Visualização de Nectários Foliares e Bracteais do Algodão Usando Microscopia Digital para Melhorar a Precisão da Pontuação e a Preservação de Dados

Summary

Aqui, ilustramos processos passo a passo para fenotipagem de nectários foliares e bracteis em plantas de algodão usando imagens geradas por microscopia digital. Este é um método eficaz para marcar os nectários tanto das folhas quanto das brácteas do algodão, pois as informações podem ser coletadas e preservadas na forma de imagens digitais.

Abstract

Nectários são glândulas distintas produtoras de néctar, presentes em muitas espécies de plantas. Os nectários exibem estruturas e funções diversas. No algodão, a pontuação tradicional da característica nectária é propensa a erros, é pouco confiável e apresenta limitações, pois fenótipos dessa característica muitas vezes não são visíveis a olho nu. A expressão das características nectárias é controlada pelos genes, Ne1 e/ou Ne2. Além disso, a expressão de traços pode ser influenciada pelo ambiente e pelos estágios de crescimento, ressaltando a necessidade de métodos de pontuação precisos. Particularmente, a pontuação fenotípica por meio de imagens digitais resulta em um método de pontuação mais preciso dos nectários. Esse método supera as limitações da pontuação tradicional ao gerar imagens de alta resolução. Além disso, facilita a identificação e diferenciação de pequenas diferenças na expressão dos traços nectários, preservando essas imagens digitais para referência futura. Esse método de pontuação fenotipada descrito aqui pode ser facilmente adaptado para pontuar outras características da planta, como glândulas, pelos e cor. Esses métodos de pontuação podem ser adaptados a outras espécies de plantas. Neste artigo, explicamos o procedimento passo a passo sobre como coletar amostras do campo ou estufa, dissecar para observá-las usando microscopia digital e preservar essas imagens para futuras análises de pontuação. Para esse método, usamos, por exemplo, a pontuação de amostras foliares e brácteas de plantas de algodão para diferenciar a presença de nectários (totalmente desenvolvidos, reduzidos e vestigiais) da ausência de necários.

Introduction

As plantas possuem glândulas especializadas chamadas nectários que sintetizam e produzem néctar na maioria das angiospermas, algumas samambaias e algumas gimnospermas ^1,2,3,4. Os nectários são classificados em três tipos: mesofilar, tricomático e epitelial, com base na origem das células que produzem^{néctar 5}. Os nectários do algodão são estomas modificados compostos por tricomas glandulares conhecidos como papilas e classificados como tipo tricomático ^5,6. A maioria das espécies de Gossypium possui nectários; no entanto, o número de nectários presentes neste gênero varia de espécie para^{espécie 7}. Nectários florais (FNs) são mais comuns do que nectários extraflorais (EFNs) nas^{plantas 8}. Esses nectários podem ocorrer em qualquer lugar da planta, exceto nas^{raízes 1,2}. Por exemplo, Gossypium hirsutum apresenta nectários florais e^{extraflorais 9}. As plantas de algodão domésticas apresentam três nectários florais extras^{e um floral 10}. Os três nectários florais extras são foliar, brácteo e circunbracteal¹¹. O nectário foliar é vegetativo e tipicamente está presente nas folhas do lado inferior da nervura central, enquanto os nectários bracteal e circumbracteal são reprodutivos e se desenvolvem na base da bráctea e na superfície do cálice abaxial. O nectário floral está associado a uma flor, que se desenvolve na superfície adaxial (superior) do cálice. Essa característica nectária é controlada por um único locus^{gênico 12}. Estudos de dois grupos de pesquisa independentes identificaram que a característica nectária é controlada por um gene, Ne1 do genoma A ou Ne2 do genoma D, mapeado para os cromossomos 12 e 26, respectivamente^12,13. Essa característica só é expressa em uma condição dupla recessiva, o que significa que apenas uma condição homozigótica recessiva expressará a característica sem nectarismo.

