Um Protocolo para Colheita de Suspensão de Célula Única de Córneas de Camundongos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para obter suspensões unicelulares de alta qualidade de córneas inteiras de camundongo por meio da digestão sequencial com colagênase A e tripsina. Esse método gera células únicas viáveis com alta integridade de RNA, tornando-as compatíveis com aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA de célula única e citometradorde fluxo y.

Resumo

Como a camada mais externa do globo ocular, a córnea desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase e visão da superfície ocular. Avanços recentes no sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) permitiram uma análise de alta resolução da heterogeneidade celular da córnea, mas a preparação de suspensões unicelulares de alta qualidade a partir do tecido corneano continua desafiadora devido à sua estrutura densa e complexa. Neste estudo, estabelecemos um protocolo robusto para gerar suspensões de célula única a partir de córneas inteiras de camundongo. O procedimento envolve triturar as córneas em fragmentos finos, seguido de digestão enzimática sequencial usando colagênase A e tripsina. A suspensão celular resultante foi avaliada quanto à qualidade por meio de múltiplas métricas: a coloração com azul de tripano foi usada para avaliar a viabilidade e a contagem celular; a coloração por imunofluorescência para Pancitoqueratina e Ceratocana permitiu a identificação e quantificação dos principais tipos celulares da córnea; e a integridade do RNA foi verificada usando um bioanalisador. Esse protocolo consistentemente gera preparações de célula única com alto número de células, excelente viabilidade (≥ 94,6%) e alta proporção de células individuais (96,3%), atendendo aos requisitos compatíveis com aplicações exigentes a jusante, incluindo scRNA-seq.

Introdução

A córnea, situada na camada mais externa do globo ocular, é essencial para suas funções de barreira e refração, devido a uma arquitetura altamente organizada composta por cinco camadas distintas: o epitélio, a camada de Bowman, o estroma, a membrana de Descemet e o^{endotélio 1}. O epitélio corneano é uma estrutura escamosa estratificada não queratinizada que fornece uma barreira física contra patógenos externos e apresenta robustas capacidades antimicrobianas e regenerativas. O estroma, composto por fibrilas de colágeno precisamente alinhadas, mantém transparência corneal e um índice de refração^{uniforme 2}. O endotélio, uma camada monocelular, regula a transferência de fluido entre o estroma e o humor aquoso, preservando assim a hidratação da córnea e o fornecimento de^{nutrientes 3}. No entanto, essa complexidade estrutural e celular complexa historicamente representou desafios significativos para a investigação das funções biológicas corneanas e dos mecanismos^{subjacentes 4}.

Para estudar interações intercelulares e identificar marcadores específicos do tipo celular, técnicas como a classificação por citometria^{de fluxo 5} e o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq⁾⁶ são amplamente empregadas. Um grande obstáculo técnico comum a ambas as abordagens, no entanto, é a preparação de suspensões de célula única de alta qualidade. Parâmetros incluindo rendimento total da célula, proporção de células individuais e viabilidade celular são críticos para a confiabilidade das aplicações a jusante voltadas para caracterizar a função das células corneanas e a expressão dos marcadores^{de superfície 7}. Apesar de sua importância, ainda falta protocolos padronizados e eficientes para gerar suspensões de célula única a partir de córneas inteiras de camundongo.

Vários métodos foram estabelecidos para obter suspensões de células únicas a partir do tecido corneano. A digestão enzimática sequencial usando colagênase A, tripsina ou Tripsina tem sido empregada para isolar células individuais tanto de córneas humanas quanto de^{murinos 8}. A tripsinização repetida também tem sido utilizada para dissociação corneana⁷. Além disso, kits comerciais de dissociação multitecido, como os da Miltenyi Biotec, foram aplicados com sucesso para gerar suspensões de células unicelulares^corneanas. Em nosso estudo comparativo anterior de diferentes métodos de digestão corneana, demonstramos que o tratamento sequencial com colagênase e tripsina constitui a abordagem ideal. Esse método proporciona consistentemente altos números celulares, excelente viabilidade (≥94,6%), alta porcentagem de células individuais (96,3%) e integridade do RNA^{bem preservada 10}.

Neste protocolo, fornecemos um procedimento detalhado e passo a passo para gerar suspensões de célula única de alta qualidade a partir de córneas inteiras de camundongo, utilizando essa estratégia otimizada de digestão enzimática, baseada em nossa experiência estabelecida e achados anteriores.

Protocolo

Fêmeas C57BL/6 (B6), de 6 a 8 semanas de idade, foram fornecidas pelo Centro Experimental de Animais da Universidade Médica de Guizhou. Os animais foram alojados em um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão, com acesso ad libitum a comida e água. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Experimental de Animais da Universidade Médica de Guizhou (Aprovação nº 2305185) e realizados em conformidade com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual.

