Padronização Biológica da Biofabricação Humana Baseada em ASC para Construções Reprodutíveis de Tecidos em Macroescala

Resumo

Este estudo apresenta um fluxo de trabalho de biofabricação reprodutível usando esferoides de células-tronco derivadas de adiposos e andaimes GelMA impressos em 3D. Ele demonstra controle espacial, capacidade de fusão e métricas de controle de qualidade, resultando em construções de tecido em macroescala transplantáveis com potencial de aplicações em medicina regenerativa.

Resumo

A falta de protocolos padronizados entre os laboratórios representa uma barreira significativa para a comparabilidade dos resultados experimentais e para a transferência eficiente das tecnologias de biofabricação. A rigorosa padronização biológica não apenas aumenta a reprodutibilidade, mas também facilita o alinhamento com os marcos regulatórios nacionais e internacionais, essenciais para a tradução clínica das estratégias de engenharia de tecidos. Este estudo introduz um fluxo de trabalho padronizado de biofabricação que inclui cultura monocamada de hADSCs, formação de esferoides, impressão 3D de andaimes de Gelatina Metacriloila (GelMA) e biomontagem esferoide. Métricas de controle de qualidade foram integradas para garantir a reprodutibilidade. O andaime GelMA impresso em 3D foi projetado com dois poros centrais, cada um capaz de abrigar centenas de esferoides. A fidelidade da impressão foi confirmada comparando as dimensões do andaime com o modelo CAD, com pequenas desvios não significativos. Os hADSCs formaram esferoides uniformes em 24 horas em micromoldes de agarose. Quando semeados em poros de andaime, os esferoides passaram por fusão contínua ao longo de 72 horas, formando construções em macroescala confirmadas por imagem confocal. O design dos andaimes e a precisão da impressão garantiam suporte estrutural, enquanto a uniformidade dos esferoides permitia a formação previsível da construção. A fusão de esferoides dentro dos poros do andaime resultou em construções teciduais adequadas para transplante, com ou sem o andaime, destacando a versatilidade dessa abordagem de bioassemblagem. Os resultados ressaltam o papel fundamental da padronização biológica no avanço de metodologias reprodutíveis para a biofabricação de construtos de tecidos vivos, com implicações promissoras para futuras aplicações clínicas na medicina regenerativa.

Introdução

Biomontagem e bioimpressão são abordagens complementares de biofabricação em engenharia de tecidos que focam na construção de tecidos e órgãos complexos em escala macro usando tecnologias^{automatizadas} 1,2,3,4.

Esferoides foram incorporados à biofabricação como blocos de construção principalmente para abordagens de biomontagem⁵. Esferoides são considerados microtecidos que reproduzem interações entre células e o microambiente tecidual ao redor in vivo. Entre as fontes celulares usadas para a formação de esferoides, as células-tronco derivadas de adiposo (ADSCs) se destacam pela facilidade de isolamento, manutenção de cultivo a longo prazo e potencial^{de diferenciação 6,7,8}.

Devido à sua capacidade intrínseca de formar agregados maiores, os esferoides podem gerar construtos teciduais mais complexos quando submetidos a abordagens de bioassemblagem. Essa organização orientada à fusão aumenta o potencial regenerativo e de diferenciação dos esferoides de células-tronco ^9,10.

A biomontagem esferoide pode ser suportada ou até guiada por biomateriais¹¹, tornando essa estratégia adequada para biofabricação escalável e^{automatizada 12,13.}