Além desses genes, as condições ambientais e os estágios de crescimento desempenham um papel no controle do grau de expressão. Portanto, é necessário um método preciso para pontuar essa característica. O estudo atual foca na fenotipagem de nectários foliares e bractéeos no algodão. Plantas com nectários visíveis produtores de néctar são pontuadas como nectarias, enquanto plantas que não possuem essa característica são pontuadas como sem nectário 1,2,3,4. O principal objetivo deste artigo é apresentar métodos precisos de pontuação do traço do nectário utilizando tecnologia de microscopia digital. A pontuação tradicional por observação visual direta não consegue detectar facilmente diferenças na variação de expressão da característica nectária in situ a olho nu. Essas diferenças sutis nas expressões dos traços nectários podem ser visualizadas usando microscopia digital. Para ilustrar, no néctário das folhas de algodão, a rubrica de pontuação segue uma escala padrão de 1 a 4, na qual 1 representa ausência de nectário, 2 representa um protuberância no fenótipo da veia, 3 representa almofadas ou cristas subdesenvolvidas sem néctar, e 4 representa nectários totalmente formados/completos com almofadas e cristas^{transparentes 13}. Essa pontuação do fenótipo foi gerada utilizando imagens digitais dos nectários das folhas [usando imagens digitais do lado abaxial (inferior) da nervura central da folha]. Em geral, a ausência de nectários é pontuada como 0, mas para significância estatística, o valor 0 não pode ser usado e substituído pelo valor 1. Assim, a faixa de pontuação do fenotipagem foi modificada para 1-4 em relação à classificação padronizada de^{0-4 13}. A rubrica de pontuação para flores segue um padrão semelhante de 1-4, no qual 1 representa glândulas sem nectário, sem proeminentes e sem almofadas ou cristas, 2 para glândulas obstruídas em que os nectários têm apenas marcas sutis e sem néctar, 3 para glândulas mal formadas com cristas e/ou almofadas ténues ou ausentes, e 4 para nectários totalmente formados com néctar. Esse padrão de pontuação mostra 4 para fenótipos nectários (homozigoto/heterozigótico dominante para um dos genes), 3, 2 para expressão diferencial da característica nectária como em heterozigoto, e 1 para não nectariado (homozigótico recessivo para ambos os genes).

Da mesma forma, flores são coletadas e dissecadas conforme descrito passo a passo neste artigo para coletar imagens digitais para pontuar nectários brácteos. Esse fenótipo pode ser visualizado ao microscópio para uma pontuação precisa que pode ser armazenada na forma de imagens digitais. No algodão, as características nectárias não só atraem polinizadores, mas também atraem pragas que causam perdas de produtividade¹⁴. Para resolver esse problema, os melhoristas selecionaram plantas sem características de nectário (sem nectário) como alternativa para controlar pragas naturalmente, sem o uso de pesticidas químicos^9,15. A característica sem nectari foi originalmente introgredida de Gossypium tomentosum para Gossypium hirsutum (algodão cultivado de terras altas)⁸. Esse método de pontuação é especialmente útil para identificar a segregação de características sem nectário em populações geradas pelo cruzamento de pais nectários com pais sem nectari. Como resultado desses cruzamentos de pais diversos, F₂ (Segunda Geração Filial) mostra diferentes genótipos de homozigóticos nectários, heterozigóticos nectários e homozigóticos nectários. Apenas um gene dominante é necessário para a expressão do traço nectário, que segue a razão de segregação de 15:1 (9:3:3:1). Portanto, 1 em cada 16 expressará a característica sem nectário em condição homozigota recessiva com genótipo ne1ne1ne2ne2. No entanto, pesquisadores em programas de reprodução observaram mais linhagens sem nectário do que a proporção esperada de 1 em 16. Isso significa que a característica do nectário é expressa quando os genes são expressos como Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2. O padrão diversificado de expressão das características nectárias em tais populações de nectários homozigóticos (Ne1Ne1Ne2Ne2), heterozigótico nectarizado (Ne1ne1Ne2ne2), e homozigótico sem nectário (ne1ne1ne2ne2) as plantas podem ser perfeitamente pontuadas ao detectar as mudanças visualizadas nas imagens digitais^12,13. Como plantas heterozigóticas com nectarismo reduzido podem não apresentar o traço do nectário visualmente e podem se assemelhar ao traço sem nectário, o fenotipagem visual representa desafios na seleção confiável dessa característica. Esses problemas aumentam na estação de crescimento tardia, quando os nectários não estão presentes em certos cultivares de algodão. Diferenças entre plantas heterozigotas e plantas homozigóticas sem nectário podem ser facilmente detectadas por imagens digitais, já que plantas heterozigotas podem apresentar pequenos ou reduzidos nectâs, enquanto as homozigóticas não possuem essa característica. Fenotipicamente, a presença de nectário é classificada como nectariada (homozigótica/heterozigótica com pelo menos um gene dominante), a presença de nectários pequenos ou vestigiais como heterozigóticas, e a ausência de nectários como plantas homozigóticas sem nectari. A pontuação digital de imagem reduziu a pontuação imprecisa das plantas heterozigotas como plantas sem nectarismo. Da mesma forma, a fase de floração média é preferida quando há máxima expressão de traços. Assim, amostras de folhas e flores foram coletadas nesta fase para realizar esses experimentos de pontuação fenotipizada, visando uma pontuação precisa e confiável dos traços nectários. Além disso, a visualização de características nectárias usando microscopia digital previne/reduz falsos positivos de populações sem características nectárias. Essa pontuação fenotípica da característica nectária também está sendo usada em estudos de mapeamento para identificar marcadores de DNA associados à característica sem nectário que os criadores podem usar para a seleção assistida por marcadores (MAS) da característica sem nectário¹³. Essa técnica de pontuação pode ser estendida a outras espécies de plantas, além de estudar outras características como glândulas, pelos e cor. No geral, a pontuação digital de imagens não apenas resolve o problema da pontuação imprecisa das características nectárias ao fornecer imagens de alta resolução, mas também identifica mudanças sutis de expressão e armazena as imagens digitais para uso futuro. Algodão com característica sem nectário pode ser usado para controle biológico de pragas, além de responder perguntas de pesquisa sobre como essa característica incentiva interações benéficas com insetos.

