Microscopia de Localização de Molécula Única de Proteínas de Membrana usando Marcagem de Único Anticorpo

Summary

Este protocolo descreve a marcação de anticorpo único (SAL) para resolver a organização espacial em nanoescala das proteínas da membrana plasmática. Ao aproveitar as interações cumulativas anticorpo-epítopo no nível de molécula única, o SAL de membrana (mSAL) mapeia distribuições locais de epítopos enquanto captura simultaneamente o comportamento de ligação de anticorpos no ambiente celular nativo.

Abstract

A membrana plasmática define a forma celular e serve como a interface que governa a comunicação intercelular. As proteínas de membrana constituem uma classe importante de alvos terapêuticos; Portanto, a super-resolução da membrana celular por meio de suas proteínas constitutivas tem grande potencial para o avanço da biologia celular e da terapêutica de anticorpos. Nesse sentido, a microscopia de localização de molécula única (SMLM) permite a visualização em nanoescala das organizações proteicas em estruturas biológicas. Apesar de sua importância, aplicar SMLM às proteínas da membrana plasmática apresenta desafios únicos. Neste protocolo, apresentamos uma abordagem eficaz usando marcação de anticorpo único em time-lapse (SAL) chamada SAL de membrana (mSAL). Fornecemos instruções detalhadas passo a passo, incluindo otimização da concentração de anticorpos, densidade de potência do laser, duração dos intervalos sem iluminação, reconstrução de imagens e análise de clusters baseada em densidade, para resolver a distribuição de proteínas de membrana em nanoescala e a morfologia da membrana. Usamos a proteína tetraspanina CD81 como proteína modelo de membrana para demonstrar a capacidade do mSAL tanto em células aderentes quanto em células de mamíferos em suspensão. Além de super-resolver a membrana celular e as distribuições das proteínas membranares, nossa técnica possibilita a investigação da farmacodinâmica de anticorpos terapêuticos que interagem com seus alvos membranares no ambiente de membrana nativa.

Introduction

A membrana plasmática contém uma diversidade de proteínas que regulam a mobilidade celular, a adesão, a detecção e a comunicação intercelular. Compreender a distribuição em nanoescala das proteínas da membrana plasmática é importante, pois a função das proteínas muitas vezes é governada não apenas pelos níveis de expressão, mas também por sua organização espacial na^{membrana 1,2}. Notavelmente, muitos anticorpos terapêuticos têm como alvo as proteínas de^{membrana 3,4}, tornando as investigações em escala nanométrica essenc....

Protocol

Este protocolo utiliza as linhas celulares Jurkat E6.1 e U2OS estabelecidas e não envolve materiais humanos ou animais vivos primários.

1. Semeadura/pouso celular e fixação

NOTA: A preparação da amostra segue protocolos padrão de coloração por imunofluorescência (IF), otimizados para preservar a organização subcelular das proteínas da membrana plasmática entre diferentes tipos celulares. Se existir um protocolo de imunocoloração estabelecido para o alvo de interesse, os usuários podem seguir esse protocolo até a etapa 1.2.14 de bloqueio de amostra. A marcação de anticorpo único (SA....

Results

A técnica mSAL descrita neste protocolo permite a visualização de eventos únicos de ligação de anticorpos aos respectivos alvos proteicos de membrana plasmática, produzindo um mapa de super-resolução da distribuição das proteínas de membrana. CD81 é usado aqui como um exemplo representativo, embora a abordagem seja facilmente adaptável a outras proteínas de membrana.

Imobilizar células T de Jurkat com espaçamento suficiente entre as células garante acesso ao e.......

Discussion

A organização das proteínas da membrana plasmática desempenha um papel vital na regulação da função celular. As técnicas convencionais de microscopia de fluorescência são limitadas pelo limite de difração da luz, mascarando sua organização em escala nanométrica. O SMLM supera essa limitação ao alcançar resoluções espaciais de 10-20^{nm 47}, permitindo a caracterização de seus conjuntos em nanoescala 10,48,49........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpo anti-CD81 Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	MA5-44132	Anticorpo de imagem
Centrífuga de bancada	Eppendorf	5424
Albumina sérica bovina	MilliporeSigma	A7906-100G
Vidro com tampa com câmara, 8 poços	Cellvis	C8-1-N
Mídia DMEM	Thermo Fisher Scientific	11960069
Soro Tamponado de Fosfato da Dulbecco	Thermo Fisher Scientific	14190-144
Soro fetal bovino	MilliporeSigma	F0926-500ML
Glutaraldeído, 10 %	Ciências da Microscopia Eletrônica	16120
Coloides de ouro, 100 nm	Ted Pella	15711 e menos; 20	Marcador fiducial
Óleo de imersão	Laboratórios Cargille	16245
Microscópio invertido  equipado com módulo TIRF	Instrumentos Nikon	Eclipse Ti2-E	Microscópio
Linha celular Jurkat E6.1	MilliporeSigma	88042803-1VL	Células de suspensão
Lançamento a laser, 6 linhas	Oxxius	L6CC-CS8-1511	Laser de excitação
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	Reagente de transfecção
Tubo de microcentrífuga, 1,5 mL	VWR	89000-028
Software de imagem por microscopia	Instrumentos Nikon	Pesquisa Avançada NIS-Elementos	Software de avaliação de imagens
Objectivo, 100x/1.49 CFI APO TIRF & nbsp;	Instrumentos Nikon	MRD01991	Objetivo do microscópio
Paraformaldeído, 16 %	Ciências da Microscopia Eletrônica	15710
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140-122	Antibióticos
Solução de poli-L-lisina, 0,01%	MilliporeSigma	P4707-50ML
Câmera Prime 95B sCMOS	Soluções Teledyne Vision	01-PRIME-95B-R-M-16-C	Câmera
Mídia RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093	Mídia para células de suspensão
Azida de sódio	Thermo Fisher Scientific	19038-1000
Borohidreto de sódio	MilliporeSigma	213462-25G
Frascos de cultura T25	Thermo Fisher Scientific	169900
Microsferas TetraSpeck			Marcador fiducial
Placa de cultura de tecidos, 100 mm & nbsp;	Corning	353003
Linha celular U2OS	ATCC	HTB-96	Células aderentes