As estratégias de biofabricação existentes podem ser amplamente categorizadas em abordagens de montagem de esferoides sem andaimes e sistemas de bioimpressão embutidos em^{hidrogel 2,5,14}. Métodos sem andaime dependem exclusivamente da auto-montagem celular espontânea e da fusão interesferoide, aproveitando interações intrínsecas célula-célula. No entanto, por ocorrerem sem orientação arquitetônica externa ou confinamento geométrico, essas abordagens apresentam controle espacial reduzido e menor previsibilidade^{estrutural 5,15}. Em contraste, abordagens de encapsulamento baseadas em hidrogel incorporam células em matrizes de massa para fornecer suporte estrutural e arquitetura^{pré-definida 16,17}, o que pode restringir parcialmente o contato direto célula-célula durante os estágios iniciais de fusão e influenciar a dinâmica de migração^{celular 18}. Nesse contexto, biomateriais imprimíveis como Gelatina Metacriloíla (GelMA) apresentam motivos de adesão celular e podem funcionar como andaimes para facilitar a biomontagem^{esferoide 19}. Um andaime GelMA impresso em 3D é hipotetizado como fornecendo confinamento geométrico e orientação espacial para esferoides, promovendo assim a formação controlada de tecidos por meio da fusão em construtos maiores e estruturalmente definidos. Essa abordagem visa melhorar o controle espacial e a reprodutibilidade estrutural durante a biomontagem esferoide, combinando a organização guiada por andaimes com a fusão esferoide dentro de uma arquitetura hidrogel definida. No entanto, o fluxo de trabalho atual foca na padronização de processos e parâmetros de biofabricação estrutural, e não aborda maturação de tecidos de longo prazo, diferenciação funcional ou produção automatizada em larga escala.

A padronização biológica é essencial não apenas para garantir reprodutibilidade e escalabilidade, mas também para preservar a integridade funcional dos tecidos^{biofabricados 19,20}. Consequentemente, o controle preciso dos parâmetros de engenharia, geométricos e estruturais é fundamental, pois esses fatores influenciam diretamente o desempenho biológico, incluindo a função e maturação do tecido ^5,21. É apresentado um fluxo de trabalho padronizado e reprodutível de biofabricação, abrangendo as seguintes etapas-chave: (1) cultura de monocamadas ASC; (2) formação de esferoides ASC; (3) impressão 3D do andaime GelMA; e (4) biomontagem esferoide (Figura 1). Dentro desse fluxo de trabalho, métricas objetivas de controle de qualidade foram estabelecidas, incluindo uniformidade e esfericidade esferoide, fidelidade de impressão e integridade da forma do andaime.

Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de micromoldes de agarose e fabricação de andaimes impressos em 3D com GelMA