Protocol

1. Amostragem de folhas em estufa/campo (Figura 1)

1. Prepare sacos zip-lock de amostra com IDs de amostra. Armazene sacos de amostras em temperatura ambiente até o uso.
2. Coloque o cooler na geladeira um dia antes da coleta da amostra. Coloque uma bolsa de gelo do freezer no fundo do cooler. Coloque uma bandeja plástica sobre a bolsa de gelo dentro do cooler.
   NOTA: Qualquer cooler portátil pode ser usado para esse propósito. Coloque a bolsa de gelo no cooler seguida de uma bandeja plástica (essa separação evita danos por congelamento, que ocorrem pelo contato direto da amostra com o gelo) antes de transportar o cooler para o local de coleta da amostra.
3. Transporte o cooler e sacos ziplock rotulados para a estufa/campo para coletar amostras. Pulverizações regulares foram programadas para as plantas de campo coletarem amostras livres de pragas. Da mesma forma, para plantas de estufa, foram seguidos sprays regulares e programas de fertilizantes para plantas saudáveis.
4. Colete tecido de folhas jovens de plantas individuais de estufa ou algodão cultivadas em campo de 8 a 12 semanas, nos sacos de amostra rotulados.
   1. Selecione a fase de floração média para seleção da amostra devido à maior expressão da característica nectária nessa fase. Selecione folhas jovens de todas as plantas nessa fase de desenvolvimento. Além da influência genética e ambiental, a característica nectária também é influenciada pelo estágio de desenvolvimento.
   2. Para manter o estágio de desenvolvimento constante para comparação entre diferentes genótipos dentro da população de_F2 , colete amostras foliares uniformemente em um estágio para restringir a comparação a esse estágio. Use o tamanho das folhas de 5 a 7 cm como referência, mas o mesmo tamanho de folhas jovens pode ser coletado de todas as amostras. Folhas velhas apresentam expressão de traços nectâreos, mas em algumas linhas, o traço nectário não será expresso em estágios posteriores de desenvolvimento. Para evitar essa variação e melhorar a consistência na coleta de dados, siga estas instruções durante a coleta de amostras.
5. Pegue o tecido foliar da amostra e coloque-o no respectivo saco de amostra. Colha pelo menos 2 folhas por amostra de planta.
6. Para o tecido foliar, selecione folhas saudáveis de 5 a 7 cm de extensão da lâmina a partir do galho superior da planta.
   NOTA: Folhas jovens presentes nos galhos superiores são preferidas para todas as amostras. Esse tipo de coleta de amostras não apenas restringe a amostragem a um estágio específico do desenvolvimento, mas também reduz os erros na fenotipagem ao manter o tipo de amostra constante. Outros parâmetros incluem fácil acesso e folhas saudáveis. A comparação consistente dos dados será feita quando várias folhas de plantas forem coletadas do mesmo estágio de desenvolvimento para identificar diferenças fenotípicas baseadas em genótipo na população.
7. Coloque cada saco de amostra lacrado com o tecido foliar no cooler. Transporte o cooler para o laboratório.
8. Transfira amostras individuais para a geladeira para manter condições de resfriamento de 4 °C. Armazene as amostras na geladeira até fazer uma imagem digital do nectário. As folhas podem ser armazenadas por até 2 dias para imagens digitais, mas é preferível tirar imagens no mesmo dia ou no dia seguinte.
9. Para triagem de um grande número de amostras de folhas, colete amostras em lotes para concluir a imagem no intervalo de 1 dia após a colheita. Colete amostras em lotes de 10 a 20 ou use vários resfriadores para evitar danos ao tecido ou dobras do tecido. Deve-se ter cuidado na coleta de amostras para boas imagens digitais.

