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Artigo de método

Microscopia de Localização de Molécula Única de Proteínas de Membrana usando Marcagem de Único Anticorpo

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DOI:

10.3791/69853

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20 de março de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a marcação de anticorpo único (SAL) para resolver a organização espacial em nanoescala das proteínas da membrana plasmática. Ao aproveitar as interações cumulativas anticorpo-epítopo no nível de molécula única, o SAL de membrana (mSAL) mapeia distribuições locais de epítopos enquanto captura simultaneamente o comportamento de ligação de anticorpos no ambiente celular nativo.

Resumo

A membrana plasmática define a forma celular e serve como a interface que governa a comunicação intercelular. As proteínas de membrana constituem uma classe importante de alvos terapêuticos; Portanto, a super-resolução da membrana celular por meio de suas proteínas constitutivas tem grande potencial para o avanço da biologia celular e da terapêutica de anticorpos. Nesse sentido, a microscopia de localização de molécula única (SMLM) permite a visualização em nanoescala das organizações proteicas em estruturas biológicas. Apesar de sua importância, aplicar SMLM às proteínas da membrana plasmática apresenta desafios únicos. Neste protocolo, apresentamos uma abordagem eficaz usando marcação de anticorpo único em time-lapse (SAL) chamada SAL de membrana (mSAL). Fornecemos instruções detalhadas passo a passo, incluindo otimização da concentração de anticorpos, densidade de potência do laser, duração dos intervalos sem iluminação, reconstrução de imagens e análise de clusters baseada em densidade, para resolver a distribuição de proteínas de membrana em nanoescala e a morfologia da membrana. Usamos a proteína tetraspanina CD81 como proteína modelo de membrana para demonstrar a capacidade do mSAL tanto em células aderentes quanto em células de mamíferos em suspensão. Além de super-resolver a membrana celular e as distribuições das proteínas membranares, nossa técnica possibilita a investigação da farmacodinâmica de anticorpos terapêuticos que interagem com seus alvos membranares no ambiente de membrana nativa.

Introdução

A membrana plasmática contém uma diversidade de proteínas que regulam a mobilidade celular, a adesão, a detecção e a comunicação intercelular. Compreender a distribuição em nanoescala das proteínas da membrana plasmática é importante, pois a função das proteínas muitas vezes é governada não apenas pelos níveis de expressão, mas também por sua organização espacial namembrana 1,2. Notavelmente, muitos anticorpos terapêuticos têm como alvo as proteínas demembrana 3,4, tornando as investigações em escala nanométrica essenciais para entender como as interações dos anticorpos são influenciadas pela organização local das proteínas de membrana. No entanto, o mapeamento preciso da distribuição das proteínas membranas, o perfilamento de abundância por molécula única e o monitoramento em tempo real de suas interações dinâmicas com parceiros de ligação continuam sendo desafiadores.

Técnicas amplamente utilizadas de microscopia de localização de molécula única (SMLM), como a microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM)5,6 e o acúmulo de pontos baseado em DNA para imagem em topografia nanométrica (DNA-PAINT)7, utilizam coloração por imunofluorescência (IF) para marcação de amostras. Eles alcançam resoluções laterais de ~ 10 nm e forneceram extensos insights sobre a organização em nanoescala de alvos de membrana terapêutica, incluindo receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2)8,9, CD2010, receptores de célulasT 11,12,13, ligando de morte programado 1,14, receptores de células B 15,16,17 e CD19 17,18. Por exemplo, estudos dSTORM usando o anticorpo monoclonal terapêutico Trastuzumabe para detectar diretamente HER2, um receptor-chave implicado no câncer de mama, revelaram estados distintos de agrupamento entre pacientesHER2-positivos 8, enquanto diferentes anticorpos terapêuticos demonstraram modular o agrupamentoHER2 9. DNA-PAINT combinado com microscopia de folha de luz em rede elucidou os estados oligoméricos e os perfis de interação do CD20 em células B com anticorpos monoclonais terapêuticos rituximabe, ofatumumabe eobinutuzumabe 10. Embora o SMLM convencional forneça insights valiosos sobre organização em escala nanométrica, seu potencial total é limitado pelas abordagens tradicionais de coloração com FI. A qualidade da imagem SMLM depende da coloração FI, que por sua vez é regida pela especificidade e afinidade do anticorpo de marcação. O SMLM tradicional utiliza anticorpos de alta afinidade que normalmente alcançam uma coloração de FI e qualidade de imagem superiores. No entanto, a maioria dos anticorpos terapêuticos interage com receptores de membrana de células vivas com afinidade moderada para minimizar os efeitos colaterais fora doalvo 19. Por exemplo, engajadores de células T biespecíficas (TCEs) apresentam menor afinidade por CD3, o que impede a internalização deTCR 20,21,22. Tais interações não podem ser capturadas com precisão pelas técnicas convencionais de FI.