1. Preparação

1. Preparação de instrumentos cirúrgicos: Limpe dois pares de tesouras oftálmicas, dois pares de pinças oftálmicas, um par de pinças de tecido e um tubo centrífugo de 2 mL, enxaguando duas vezes com água dupla destilada (DDW). Esterilize os instrumentos e o tubo usando um autoclave a vapor. Seque todos os itens durante a noite em um forno convencional a 65 °C.
2. Preparação da solução
   1. Meio Epitelial Hormonal Suplementar (SHEM): Prepare o SHEM suplementando o meio DMEM/F12 com os seguintes componentes: 5% (v/v) soro fetal bovino (FBS), 0,5% (v/v) dimetil sulfóxido (DMSO), 10 ng/mL fator de crescimento epidérmico de camundongo, 5,5 μg/mL transferrina, 0,5 μg/mL hidrocortisona, 1% (v/v) penicilina-estreptomicina (100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina).
      NOTA: O SHEM é usado para manter a viabilidade da célula durante o processamento. Pode ser substituído por meios alternativos, como DMEM basal ou soro salino tamponado com fosfato (PBS), contendo pelo menos 10% (v/v) de FBS.
   2. Solução salina tamponada com fosfato (PBS)
      1. Dissolver 22,4 g de pó de PBS em 2 L de água duplamente destilada (DDW) sob agitação usando um agitador magnético para obter 1× PBS.
      2. Autoclave a solução PBS com um dia de antecedência e deixe esfriar.
      3. Em condições estéreis, transfira 47,5 mL de PBS estéril de 1× para um tubo centrífugo de 50 mL e adicione 2,5 mL de penicilina-estreptomicina a 1% (v/v).
         NOTA: A formulação 1× PBS (2 L) contém 137 mM de NaCl, 8 mM_{Na 2HPO 4} e 2 mM_{NaH 2}PO₄, pH 7,2.
   3. Soluções para colanase A
      1. Solução padrão: Dissolva 1 g de colagênase A em pó em 40 mL de DDW. Esterilize o filtro através de um filtro de 0,2 μm e armazene a -20 °C.
      2. Solução de trabalho: Diluir 1 mL de solução de colagenase A em 4 mL de DDW estéril para obter uma concentração final de 5 mg/mL.
   4. Solução de tripsina: Descongelar a solução comercialmente disponível de tripsina/EDTA de 0,25% (p/v) (contendo 0,91 mM de EDTA) em gelo antes do uso.
   5. Solução de Trippan Blue (0,4%): Dissolva 0,4 g de Trypan Blue em 100 mL de DDW. Filtre usando papel de filtro e armazene a 4 °C.
      NOTA: A solução de Trippan Blue de 0,4% é usada para avaliar a contagem total de células, proporção de células individuais e viabilidade. Pode ser substituído por kits comerciais de coloração viva/morta ou sistemas automatizados de contagem de células.

2. Preparação das córneas de camundongos

1. Esterilize o microscópio de dissecação e a área de trabalho limpando com etanol a 75%, depois exponha a área à luz UV dentro de um armário de segurança biológica por 30 minutos.
2. Prepare o seguinte em condições estéreis: uma placa de Petri de 60 mm com 5 mL de meio STEM, três placas de Petri de 60 mm contendo 5 mL de 1× PBS suplementado com 5% de penicilina-estreptomicina (P-S), três placas de Petri de 60 mm cada com 5 mL de PBS simples de 1× e um tubo centrífugo estéril de 2 mL
3. Eutanasie o camundongo usando asfixia por CO₂ , seguida de luxação cervical.
4. Enxágue bem a cabeça do camundongo e as pálpebras fechadas por imersão três vezes em PBS contendo 5% de P-S antes de prosseguir com a enucleação.
5. Usando tesouras oftálmicas, faça uma incisão ao longo do polo posterior de cada globo ocular e coloque cuidadosamente os olhos isolados na placa de Petri contendo o meio SHEM gelado (Figura 1A).
   NOTA: Para maximizar a viabilidade celular, todas as soluções devem ser pré-resfriadas a 4 °C e todas as etapas de dissecação devem ser realizadas no gelo.
6. Transfira imediatamente a placa de Petri com olhos para um armário de segurança biológica. Lave os globos oculares três vezes em 1× PBS contendo 5% de P-S, incubando por 5 minutos por lavagem.
7. Sob um microscópio dissecante, separe cuidadosamente o tecido corneano: Usando tesouras oftálmicas e pinças, faça uma incisão do polo posterior em direção ao limbo corneano. Desprenda suavemente a córnea da esclera e conjuntiva ao longo da borda limbar. Remova completamente o cristalino e a íris usando dois pares de pinças (Figura 1B).
8. Utilizando pinças oftálmicas, transfira o tecido corneano para uma placa de Petri contendo 1× PBS e lave três vezes (5 min cada) para remover qualquer tecido não corneano residual e antibióticos.
   NOTA: A íris frequentemente adere firmemente à córnea. Certifique-se de que seja removido suavemente e completamente usando pinças para evitar contaminação, deixando apenas tecido corneano transparente.
9. Usando pinças oftálmicas, transfira o tecido corneano limpo para um tubo centrífugo de 2 mL e adicione 1 mL de solução ativa de colagênase A (5 mg/mL).
10. Usando tesouras oftálmicas, triture o tecido corneano em fragmentos de aproximadamente 0,5 mm × 0,5 mm diretamente dentro do tubo.
11. Incube o tubo contendo os fragmentos corneanos e a solução de colagênase A em uma incubadora de cultura celular a 37 °C por 1 hora (Figura 2A-C).
12. Durante a digestão da colagenase A, monitore o tecido a cada 10 minutos. Interrompa a digestão quando não restam grandes fragmentos de tecido, procedendo à centrifugação. Centrifuge a amostra a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente usando uma centrífuga. Aspire cuidadosamente o sobrenadante.
13. Resuspenda o pellet em 200 μL de solução de 0,25% de tripsina/EDTA.
14. Incube o tubo em uma incubadora de cultura celular a 37 °C por 10 minutos para digerir os fragmentos de tecido restantes.