1. Produção do micromolde de agarose a 2% em solução de cloreto de sódio (NaCl) a 0,9% (ver Figura 2A)
   NOTA: Todos os resíduos químicos devem ser manuseados e descartados de acordo com as regulamentações institucionais de segurança química e as diretrizes de resíduos perigosos.
   1. Prepare uma solução de NaCl 0,9% em água ultrapura e autoclave por 30 minutos a 121 °C. Mantenha sob condições estéreis até o uso.
   2. Dilua 1 g de agarose ultrapura estéril em 50 mL de solução de NaCl 0,9%. Homogeneize e despolimerize a agarose em um micro-ondas em intervalos de 10 s por 3–5 ciclos, até que esteja totalmente dissolvida.
   3. Em um armário de segurança biológica, posicione um molde de silicone comercialmente disponível contendo 81 reentrâncias circulares sobre gaze estéril.
   4. Deposite cuidadosamente 600 μL de agarose no centro do molde de silicone e deixe repousar por 40 minutos para garantir a polimerização completa.
   5. Demolde cuidadosamente o micromolde de agarosa totalmente polimerizado e transfira-o para um poço de uma placa microtitulada de 12 poços.
   6. Ajuste a posição do micromolde de agarose e fixe-o no fundo do poço preenchendo com 600 μL de agarose.
   7. Pré-incube o micromolde incubando com a Eagle Modified Medium Low Glucose (DMEM, 2 mL/poço) da Dulbecco por 15 minutos. Repita esse procedimento duas vezes e, na terceira incubação, substitua pelo meio de cultivo tridimensional (3D), composto por DMEM suplementado com ácido ascórbico (50 μg/mL), albumina sérica humana (1,25 μg/mL), penicilina-estreptomicina (PS, 1×, de uma solução 100×) e suplemento ITS (1×, de uma solução 100× estoque).
      NOTA: O meio de cultura 3D difere do meio de expansão monocamada pela ausência de Soro Bovino Fetal (FBS) e pela inclusão de suplementos definidos que promovem a interação célula-célula e o suporte da matriz extracelular, favorecendo a auto-montagem e estabilização adequada dos esferoides. Se a produção de mofo e o revestimento celular forem realizados em dias diferentes, o procedimento pode ser pausado após a segunda incubação de DMEM, e os moldes devem ser armazenados em condições estéreis em uma incubadora umidificada a 37 °C por até 5 dias. A terceira incubação com meio de cultura 3D deve ser realizada apenas no dia do placagem. Antes de semear as células, remova completamente o meio tanto do poço quanto do micromolde.
2. Preparação do hidrogel de Gelatina Metacriloíla (GelMA)
   NOTA: Todo o procedimento deve ser realizado no escuro, pois os reagentes são fotossensíveis. Neste estudo, foram usados GelMA (força do gel 300 g Bloom, grau de substituição 60%) e o fotoiniciador fenil-2,4,6-trimetilbenzoifosfinato (LAP). Para preparar 10 mL de uma solução de GelMA a 10% de peso e peso e a vapor contendo 0,5% de peso livre/v de LAP:
   1. Dissolva 50 mg de pó LAP em 1 mL de DMEM, misturando suavemente com uma pipeta até obter uma solução clara e homogênea.
   2. Transfira a solução LAP para um tubo centrífugo contendo 9 mL de DMEM e misture bem.
   3. Em um gabinete de segurança biológica, esterilize a solução resultante por filtração através de um filtro de 0,22 μm.
   4. Adicione 1 g de GelMA à solução e homogeneize usando agitação magnética a 50 °C por aproximadamente 3 horas, ou até que uma solução clara e homogênea seja obtida. Segure o frasco à luz para garantir que a solução esteja livre de partículas visíveis e turbidez.
   5. Coloque o hidrogel resultante em uma seringa de 10 mL para impressão subsequente ou, se não for usado imediatamente, armazene-o a 2–8 °C, protegido da luz, até o uso.