2. Amostragem de flores em estufa/campo (Figura 1)

1. Siga os passos 1.1 a 1.6. Colha flores de uma estufa de 8 a 12 semanas ou de uma planta de algodão cultivada em campo. Colha pelo menos 2 flores por amostra de planta.
   1. Colha flores geralmente dos galhos superiores quando as plantas estão no estágio médio de floração. A característica nectária apresenta a maior expressão no estágio médio de floração.
2. Colha flores saudáveis. Coloque cada saco de amostra lacrado com pelo menos duas flores no cooler. Transporte o cooler para o laboratório.
3. Transfira amostras individuais para a geladeira para manter condições de resfriamento de 4 °C. Armazene as amostras na geladeira até obter imagens digitais dos nectários bratéeos.
   1. Processe as amostras no mesmo dia ou no dia seguinte à coleta. Colete amostras de flores, armazene-as a 4 °C e processe os nectários brácteos no mesmo dia. Colha flores que forem produzidas no dia seguinte ou mais tarde na semana e processe para a imagem digital dos nectários brácteos no mesmo dia.

3. Configuração inicial do microscópio digital (Figura Suplementar 1)

NOTA: Outros microscópios comparáveis podem ser usados para capturar e armazenar digitalmente as imagens.

1. Ligue o microscópio (VHX 600) e complete os passos iniciais. Coloque uma folha branca A4 meio dobrada que combine com o tamanho do estágio do microscópio.
2. Ajuste a luz na plataforma/palco do microscópio usando os pequenos botões de luz presentes no controle do console.
3. Gire o interruptor de luz (botão pequeno do console) no máximo para máxima luz e brilho (botão grande do console) em médio-alto girando o botão do console até 3/4.
4. O software embutido VHX 600 mostra opções para ajustar a lente na tela do computador. Ajuste a lente para ampliação de 10x selecionando a opção de 10x na tela. Ligue o interruptor de energia do monitor na tela frontal do computador e o menu principal aparecerá, que mostra opções de lente e gravar imagem.
5. Pegue um pequeno número de amostras (3 a 5) da geladeira para o cooler para imagens digitais. Coloque o cooler com amostras ao lado do microscópio.
6. Mantenha a tábua de cortar e a lâmina estéril na bancada, perto do microscópio. Pegue uma amostra do cooler e retire o tecido da amostra para prosseguir com a imagem digital (Figura 1).

