestinais em ~1mm 3 fragmentos usando tesoura.
    2. Incubar fragmentos de tecido no Meio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, contendo 1 mg/mL de colagênase II e 0,1 mg/mL de DNase I a 37 °C por 30 minutos, com agitação suave em uma plataforma oscilante (60 rpm).
    3. Interrompa a digestão adicionando um volume igual de DMEM frio contendo 10% de soro fetal bovino (FBS).
    4. Filtre a suspensão por um filtro de célula de 70 μm. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
    5. Descarte o sobrenadante e retenha a bola celular. Lave uma vez com soro salino tamponado com fosfato (PBS) contendo 0,04% de albumina sérica bovina (BSA).
    6. Dissociar aglomerados celulares por pipeteamento suave para obter uma suspensão de célula única.
    7. Filtre a suspensão por um filtro de célula de 40 μm.
    8. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e colete a bola.
    9. Ressuspendam células em DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina–estreptomicina (P/S).
    10. Determine a viabilidade e densidade celular usando exclusão do azul de tripano. Use amostras com viabilidade >80% e ajuste a concentração para 700–1.500 células/μL.
      NOTA: Misture suspensão celular com azul de tripano (1:1) e conte as células viáveis usando um hemocitômetro.
  2. Preparação da biblioteca
    1. Carregue aproximadamente 15.000 células por expedição para preparação da biblioteca.
      NOTA: Em microgotas de esferas em emulsão em gel (GEM), o mRNA hibridiza em poli(dT) oligonucleotídeos em esferas de gel.
    2. Realize transcrição reversa e amplifique o cDNA usando PCR (95 °C por 10 min; 40 ciclos de 95 °C por 15 s, 60 °C por 35 s, 72 °C por 25 s; extensão final a 72 °C por 25 s). Use cDNA amplificado para construção de bibliotecas scRNA-seq 3′.
      NOTA: Um saliência CCC é adicionada durante a síntese de cDNA e é pareada com a sequência de oligonucleotídeo de troca de molde (TSO).
    3. Quebre emulsões e recupere cDNA de GEMs.
  3. Controlo de qualidade de bibliotecas e sequenciamento
    1. Quantificar a expressão gênica e avaliar a distribuição do tamanho dos fragmentos.
    2. Realize quantificação precisa usando um instrumento fluorescente de qPCR.
      NOTA: Garanta concentração na biblioteca ≥10 nM.
    3. Bibliotecas de sequências usando um instrumento de sequenciamento.
      NOTA: Estrutura da leitura: Leitura 1 (26 pb), Leitura 2 (91 pb), índice i7 (8 pb); Profundidade do alvo ~50.000 leituras por célula.
  4. Controle de Qualidade de Dados
    1. Alinhe as leituras brutas ao banco de dados de referência. Realize a contagem UMI e gere uma matriz célula por gene.
    2. Importar resultados no formato AnnData (Dados Anotados) para análise posterior.
    3. Realize filtragem de QC com base em UMIs, contagem de genes e leituras mitocondriais.
      NOTA: Remover gibões (Scrublet); exclua células com <200 ou >5.000 genes, total_counts >40.000 ou mt_ratio >20%.
  5. Redução de dimensionalidade e anotação
    1. Normalize a contagem do Identificador Molecular Único (UMI) para 10.000 por célula.
    2. Identifique genes altamente variáveis.
    3. Realize análise de componentes principais (PCA).
    4. Construa um grafo k-vizinho mais próximo.
    5. Realize o embedding UMAP.
    6. Agrupar células usando o algoritmo de Leiden no Scanpy (v1.9.3).
      NOTA: Use sc.pp.neighbors e sc.tl.leiden (resolução = 0,5).
    7. Anote tipos celulares usando uma ferramenta projetada para a anotação automatizada e de alta precisão de tipos celulares em dados de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq).
  6. Análise diferencial
    1. Realize análise diferencial de expressão gênica em R (v4.2.2) usando Seurat (v4.3.0).
      NOTA: Use a função FindMarkers com o teste de soma de ranks de Wilcoxon.
    2. Realize análise de enriquecimento GO usando clusterProfiler (v4.8.1) com enrichGO.
      NOTA: Inclui categorias CC, MF e BP.
    3. Realize análise de enriquecimento de caminhos KEGG usando clusterProfiler (v4.8.1) com enrichKEGG10.