      NOTA: As soluções GelMA e LAP foram usadas aproximadamente 24 horas após a preparação. O armazenamento prolongado dessa solução não é recomendado. Tanto os pós GelMA quanto LAP devem ser armazenados a 2–8 °C, conforme as instruções do fabricante. O fotoiniciador LAP é classificado como não perigoso de acordo com normas como ABNT NBR 14725 e Regulamento (EC) nº 1272/2008. No entanto, o fabricante recomenda o uso de equipamentos de proteção individual para prevenir irritações respiratórias, de pele e oculares. Recomenda-se o uso de óculos de segurança testados e aprovados de acordo com normas governamentais relevantes, como NIOSH (Instituto Nacional de Segurança e Saúde Ocupacional - EUA) ou EN 166 (UE), bem como luvas de borracha nitrila com espessura mínima de 0,11 mm. A proteção respiratória é necessária apenas quando poeira é gerada. As recomendações do fabricante sobre proteção respiratória com filtro baseiam-se em normas como DIN EN 143, DIN EN 14387 e outras normas complementares relacionadas ao sistema específico de proteção respiratória em uso. O fabricante recomenda o uso de um filtro do tipo P1.
3. Design de modelos 3D, fatiamento e geração do arquivo G-code
   NOTA: O modelo de andaime 3D foi projetado usando o software online de design assistido por computador 3D (CAD) Tinkercad. Para esse protocolo, foi gerado um andaime cilíndrico com diâmetro de 15 mm, espessura do fundo de 1 mm e dois poros circulares, cada um com diâmetro de 5,50 mm e profundidade de 2 mm.
   1. Uma vez concluído o design do modelo 3D, exporte-o como um arquivo *.stl (Arquivo Suplementar 1).
   2. Abra o software Repetier-Host V2.3.2, que será usado para slicear o modelo projetado.
   3. Na aba "Slicer", selecione a opção de slicer desejada. Neste estudo, foi utilizado o CuraEngine .
   4. Configure o perfil de parâmetros apropriado. Neste trabalho, Velocidade 10 mm/s; Altura da camada 0,2 mm; Padrão de Preenchimento: Grade; Foram usados diâmetros de bocal de 0,41 mm.
   5. Carregue o arquivo *.stl do modelo 3D a ser impresso.
   6. Na aba "Slicer", selecione a configuração criada anteriormente.
   7. Clique em "Slice com CuraEngine". O modelo 3D fatiado será então visualizado na interface de software.
   8. Clique em "Salvar no Arquivo" para salvar o arquivo G-code no local desejado.
4. Impressão 3D de andaimes de hidrogel de Gelatina Metacriloila (GelMA) para biomontagem esferoide
   NOTA: A impressão 3D deve ser realizada em condições estéreis. Portanto, antes de iniciar o processo de impressão, verifique se o armário de segurança biológica que abriga a impressora está ligado e se o fluxo de ar está funcionando corretamente. Confirme que a altura do vidro de proteção do armário está na mesma altura da marcação do sensor do equipamento.
   1. Remova as travas de segurança da bioimpressora.
   2. Remova a placa de vidro da base de impressão soltando os clipes de metal.
   3. Anexe um guia acrílico de formato apropriado para apoiar a fixação da placa de cultura na plataforma de impressão, usando os clipes de metal.
   4. Conecte a impressora à fonte de energia. Note que este equipamento suporta tensão dupla (110/220 V).
   5. Conecte o cabo USB da impressora ao computador.
   6. Aperte o botão ligar/desligar para ligar a impressora.
   7. Abra o software Repetier-Host V2.3.2, que será usado para visualizar o modelo 3D e imprimir.
   8. Clique na opção "Conectar" na interface do software.
   9. Usando o controle manual por software, selecione o extrusor (1 ou 2) e envie o cabeçote de impressão para a posição inicial (X = 0, Y = 0, Z = 0).
   10. Ajuste o extrusor selecionado para encaixar corretamente a seringa usando a ferramenta apropriada do controle manual no Repetier.
   11. Insira cuidadosamente a seringa no extrusor, já carregado com hidrogel e conectado a um bico de extrusão (neste estudo, usamos um bico cônico de polipropileno com diâmetro interno de 0,41 mm).