Já desenvolvemos uma estratégia que utiliza diretamente interações anticorpo-epítopo de molécula única, chamada de marcação de anticorpo único (SAL). O SAL permite o mapeamento de alta densidade das interações anticorpo-epítopo enquanto preserva os equilíbrios nativosde ligação 23. Embora já tenhamos relatado anteriormente um protocolo para proteínas intracelulares do citoesqueleto e mitocôndrias24, a SAL em proteínas de membrana não foi demonstrada. Neste protocolo, fornecemos um fluxo de trabalho passo a passo para aplicar SAL a proteínas de membrana, demonstrado por meio da marcação da tetraspanina CD81, um candidato-alvo terapêuticorelatado 25,26,27,28, tanto em células em suspensão quanto em células aderentes. Utilizando anticorpos anti-CD81 marcados fluorescentemente para sondar diretamente a distribuição espacial do CD81 em células T U2OS e Jurkat, demonstramos a aplicação de estudos em escala nanométrica SAL de proteínas de membrana. Denominamos essa estratégia de SAL de membrana (mSAL). Por fim, descrevemos uma estratégia baseada em agrupamento para reduzir as detecções isoladas de molécula única fora da célula.

Em essência, o SAL utiliza marcação de molécula única em time-lapse para capturar interações individuais anticorpo-epítopo, e a subsequente deconvolução de emissor único produz uma imagem de superresolução baseada no SMLM. Ao ajustar a concentração de anticorpos e selecionar um intervalo não iluminador (NII) apropriado entre quadros de imagem consecutivos, o SAL ajusta a taxa de ligação do anticorpo à taxa de detecção de molécula única, permitindo a localização de molécula única. O SAL requer NIIs mais longos devido à cinética de ligação inerentemente lenta dos anticorpos, que prolongam a duração da aquisição da imagem (~3-17 h). O SAL é mais adequado para aplicações que exigem mapeamento preciso em nanoescala de epítopos e a avaliação da dinâmica de interação individual entre anticorpos e epítopos. Apesar de seu menor rendimento, o SAL oferece uma visão única sobre a organização dos epítopos e o engajamento de anticorpos sob condições quase fisiológicas, tornando-o particularmente valioso para caracterizar anticorpos terapêuticos in situ.

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Protocolo

Este protocolo utiliza as linhas celulares Jurkat E6.1 e U2OS estabelecidas e não envolve materiais humanos ou animais vivos primários.

1. Semeadura/pouso celular e fixação

NOTA: A preparação da amostra segue protocolos padrão de coloração por imunofluorescência (IF), otimizados para preservar a organização subcelular das proteínas da membrana plasmática entre diferentes tipos celulares. Se existir um protocolo de imunocoloração estabelecido para o alvo de interesse, os usuários podem seguir esse protocolo até a etapa 1.2.14 de bloqueio de amostra. A marcação de anticorpo único (SAL) depende da detecção cumulativa de anticorpos marcados fluorescentemente enquanto eles se ligam ao seu antígeno no nível de molécula única. Anticorpos marcados fluorescentemente diluídos em um tampão de imagem são adicionados às amostras no palco do microscópio, e a marcação fluorescente ocorre dinamicamente à medida que a aquisição da imagem avança. Nenhuma marcação fluorescente é realizada durante a fase de preparação da amostra.