4. Imagem digital e pontuação do nectário das folhas (Figura 2)

1. Siga os passos 1 e 3. Abra o saco ziplock da amostra e coloque a folha sobre a tábua de cortar. Corte o pecíolo da folha usando uma lâmina estéril.
   NOTA: Para uso seguro das lâminas, use luvas e mantenha as bordas afiadas da lâmina voltadas para longe dos seus dedos, com o tecido posicionado entre os dedos durante as incisões.
2. Transfira o tecido foliar para a folha branca pré-cortada colocada no palco. Vire o tecido foliar no centro do palco do microscópio com o lado abaxial voltado para cima.
3. Foque na nervura central da folha girando suavemente os ajustes grosseiros e finos dos botões do microscópio. Continue ajustando até não haver mais desfoque na imagem.
4. Como o nectário está presente na extremidade inferior da nervura central, mantenha-o centralizado onde a nervura central e as veias posteriores divergentes foram observadas. Mantenha a folha centralizada em foco no palco.
   NOTA: Apenas um nectário foliar é observado no algodão doméstico, enquanto os tipos selvagens apresentam três nectários, um na nervura central e um em cada veia lateral de cada lado da nervura central (nectários totais: 3).
5. Ajuste os ajustes grosseiros e finos do microscópio para melhorar a clareza da imagem digital. Faça todos os ajustes da imagem para capturar e salvar a imagem do néctário da folha.
   1. Para evitar reflexão da luz na imagem digital, desligue todas as luzes e grave a imagem na tela do computador. Desligue todas as luzes do ambiente e use uma abajur de mesa para processar cada amostra. Depois de todas as etapas, desligue a lâmpada e deixe apenas a luz do microscópio acesa, gravando a imagem.
6. Salve a imagem assim que o programa mostrar uma janela mostrando várias opções para salvar. Salve a imagem (rotulando cada imagem) com o número de ID da amostra. Avalie a imagem digital do nectário das folhas como 1, 2, 3 e 4 com base no fenótipo do nectário. Atualize sua folha de pontuação para cada ID de amostra.

5. Imagem digital e pontuação do nectário brácteo (Figura 3)

1. Siga os passos 2 e 3. Transfira um pequeno número de amostras de flores (2-3) para imagem. Tire a amostra da flor do saco zip-lock.
2. Remova as brácteas da flor usando pinças ou manualmente à mão. Coloque a flor na tábua de corte limpa. Use uma lâmina estéril para cortar o caule da flor. Use uma lâmina estéril para fazer uma incisão reta ao longo da borda das brácteas removidas.
3. Coloque o tecido de cabeça para baixo (com o pecíolo voltado para cima) sobre a folha branca pré-cortada colocada no palco do microscópio.
4. Use ajustes grosseiros e finos para melhorar a clareza da imagem exibida na tela. Faça todos os ajustes de imagem e clique no botão de gravação no controle do console para capturar a imagem da folha.
   1. Faça ajustes de imagem ajustando o botão pequeno/interruptor de luz no máximo e o botão grande/interruptor de brilho no médio-alto (girando o botão para 3/4^{de éstemo}). Depois, melhore a resolução da imagem girando os ajustes grosseiros e finos do microscópio. Mantenha esses ajustes constantes e troque as amostras até que as imagens sejam registradas para todo o conjunto de amostras. Para evitar reflexos de luz na imagem digital, desligue todas as luzes e grave a imagem no computador.
5. Em seguida, o programa solicita uma janela mostrando todas as localizações dos computadores para salvar a imagem. Salve a imagem digital no computador com o número de identificação da amostra.
6. Pontue os nectários bracteaux (Figura Suplementar 2) com 1, 2, 3 e 4 com base no fenótipo observado nas imagens digitais adquiridas. Atualize a folha de pontuação com o ID do exemplo e a respectiva pontuação para análises futuras