   12. Encaixe a placa de cultura no guia acrílico preso à base de impressão.
   13. Ajuste a posição inicial Z (Z = 0) usando o parafuso de parafuso Z localizado no lado esquerdo da bioimpressora. Ou seja, definir a distância desejada entre o bico de extrusão e a superfície de impressão. Idealmente, o bico deve tocar levemente o substrato, que neste estudo era a placa de cultura.
   14. Volte o cabeçalho de impressão para a posição inicial.
   15. Carregue o arquivo G-code gerado anteriormente.
   16. Usando a ferramenta de controle manual apropriada no software, extruda um pouco do hidrogel da seringa para garantir o fluxo do material através do bico.
   17. Comece o processo de impressão.
   18. Após a impressão, realize a fotocruzamento do andaime resultante usando o sistema de luz UV da bioimpressora 3D, equipado com dois LEDs a 395-400 nm. Expõe o andaime à luz UV por 5 minutos (intensidade luminosa de 20 mW/^cm2).
   19. Use a mesma solução despolimerizada de agarose a 2% usada na fabricação dos micromoldes, fixando os andaimes impressos em 3D aos poços de uma placa de cultivo de 12 poços. Fixar os andaimes ao fundo dos poços é necessário para proporcionar maior estabilidade e evitar o deslocamento durante a semeadura dos esferoides e durante todo o período de cultura.
       NOTA: Ao realizar o passo 4.16, verifique se o hidrogel forma um filamento contínuo durante a extrusão. Normalmente, a solução de gelatina é carregada na seringa ainda em estado líquido (aproximadamente 37 °C). Em poucos minutos, em temperatura ambiente (22–25 °C), esse biomaterial começa a fazer a transição para uma consistência semelhante a um gel. O material não deve pingar durante a extrusão, pois isso afetaria negativamente a qualidade da impressão. A formação contínua de filamento durante a extrusão indica que o hidrogel atingiu uma consistência ideal para impressão. A solução de GelMA e LAP diluída em DMEM apresenta uma coloração levemente alaranjada. Após a fotocruzamento induzida por UV, uma mudança de cor é comumente observada, com o material tornando-se esbranquiçado ou translúcido, como mostrado na Figura 3D,E. Ao operar o sistema UV, os óculos de proteção são obrigatórios para garantir proteção ocular adequada contra radiação ultravioleta.
5. Análise de fidelidade de impressão
   NOTA: A análise de fidelidade da impressão 3D dos andaimes GelMA considera os seguintes parâmetros: diâmetro do andaime, diâmetro dos poros e espessura do andaime. O software ImageJ Versão 1.54 foi usado para realizar as medições.
   1. Primeiro, capture imagens dos andaimes observados por um estereoscópio. Use uma régua ou um calibre como referência.
   2. Antes de analisar as imagens, calibre e ajuste a escala no ImageJ para realizar as medições.
   3. Use a ferramenta de linha reta para realizar as medições.
   4. Como tanto o andaime quanto o formato dos poros são circulares, use a média aritmética dos diâmetros do andaime e dos poros para análise estatística.
   5. Para análise de fidelidade de impressão, compare as medições obtidas pelo ImageJ a partir dos andaimes impressos com os valores definidos no modelo 3D gerado pelo Tinkercad.
      NOTA: A espessura do andaime impresso medida é comparada com a soma dos valores de profundidade dos poros e espessura do fundo projetados no Tinkercad.
   6. Realize uma análise estatística dos dados obtidos. Nesse caso, para comparar os valores medidos do andaime com os valores esperados, pode-se usar o teste Mann-Whitney U (não paramétrico). O teste de Shapiro-Wilk é usado para avaliar a normalidade. As diferenças são consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05.