  1. Prepare células aderentes, como a linha celular U2OS, conforme descrito em um protocolo24 publicado anteriormente.
  2. Suspensões celulares
    1. Manter células T de Jurkat em densidade de 1 x 105 a 1 x10 6 células/mL em 10 mL de meio RPMI completo (RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% (v/v), 100 U/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina) a 37 °C em uma incubadora umidificada suplementada com 5% de CO2.
      NOTA: Os 10 mL recomendados de meio completo se aplicam a frascos T25; Os usuários devem ajustar o volume de acordo com diferentes recipientes de cultura.
    2. Prepare a superfície do vidro adicionando 200 μL de solução de poli-L-lisina (PLL) 0,01% aos poços destinados a uso em vidro de cobertura com 8 poços. Incube durante a noite a 4 °C ou por 2 horas a 37 °C.
    3. Conte as células da cultura usando um hemocitômetro e depois transfira 3,5 x 104 células para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
      NOTA: A contagem de células pode precisar ser ajustada para obter uma boa distribuição de células individuais. Uma faixa de semeadura de 30.000-60.000 células T Jurkat alcança uma densidade ideal onde células individuais estão claramente separadas umas das outras sem estarem muito dispersas. A contagem de células pode precisar ser ajustada para um novo tipo celular.
    4. Centrifuge a 300 x g por 3 minutos para obter um pellet de células. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 200 μL de 1x Soro Tamponado com Fosfato de Dulbecco (DPBS) pré-aquecido (37 °C). A célula resultante será visível como um pequeno depósito branco no fundo do tubo da microcentrífuga.
      NOTA: Descarte resíduos bio-perigosos conforme as diretrizes da instituição e todas as regulamentações locais, estaduais e federais aplicáveis.
    5. Aspire a solução de PLL do vidro preparado com câmara (passo 1.2.2). Se a incubação com PLL ocorrer durante a noite a 4 °C, pré-aqueça o vidro de cobertura com 8 poços a 37 °C antes de aspirar a solução.
    6. Adicione a suspensão da célula a partir da etapa 1.2.4. sobre o poço da câmara revestido com PLL. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C suplementada com 5% de CO2 por 30 minutos para permitir que as células se fixem na superfície. Misture bem a suspensão da célula antes de colocar o revestimento e pipete para cima e para baixo para quebrar os aglomerados celulares e garantir uma distribuição uniforme pelo poço.
    7. Verifique a fixação da célula na superfície do vidro usando um microscópio óptico. Com ampliação de 10x, foque o microscópio na parte inferior do vidro da tampa do aparelho.
      NOTA: Batidas suavemente no vidro da cobertura com câmara enquanto observam ao microscópio pode ajudar a avaliar se as células se fixaram à superfície ou ainda estão flutuando.
    8. Prepare 200 μL do tampão de fixação (4% de paraformaldeído e 0,1% de glutaraldeído no DPBS) e pré-aqueça a 37 °C em banho-maria.
      NOTA: O tampão de fixação fornecido é otimizado para CD81 e geralmente adequado para preservar proteínas de membrana. Para novos alvos proteicos de membrana, a composição do tampão pode precisar ser ajustada para alcançar a preservação ideal. Os usuários são incentivados a consultar a literatura para condições de fixação adaptadas a novos alvos.
      ATENÇÃO: O paraformaldeído é tóxico e cancerígeno. Glutaraldeído é tóxico e corrosivo. Use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados ao manusear esse reagente. Em caso de contato com a pele, lave imediatamente a área afetada cuidadosamente com sabão e água. Descarte o reagente de acordo com as diretrizes da instituição do usuário e todas as regulamentações locais, estaduais e federais aplicáveis.
    9. Aspire o DPBS de cada poço de amostra (do passo 1.2.6) usando uma micropipeta.
      NOTA: É fundamental realizar todas as etapas de troca de solução lentamente para evitar o deslocamento das células do vidro de cobertura. Descarte os resíduos bio-perigosos conforme as diretrizes da instituição do usuário e todas as regulamentações locais, estaduais e federais aplicáveis.
    10. Adicione 200 μL de tampão de fixação pré-aquecido a 37 °C em um canto do poço e incube em temperatura ambiente por 15 minutos.
      ATENÇÃO: O paraformaldeído é tóxico e cancerígeno. Glutaraldeído é tóxico e corrosivo. Use EPI adequado ao manusear esses reagentes. Em caso de contato com a pele, lave imediatamente a área afetada cuidadosamente com sabão e água. Descarte o reagente de acordo com as diretrizes da instituição do usuário e todas as regulamentações locais, estaduais e federais aplicáveis.