Results

Plantas de algodão cultivadas no campo por 8 a 12 semanas foram selecionadas para este estudo. Pelo menos duas réplicas técnicas foram coletadas para cada planta por tipo de tecido. Amostras saudáveis de folhas jovens são coletadas dos galhos superiores com lâminas de 5 a 7 cm de comprimento. Amostras de flores saudáveis são coletadas de flores abertas ou botões que abrirão no mesmo dia. Amostras de folhas e flores foram coletadas no campo de diferentes linhagens de plantas, e imagens digitais foram geradas para ambos os tipos de tecido no laboratório usando um microscópio (Figura 1). Todas as etapas foram seguidas conforme descrito acima no procedimento, desde a coleta da amostra até a imagem (conforme explicado nas Figuras 2 e 3). Os resultados representativos tanto para nectários foliares quanto bracteais tipicamente mostram a ausência de nectário (1), a presença de nectário com fenótipos intermediários (2, 3) e nectários totalmente desenvolvidos produzindo néctar (4). Os dados gerados na Figura 4 são as imagens digitais adquiridas de duas plantas de algodão diferentes (nectariada e sem nectari). Os resultados da avaliação digital da superfície abaxial da folha (no lado inferior da nervura central) mostraram dois fenótipos com pontuações 1 (sem nectários na nervura central) e 4 (com nectário totalmente desenvolvido com néctar; Figura 4A,B). De forma semelhante, quando amostras de flores foram analisadas para néctários bracteais, mostraram dois fenótipos: 1 (sem nectário) e 4 (néctar totalmente formado; Figura 4C,D). Idealmente, tanto as folhas quanto as flores coletadas da mesma planta devem seguir o mesmo padrão, o que significa que a folha sem nectário e a flor sem nectário devem pertencer a uma única planta, enquanto a folha nectariada e a flor nectariada devem pertencer à mesma planta. A Figura 5 é produzida pela coleta de imagens digitais tanto das folhas quanto dos nectários brácteos de plantas nectárias em 10x, 20x e 40x para visualizar claramente as características nectárias. Além disso, para entender como essa pontuação é feita na segregação das populações F₂ de algodão geniais nectariados e sem nectário, tecidos foliares foram coletados de uma dessas populações e imagens digitais foram produzidas para cada amostra de nectário foliar. Imagens digitais selecionadas em folhas correspondentes à pontuação padrão de 1, 2, 3 e 4 estão destacadas na Figura 6¹³. O padrão comum e fácil de identificar é a ausência de nectário e a presença dele. A ausência de nectário recebe a menor pontuação, enquanto um nectário totalmente desenvolvido recebe a maior pontuação de 4. A faixa de pontuações entre 1 e 4, que é 2, 3, é subdesenvolvida e menor que a dos nectários comuns. Esse padrão pode ser observado em nectários homozigóticos, que são 1 (ausente), condição heterozigótica como em 2 e 3 pontuações (nectários reduzidos) e 4 nectários (totalmente desenvolvidos). Além disso, linhagens parentais nectariadas e sem nectário podem ser cultivadas junto com as populações para comparar e compreender essas diferenças.