3. Descarte de resíduos

  1. Colete separadamente resíduos contendo paraformaldeído e xileno.
  2. Neutralize as soluções ácidas quando apropriado ou descarte como resíduos perigosos.
  3. Siga as regulamentações institucionais de saúde e segurança ambiental (EHS).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A coloração por hematoxilina e eosina (HE) (Figura 1) revelou diferenças histológicas distintas entre os segmentos ganglionar e aganglionar. Comparados aos segmentos ganglionares, os segmentos aganglionares apresentaram aumento da esfoliação mucosa, uma redução marcante nas células do cálizar e neurônios submucosos, e limites borrados entre as camadas mucosa e muscular. Em um subconjunto de seções, a preservação tecidual foi subótima, com descolamento epitel...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sequenciamento de RNA unicelular foi aplicado ao perfil de características transcricionais de tecidos do cólon ressecados cirurgicamente (segmentos ganglionares e aganglionares) de pacientes com doenças de Hirschsprung 4,5. Atenção especial foi dada à estratégia de dissociação tecidual, pois os parâmetros influenciam a recuperação celular, a representação do tipo celular e a integridade do RNA. Condições digestivas enzimáticas ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Ciência e Tecnologia de Guizhou (Cooperação em Ciência e Tecnologia de Guizhou - Fundação - ZK - [2024] General 344) (para X.F. Yang) e pelo Contrato do Projeto de Ciência e Tecnologia Zunyi (Cooperação em Ciência e Tecnologia) (Zunyi Science and Technology Cooperation HZ (2023) Nº) (para Y. Qu).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cera de abelhaSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
Cera de abelhaSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
Albumina sérica bovinaThermofisher30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
Albumina sérica bovinaThermofisher30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
CellTypistN/ANAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
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Pacote de perfil de clusterBiocondutorv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
Pacote de perfil de clusterBiocondutorv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
Colanase IIThermofisher17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
Colanase IIThermofisher17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
Vidro de coberturaCITOTEST80340-0130  https://cn.citotest.com/pd40971476.html
Vidro de coberturaCITOTEST80340-0130  https://cn.citotest.com/pd40971476.html
Lâmina descartável de micrótomoFeatherS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
Lâmina descartável de micrótomoFeatherS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
DNase IThermofisher18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
DNase IThermofisher18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
Forno de secagemBORUKDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
Forno de secagemBORUKDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
Dulbecco' s Eagle Médio ModificadoThermofisher12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Dulbecco' s Eagle Médio ModificadoThermofisher12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Álcool etílicoSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
Álcool etílicoSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
Soro fetal bovinoThermofisherA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
Soro fetal bovinoThermofisherA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
Kit de coloração de hematoxilina e eosinaBeyotimeC0105S  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0105S
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Ácido clorídricoSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10011028  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
Ácido clorídricoSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10011028  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
Lamina de microscópioCITOTEST80302-3111  https://cn.citotest.com/pd530614548.html
Lamina de microscópioCITOTEST80302-3111  https://cn.citotest.com/pd530614548.html
Meio de montagemBeyotimeC0173-100ml  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0173-100ml
Meio de montagemBeyotimeC0173-100ml  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0173-100ml
Microscópio ópticoNikonECLIPSE SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
Microscópio ópticoNikonECLIPSE SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
Cera de parafina  Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Cera de parafina  Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Solução de Fixação de ParaformaldeídoBeyotimeP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=P0099-3L
Solução de Fixação de ParaformaldeídoBeyotimeP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=P0099-3L
Penicilina– EstreptomicinaThermofisher15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
Penicilina– EstreptomicinaThermofisher15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
Soro salino tamponado com fosfatoThermofisher10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
Soro salino tamponado com fosfatoThermofisher10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
Papel filtro qualitativoSolarbioYA0166https://www.solarbio.com
Papel filtro qualitativoSolarbioYA0166https://www.solarbio.com
Pacote de software RFundação R para Computação Estatísticav4.2.2https://www.r-project.org/
Pacote de software RFundação R para Computação Estatísticav4.2.2https://www.r-project.org/
Microtomo RotativoLeicaLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
Microtomo RotativoLeicaLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
ScanpyDesenvolvido pela comunidadev1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
ScanpyDesenvolvido pela comunidadev1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
SeuratCRANv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
SeuratCRANv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
Desidratador de tecidosWuhan Junjie Electronics Co., LTDJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
Desidratador de tecidosWuhan Junjie Electronics Co., LTDJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
Máquina de embeção de tecidosWuhan Junjie Electronics Co., LTDJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
Máquina de embeção de tecidosWuhan Junjie Electronics Co., LTDJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
Azul de tripan & nbsp;SolarbioC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
Azul de tripan & nbsp;SolarbioC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
XyleneSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418
XyleneSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418

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