    11. Lave as células fixas 3x com 500 μL de DPBS. Pule essa etapa se seguir com a etapa 1.2.12.
    12. Opcional: Remova lentamente a solução de fixação e adicione 200 μL de borohidreto de sódio 0,1% recém-preparado no DPBS, depois incube em temperatura ambiente por 7 minutos. Pule essa etapa e prossiga para a etapa 1.2.14 se não estiver usando redução de borohidreto de sódio.
      NOTA: A redução com borohidreto de sódio ajuda a extinguir a autofluorescência gerada pelo glutaraldeído e neutraliza aldeídos não reagidos. A liberação de gás hidrogênio como resultado da reação do borohidreto de sódio com a solução aquosa se manifestará como a liberação de bolhas. Se não for observada a liberação de gás hidrogênio, use uma solução recém-preparada de borohidreto de sódio.
      ATENÇÃO: Borohidreto de sódio é tóxico e corrosivo. Use EPI adequado ao manusear esse reagente. Em caso de contato com a pele, lave imediatamente a área afetada cuidadosamente com sabão e água. Descarte o reagente de acordo com as diretrizes da instituição do usuário e todas as regulamentações locais, estaduais e federais aplicáveis.
    13. Aspire a solução de borohidreto de sódio de cada poço e lave três vezes com 500 μL de DPBS.
    14. Prepare 200 μL do tampão de bloqueio e adicione-o ao poço. Incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Não use reagente de permeabilização (por exemplo, TritonX-100, saponina), pois pode remover proteínas de membrana. O protocolo de membrana SAL (mSAL) apresentado aqui para CD81 não incluía um passo de bloqueio.
      NOTA: Um tampão bloqueador contendo 5% (v) de albumina sérica bovina (BSA) em DPBS é recomendado para mSAL com novos alvos. Ao usar anticorpos secundários, o soro correspondente é usado para bloqueio. Por exemplo, soro de cabra 10% (v/v) em DPBS ao usar um anticorpo secundário cabra-hospedeiro. Se existirem uma receita de buffer de bloqueio estabelecida e um protocolo para o alvo, os usuários podem seguir esse protocolo. O tampão bloqueante pode opcionalmente ser suplementado com anticorpos de controle de isotipo ou anticorpos derivados do soro para reduzir ligações fora do alvodos anticorpos 23,24. Inclua um reagente de permeabilização no tampão bloqueador somente se o anticorpo atingir um epítopo intracelular da proteína de membrana.
    15. Para mSAL com anticorpos primários conjugados com corantes, prossiga diretamente para a etapa 1.2.20.
    16. Prepare 150 μL da solução primária de coloração de anticorpos (anticorpo na concentração desejada diluído no tampão bloqueante). Pule essa etapa para mSAL com anticorpos primários conjugados com corante.
      NOTA: Para a coloração primária de anticorpos, consulte a ficha técnica do fornecedor para as condições recomendadas. Se a informação de concentração não for fornecida, comece com 4 μg/mL (27 nM) para IgG de comprimentototal 23,24.
    17. Substitua o tampão bloqueador pela solução primária de anticorpos. Incube em temperatura ambiente por 2 horas ou a 4 °C durante a noite em uma câmara úmida. Pule essa etapa para mSAL com anticorpos primários conjugados com corante.
    18. Lave a amostra duas vezes com 400 μL de DPBS. Adicione 200 μL de buffer de bloqueio ao poço.
    19. Opcional: Substitua o tampão bloqueador por 200 μL de tampão pós-fixação (4% de paraformaldeído) e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.
      NOTA: A pós-fixação ajuda a preservar o bloqueio de amostras paraSAL 23,24. No entanto, essa etapa deve ser omitida se reduzir a acessibilidade do epítopo. Para avaliar o efeito da pós-fixação no reconhecimento de epítopos por anticorpos, realizar a coloração padrão por imunofluorescência com e sem pós-fixação, e comparar a qualidade da coloração.
    20. Opcional: lave a amostra duas vezes com DPBS.
    21. Adicione 200 μL de DPBS em cada poço e cubra a câmara com uma película transparente para evitar a evaporação. As amostras podem ser armazenadas a 4 °C por até 1 mês. Se estiver realizando mSAL imediatamente após o passo 1.2.14, ou 1.2.19 sem pós-fixação, mantenha a amostra no buffer de bloqueio e prossiga diretamente para o passo 2.2.
      NOTA: Manter a amostra em DPBS suplementada com 5 mM de azida de sódio evitará o crescimento bacteriano durante o armazenamento.
      ATENÇÃO: A azida de sódio é extremamente tóxica e pode ser fatal se ingerida. Use EPI adequado ao manusear esse reagente. Em caso de contato com a pele, lave imediatamente a área afetada cuidadosamente com sabão e água. Descarte o reagente de acordo com as diretrizes da instituição do usuário e todas as regulamentações locais, estaduais e federais aplicáveis.