Figura 1: Visão geral das etapas de visualização de nectários foliares e brácteos, começando da amostragem até a microscopia digital. (A) Selecione as plantas de algodão em estágio intermediário de floração para coleta de amostras de folhas e flores. (B) Coletar amostras de folhas do campo para observar características de nectário na folha. (C) Vire a folha para que o lado abaxial da folha fique voltado para cima e observe a característica do nectário na região da caixa preta destacada. (D) Coloque a folha no palco do microscópio e mantenha o foco na região da caixa preta destacada para registrar imagens digitais do nectário da folha. (E) Colhe flores no estágio de floração do campo (A). (F) Faça uma incisão colocando a flor sobre uma tábua de corte e incisa em linha reta na região da caixa branca, na direção da seta, separando a base da flor. (G) Coloque a seção incisa no palco do microscópio para imagens digitais dos nectários brácteos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Procedimento passo a passo para imagem digital e avaliação dos nectários foliares no algodão. 1. Colete material foliar do campo em sacos de amostra rotulados e coloque em um refrigerador 2. Transporte o cooler com as amostras para o laboratório 3. Retire amostras individuais do cooler 4. Abra o saco individual da amostra e retire a folha 5. Corte o pecíolo da folha manualmente ou use uma lâmina. 6. Coloque a folha no palco pré-definido do microscópio com o lado abaxial (inferior) voltado para cima 7. Ajuste o zoom para 10x no programa VHX 600 da tela do computador. Ajuste ajustes grosseiros e finos do microscópio para obter a melhor resolução da imagem. 8. Observe a tela do computador para quaisquer ajustes da imagem observados nela (ajuste a luz e o brilho controlados por botões pequenos e grandes girando esses botões, use botões finos e grossos no microscópio para melhor resolução de imagem, e desligue outras luzes para remover reflexos, etc.) no néctário da folha 9. Salve a imagem digital para a pontuação. O traço circular ao redor do néctário na folha destaca a região do néctário das folhas nas imagens 8 e 9. Observe os nectários das folhas ao microscópio com ampliação de 10x (100 μm). Apenas um nectário foliar é observado no algodão doméstico (como observado nesta imagem). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Procedimento passo a passo para imagem digital e avaliação dos nectários brácteos no algodão. 1. Colete amostras de flores do campo nos sacos rotulados e guarde-as no refrigerador 2. Remova uma amostra do cooler 3. Tire uma flor 4. Remova as brácteas manualmente cortando-as longe da flor 5. Faça uma incisão usando uma lâmina estéril cortando ao longo da borda bracteal em linha reta (caixa branca mostrada na Figura 1 antes de prosseguir para a imagem digital dos nectários brácteos) 6. Vire a seção 7 incisiva. Coloque a seção incisa com o lado do pecíolo voltado para cima no palco do microscópio estágio 8. Faça ajustes de luz usando os interruptores de luz e brilho do console acoplado ao microscópio. Use ajustes grosseiros e finos no microscópio para coletar imagens com boa resolução. Todas as imagens são observadas ao microscópio com ampliação de 10x (100 μm). Colete imagens digitais para marcar os nectários bratecais. Círculos nas imagens digitais do nectário brácteo destacam a presença de nectânico, e há 3 nectários brácteos no algodão doméstico. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Imagens digitais de néctário de folhas de algodão e néctário brácteo. (A) Folha com nectário; (B) Folha sem nectário; (C) Flor mostrando 3 nectários bracteais, e (D) Flor sem nectários bracteais. Observe tanto os nectários das folhas quanto das flores ao microscópio com uma ampliação de 10x (100 μm). Círculos traçados mostram a presença e ausência de nectário no nectário das folhas e nos néctários brácteos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Os nectários foliares e bracteais foram ampliados em 10x, 20x e 40x para identificação clara dos nectários em imagens digitais. (A) Colete amostras de folhas para observar a característica do nectário na nervura central. (B) Observe o nectário foliar na nervura central sob o microscópio com ampliação de 10x. (C) Observe o nectário foliar na nervura central ao microscópio com ampliação de 20x. (D) Observe o nectário da folha na nervura central sob o microscópio com ampliação de 40x. (E) Incisão na seção da flor para nectários brácteos. (F) Observar nectários brácteos ao microscópio com ampliação de 10x. (G) Observar nectários brácteos ao microscópio com ampliação de 20x. (H) Observar nectários brácteos ao microscópio com ampliação de 40x. As barras de escala em cada imagem representam a ampliação com que as imagens do nectário foliar ou do nectário bratéal foram tiradas (como mostrado aqui como 10x, 20x e 40x). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Padrão padrão de pontuação do nectário foliar seguindo padrões 1, 2, 3 e 4. (A) Amostra de folha sem néctário, conforme destacado nos círculos tracejados (Pontuação 1 para ausência de nectário). (B) O pequeno nectário de folhas observado mostra um padrão de uma das condições heterozigotas (imagem do círculo tracejado do nectário pontuada como 2). (C) Nectário foliar com pontuação 3, outro padrão do heterozigoto. (D) Nectários totalmente formados com pontuação 4. A escala 10x representa a ampliação com que as imagens foram tiradas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Nectário foliar e nectários brácteos sem usar microscópio. A figura mostra como os nectários aparecem com a pontuação tradicional. Esse número foi adaptado de¹³. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 8: Genótipos possíveis da população A figura mostra genótipos das populações F₂ resultantes de um cruzamento de pais diversos, nectários e sem nectari. Esta tabela foi adaptada de¹³. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Configuração do microscópio digital. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Número diferente de nectários brácteos observados. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Nectários são tricomas glandulares especializados que produzem néctar nas plantas para uma polinização cruzada bem-sucedida. Tanto nectários vegetativos quanto reprodutivos estão presentes nas plantas. Gossypium gênero (algodão) possui mais de 50 espécies, e a maioria delas contém¹⁶ necários foliares. No entanto, essa característica no algodão também atrai pragas, levando a perdas adicionais de^{rendimento 17}. Os criadores selecionaram características naturalmente sem nectários (ausência de nectários) descobertas pela primeira vez em G. tomentosum para resolver esse problema. Por essa razão, eles introduziram essa característica sem nectário no algodão cultivado das terras^{altas 17}. Eventualmente, várias populações foram geradas selecionando linhagens nectárias e sem nectário como pais. Como populações homozigóticas e heterozigóticas sem nectarios não apresentam diferenças quando observadas a olho nu, é necessário um instrumento especial para diferenciar essas plantas. Portanto, esse método de pontuação por microscopia digital, ao contrário da pontuação tradicional (como mostrado na Figura 7), não apenas visualiza a redução dos nectários, mas também previne a pontuação imprecisa de plantas heterozigóticas sem nectário como homozigóticas.