2. Preparação de hADSCs e formação de esferoides

NOTA: Células-tronco mesenquimatosas humanas derivadas do adiposo (hADSCs) comercialmente disponíveis foram cultivadas em meio de crescimento específico para células e passadas em confluência de 80%–90%, conforme recomendações do fabricante. As células foram usadas até a passagem 7 para esse protocolo. Todos os resíduos biológicos devem ser devidamente descontaminados ou esterilizados antes do descarte e manuseados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança. Para visualização confocal subsequente, a monocamada deve ser marcada com um corante fluorescente antes da formação esferoide e incubada conforme recomendado pelo fabricante. A formação de esferoides pode ser iniciada 30 minutos após a rotulagem.

1. Tripsinização da monocamada ASC
   1. Em um armário de segurança biológica, abra o frasco de cultura e transfira seu conteúdo para um recipiente de resíduos.
   2. Lave a monocamada duas vezes com 1× de Soro Tamponado com Fosfato (PBS) e descarte a solução.
   3. Adicione 0,125% de solução de tripsina/EDTA suficiente para cobrir a monocamada. Feche o frasco e incube em uma incubadora umidificada a 37 °C por até 5 minutos.
   4. Inative a tripsina/EDTA adicionando um volume igual de DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS).
   5. Colete a suspensão celular usando uma pipeta sorológica ou transfira para tubos centrífugas. Centrifuge a 400 x g por 5 minutos em temperatura ambiente (20–25 °C).
   6. Descarte cuidadosamente o sobrenadante.
   7. Resuspenda o pellet celular no DMEM e homogeneize. Faça uma aliquota para contagem de células e avaliação de viabilidade.
2. Cultura esferoide (ver Figura 2B)
   1. Separe o número apropriado de células a serem placadas para cada molde em um tubo centrífugo de 15 mL. Para hADSCs, cada molde de agarose contendo 81 recessos deve receber 1 × 10⁶ células — um esferoide se forma em cada micropoço, resultando em 81 esferoides por micromolde.
   2. Adicione 1× PBS e centrifuge a 500 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e adicione 1× PBS. Repita essa etapa duas vezes.
   3. Após a terceira centrifugação, descarte cuidadosamente o sobrenadante e seque a abertura do tubo com gaze estéril antes de retorná-la à posição vertical.
   4. Ressuspenda o pellet celular em 120 μL de meio de cultura 3D para cultura esferoide e homogeneize. Ajuste o volume da suspensão para 200 μL com meio de cultura 3D adicional, se necessário.
      NOTA: Cada molde com 81 ressecções tem capacidade de 200 μL.
   5. Aspire 200 μL e coloque cuidadosamente no centro do molde, evitando a formação de bolhas.
      NOTA: Esta etapa pode ser automatizada usando um sistema robótico de pipeteamento, conforme descrito^{anteriormente 22}.
   6. Deixe a placa no armário de segurança biológica por 5 minutos para permitir que as células se assentem nas ressecções.
   7. Coloque o prato em uma incubadora umidificada por 40 minutos.
   8. Após esse período, adicione cuidadosamente 2 mL de Medium 3D a cada poço. Retorne a placa ao incubador umidificado a 37 °C.
3. Medição e análise estatística de esferoides
   1. Capture imagens dos esferoides posicionados ao longo das duas diagonais do micromolde de agarose, formando um padrão em "X", usando um microscópio óptico invertido equipado com uma câmera digital e um objetivo de 10×. Use a barra da escala de 100 μm para calibrar a escala da imagem antes de medir os diâmetros.
   2. Para determinar os diâmetros principais e menores dos esferoides, use a ferramenta "line" do software e realize duas medições perpendiculares para cada esferoide fotografado, com um ângulo aproximado de 90° entre eles.
   3. Calcule o diâmetro médio de cada esferoide como a média aritmética dos dois diâmetros perpendiculares previamente medidos. Calcule a esfericidade como a razão entre o maior e o menor diâmetro de cada esferoide, com valores mais próximos de 1 indicando maior uniformidade e uma forma mais esférica.
   4. Realize análises estatísticas usando os valores obtidos de diâmetro e esfericidade.

3. Semeadura de esferoides em andaimes GelMA para fusão e biomontagem de esferoides

1. Após 24 horas de formação esferoide, colete-as dos micromoldes de agarose usando uma pipeta com pontas de amplo calibre e transfira-as para microtubos de 2 mL.
2. Quando os esferoides se depositarem no fundo dos microtubos, descarte o sobrenadante.
3. Resuspenda os esferoides em 50 μL de Meio 3D.
4. Usando uma pipeta com pontas de grande diâmetro, recolha os esferoides e insifique-os suavemente nos poros do andaime GelMA.
   NOTA: Em um poro de suporte GelMA com cerca de 5,50 mm de diâmetro e 2 mm de profundidade, semeia aproximadamente 480 a 640 esferoides (correspondentes a 6–8 micromoldes de agarose, cada um gerando 81 esferoides com diâmetros variando de 200 a 400 μm) em 50 μL. Essa estimativa foi baseada no volume dos poros e no diâmetro médio dos esferoides, com quantificação realizada pelo número de micromoldes completos transferidos, em vez da contagem individual dos esferoides, garantindo uma estimativa prática e reprodutível da densidade dos esferoides dentro do poro.
5. Após depositar os esferoides no poro de suporte GelMA, espere de 20 a 40 minutos para permitir que os esferoides se assentem. Adicione 1 mL de meio 3D em cada poço.
6. Após 24 horas, adicione 1 mL de meio 3D em cada poço.
7. Monitorar a fusão de esferoides nos poros dos andaimes GelMA por microscopia de contraste de fase e estereomicroscopia. Adquira as imagens a cada 24 horas, do dia 0 (imediatamente após a semeadura) ao dia 3 (72 horas).
8. Fixe a construção biológica em paraformaldeído a 4% após 72 horas para visualização por microscopia confocal. Manuseie o paraformaldeído em uma coifa química certificada usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, luvas e proteção ocular) devido às suas propriedades tóxicas e irritantes, e descarte resíduos conforme as diretrizes institucionais de segurança química. Para observação confocal, as células devem ser pré-marcadas na monocamada com um corante fluorescente antes da formação dos esferoides.
   NOTA: Se for necessário remover o construto do poro GelMA para análise ou aplicação in vivo , retire-o cuidadosamente usando pinças de precisão ou um punção de biópsia de tamanho adequado.