3. Isolamento de células únicas corneanais

1. Triture suavemente a mistura (tecido e solução de tripsina/EDTA) repetidamente usando uma pipeta P1000 com ponta de grande diâmetro para dissociar o tecido em uma suspensão unicelular.
2. Centrifuge a suspensão da célula a 300 x g por 5 minutos e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de PBS contendo 0,04% de albumina sérica bovina (BSA) para obter uma suspensão unicelular.
   NOTA: Para células destinadas a sequenciamento ou citometria de fluxo, ressuspendam em PBS sem soro. Para células que serão cultivadas, use 1x PBS suplementado com 0,04% de BSA.
3. Filtre a suspensão da célula através de um filtro de célula pré-umido de 40 μm para um novo tubo centrífugo de 50 mL para remover aglomerados e detritos celulares.
   NOTA: Pré-umeda o penador celular com PBS para minimizar a perda celular. Se necessário, as células filtradas podem ser centrifugadas novamente e ressuspensas no volume desejado para concentração.

4. Contagem de células

1. Combine 9 μL da suspensão da célula com 1 μL de solução de Trippan Blue 0,4% e misture suavemente.
2. Coloque lentamente a mistura em uma câmara de hemocitômetro pelo canal de carga designado. Conte as células usando o método dos quatro quadrantes para determinar o número total de células, a viabilidade e a proporção de células individuais. Realize pelo menos duas réplicas técnicas.

Resultados

A qualidade das suspensões de célula única foi avaliada com base no rendimento total da célula, na proporção de células individuais e na viabilidade da célula. A suspensão foi corada com Trippan Blue e analisada usando microscopia de contraste de fase em múltiplos campos (Figura 3). A partir de quatro olhos de camundongo (oito córneas), foi obtido um total de 1,05 × 10^{células de 5} , com uma viabilidade celular média de 94,6% e uma razão de célula ...

Discussão

A introdução do sequenciamento de RNA unicelular aumentou significativamente o uso de tecnologias genômicas, transcriptômicas, epigenéticas e proteômicas na pesquisa^{ocular 9,10,11,12}. Consequentemente, a preparação de suspensões de alta qualidade de células únicas tornou-se cada vez mais crítica, pois permite a detecção de variações de sinalização entre células...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa Fluor 594 anti-coelho burro	Abcam	ab150064
Antiqueratina	Abcam	ab230175
Anti-pancitoqueratina	Thermo Fisher Scientific	AE1/AE3, Alexa FluorTM 488
Esterilizador de autoclave	An Shen	LDZH-100KBS
Albumina Sérica Bovina V	Solarbio	A8020
Filtro celular	NEST	258369	40 & mu; m
Máquina centrífuga	Eppendorf AG	22331 Hamburgo
Colagênase A	Roche	10103578001
Microscópio confocal	Oberkochen	Zeiss LSM 880
Placa de contagem	MARIENFELD	M407859
Tubo centrífugo	NEST	620611	2 mL, 50 mL
Cobertura	MARIENFELD	M407859
DAPI	Solarbio	C0065
Microscópio dissecador	Carl ZEISS	VISU150
DMEM/F12  Mídia	Gibco	11320033
DMSO	Solarbio	D8371
Fetal  bovino  Soro	Gibco	16140071
Hidrocortisona	Solarbio	IH0100
IS	Gibco	23337619
Fator de crescimento epidérmico do camundongo	Invitrogen	PMG8041
cirurgia oftálmica  Pinças	Dumot	0208-5-PO
Tesoura cirúrgica oftálmica	FST	15021-15
Forno	AISITE	DH6000 II
Penicilina & Estreptomicina	Gibco	15070063	100mL
Placa de Petri	NEST	705201	60mm
Soro salino tamponado com fosfato	Solarbio	P1010
Incubadora termostática	Thermo Fisher Scientific	3111
Triton-X 100	Solarbio	T8200
Trippan Blue	Solarbio	T8070
Tripsina/EDTA	Gibco	R001100
Mesa ultra-limpadora	You Qi	VS-840-2
4% de paraformaldeído	Solarbio	P1110