A pontuação fenotípica usando imagens digitais depende de vários fatores-chave, como o momento específico da coleta da amostra, seleção da amostra, uso de uma escala padrão de pontuação para nectários foliares e brácteos, possível genótipo e como os dados de pontuação podem ser interpretados para aplicações posteriores. Primeiramente, é importante coletar folhas e flores durante a estação de crescimento, quando a secreção de nectário está mais alta, geralmente no meio da floração em julho. Em segundo lugar, a escolha de folhas ou flores no tamanho e estágio adequados desempenha um papel fundamental na pontuação do fenótipo. Para as folhas, galhos superiores com lâminas de 5 a 7 cm de comprimento foram preferidos para marcar os nectários foliares. Da mesma forma, para a pontuação de nectares brácteos, foram escolhidas flores saudáveis dos galhos superiores. A seleção da amostra em estágios específicos do desenvolvimento ajuda, mesmo ao comparar todas as plantas dentro de uma população, excluindo expressões de características dependentes do estágio do desenvolvimento (como mostrado na Figura 8). Para verificar se a pontuação é repetível, imagens digitais foram geradas para pelo menos duas amostras por tecido e planta. Coletar múltiplas réplicas da mesma planta ajuda a uma coleta consistente de dados.

A possível limitação do método é manter as plantas livres de pragas até a coleta da amostra. As áreas de infestação de pragas podem ser identificadas por manchas de tecidos ou ovos depositados nos tecidos ou por danos às regiões nectárias, com áreas pretas sem aparência visual de nectário devido ao consumo por pulgões ou outros insetos. Isso foi observado durante a triagem de centenas de amostras. Nesses casos, folhas e flores saudáveis foram coletadas novamente e analisadas para obter dados consistentes dessas amostras. Isso pode ser resolvido mantendo cronogramas regulares de controle de pragas e suplementando fertilizantes para obter plantas saudáveis. Seguir todos os passos críticos descritos ajudará na resolução de problemas para a pontuação de fenótipos.

Essa técnica tem várias aplicações, como o mapeamento para identificar marcadores de DNA que ajudam os melhoristas a identificar genótipos para seleção assistida por marcadores. Essa pontuação do fenótipo requer confirmação a partir de marcadores de DNA devido às influências ambientais e do desenvolvimento, além dos genes que controlam essa característica. Portanto, fenotipar essa característica usando microscopia digital será um ponto de partida para restringir um grande número de plantas de várias populações a um pequeno número de linhas suspeitas de não nectari. Utilizando marcadores de DNA, essas linhagens são ainda validadas para uso em programas de melhoramento visando desenvolver resistência a doenças mediada por características sem nectário em variedades recém-desenvolvidas. Esse método também pode ajudar os pesquisadores a entender o papel da característica nectária nas plantas e nas interações benéficas com insetos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio Digital	Keyence VHX	VHX 600	Outros microscópios podem ser usados
Tábua de cortar Farberware	Farberware	Modelo nº 78892-10	14''L x 11''W x 0,5''Th, qualquer marca pode ser usada, esta está disponível na amazon.com
Igloos Laguna pequeno refrigerador de 9 QT	Iglu	Número da peça 00043567	Qualquer marca ou tamanho de acordo com a necessidade do projeto pode ser usada
Sacolas plásticas (400 unidades), 3 x 4 polegadas	Marca Aubeco	NA	4''L x 3''W x 0,01''H, qualquer marca pode ser usada, preferencialmente plástico transparente colorido
Single  Lâminas de barbear de fio, pacote de 100	Weupe	NA	Qualquer marca pode ser usada, esta está disponível na amazon.com