Resultados

Células-tronco humanas derivadas do adiposo (hASCs) cultivadas em uma monocamada (Figura 2C) foram induzidas com sucesso a formar esferoides em 24 horas após a semeadura em micromoldes de agarose (Figura 2D). Os esferoides resultantes apresentavam uma morfologia compacta e bem definida. A análise morfométrica revelou um diâmetro médio de 239,8 μm ± 87,0 μm em 24 horas (Figura 2E) e um valor de esfer...

Discussão

Os resultados apresentados neste estudo destacam a integração bem-sucedida de métricas de controle de qualidade em um fluxo padronizado de biofabricação para garantir a reprodutibilidade. O uso de andaimes impressos em 3D baseados em projetos pré-estabelecidos fornece suporte estrutural para a biomontagem^{esferoide 19,23}. Como prova de conceito, um andaime sólido foi projetado com duas regiões centrais porosas, dimensionadas para ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Prepared in the laboratory		-
593iCAN 3D Bioprinter, Model 593 iCan2X Printhead	593iCAN	-	-
Agarose	Sigma-Aldrich	16500-500	-
Ácido Ascórbico	Sigma-Aldrich	A4544-100MG	-
Carl Zeiss Microscopy GmbH Primovert	Zeiss	-	415510-1101-000
Celldiscover	Zeiss	-	LSM 900 com Airyscan 2
Celltracker	Invitrogen	C7025	-
Centrífuga	Eppendorf	-	5702
Gabinete de Segurança Biológica Classe II	Streamline	-	Modelo SC2-4E3
incubadora CO2 para cultura celular	Thermo Fisher Scientific	-	Série 8000 WJ
bico polipropileno cônico 0,41 mm	593iCAN	-	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose	Sigma-Aldrich	D2902-10L	-
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	-
Soro Bovinote Fetal (FBS)	Gibco	12657-029	-
Gel de gelatina metacriloil com força 300 g Bloom, grau de substituição 60%	Sigma-Aldrich	900622	Número do lote/batch: MKCS2673. A documentação para cada lote, incluindo a Ficha de Dados de Segurança (SDS) e o Certificado de Análise (CoA), pode ser obtida no site do fabricante’s.
Software GraphPad Prism 6.0	GraphPad Inc	-	-
Agitador magnético de placa quente	IKA	Z671797	Modelo C-MAG HS7
Albumina sérica humana 100 mg/ml	FUJIFILM Irvine Scientific	9988	-
suplemento ITS (Insulina-transferrina-selenite de sódio) 100x	Sigma-Aldrich	I3146-5ML	-
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma-Aldrich	900889
Microscópio estereoscópico Luxoeo 4Z	Labomed	-	-
MicroTissues® 3D Petri Dish® molde micro para esferoides	Sigma-Aldrich	Z764019	-
Penicilina-estreptomicina 100x	Sigma-Aldrich	15140122	-
Poietics™ células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (ADSC)	Lonza	PT-5006
Cloreto de Sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	71382-500G	-
Tripsina/EDTA	Gibco	27250018	-