2. Aquisição de imagens

NOTA: O procedimento de imagem tanto para células aderentes quanto para células em suspensão é semelhante e é realizado usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF). No entanto, as condições de imagem devem ser otimizadas para cada tipo celular.

  1. Deixe as amostras armazenadas (a 4 °C) atingirem a temperatura ambiente antes da imagem para evitar condensação no vidro. Pule essa etapa se for passar diretamente para a imagem após a preparação da amostra.
  2. Ligue o sistema do microscópio: microscópio, câmera sCMOS, unidade laser e o computador com o software de aquisição de imagem. Permita que o sistema do microscópio se estabilize por 5 a 10 minutos após ligar para permitir que os componentes do sistema atinjam a temperatura de operação e minimizem a deriva térmica.
    NOTA: o mSAL pode ser realizado usando qualquer configuração de microscópio TIRF e software compatível. Ligue o sistema conforme as instruções do instrumento.
  3. Aplique óleo de imersão em um objetivo TIRF (por exemplo, 100x/1,49) e monte o vidro com cobertura na câmara no palco do microscópio.
    NOTA: Se o objetivo estiver equipado com um colar corretor, certifique-se de que ele esteja ajustado na espessura correta do vidro de cobertura a 23 °C. O vidro de cobertura utilizado neste estudo tinha espessura de 0,13-0,17 mm.
  4. Se equipado, ative o Sistema de Foco Perfeito (PFS), depois eleve cuidadosamente o objetivo até o vidro da cobertura e coloque a amostra em foco.
  5. Prepare coloides de ouro como marcadores fiduciários (diluição 1:2 em água ultrapura). Sonice os coloides de ouro antes de diluir por 3 minutos para dispersar os agregados.
  6. Aspire suavemente o buffer de armazenamento (DPBS ou buffer bloqueante) do poço da amostra e adicione 200 μL da solução coloide de ouro à amostra. Incube por 1 minuto e retire a solução.
  7. Use iluminação em campo claro para verificar se coloides de ouro suficientes foram depositados antes de aspirar a solução. Uma densidade ideal consiste em 5 a 10 coloides de ouro dentro da região designada de interesse (ROI).
    NOTA: Alternativamente, microsferas fluorescentes (veja Tabela de Materiais) podem ser usadas com diluição de 1:1.000 em DPBS.
  8. Lave 1x com 500 μL de água ultrapura para remover o excesso de coloides de ouro, depois adicione 200 μL de DPBS.
  9. No software de imagem, crie a configuração óptica para o fluoróforo (da sonda de anticorpos), incluindo o dicroico apropriado, comprimento de onda de excitação do laser e densidade de potência, tempo de integração da câmera, filtro de emissão e binning de pixels da câmera (se aplicável). Recomenda-se um tamanho de pixel de 150-160 nm para alcançar a resolução ideal.
  10. Crie uma configuração óptica para uma etapa de fotobranqueamento. Recomenda-se uma potência de laser de 380 W/cm2 ou mais, com tempo de integração da câmera de 1 s.
    NOTA: O fotobranqueamento durante a aquisição ajuda a minimizar a sobreposição entre eventos individuais de ligação a anticorpos fluorescentes. A luz coletada pode ser direcionada através de um filtro de emissão com comprimento de onda não correspondente para evitar a saturação da câmera.
  11. Ajuste o ângulo do laser para estabelecer a iluminação do TIRF. Usando iluminação em campo claro, identifique uma célula para mSAL. Certifique-se de que pelo menos 5 coloides dourados sejam visíveis dentro do ROI para corrigir o desvio do estágio durante a reconstrução da imagem. Confirme autofluorescência dos coloides dourados na densidade de potência do laser de imagem.
  12. Defina os parâmetros de imagem: intervalo de não iluminação (NII), número de quadros e a frequência da etapa de fotobranqueamento (se necessário) no software de aquisição de imagem. Para mSAL do CD81 em células U2OS e Jurkat T com anticorpos CD81, as configurações ótimas foram um NII de 5 s, 2.000 quadros totais e um passo de fotobranqueamento a cada 5º quadro.
    NOTA: Esses parâmetros devem ser otimizados para cada proteína de interesse, o anticorpo usado para o mSAL e o tipo celular. Consulte o passo 3 para mais detalhes sobre otimização. O número ótimo de frames pode variar tanto entre o alvo do anticorpo quanto o tipo celular. Para novos sistemas de alvo, é recomendado capturar de 2.000 a 3.000 quadros como ponto de partida. Os NIIs estendem a duração da aquisição de imagens. Por exemplo, uma aquisição mSAL de 3.000 quadros com um NII de 20 s resulta em ~17 h de tempo de aquisição.
  13. Prepare o tampão de imagem diluindo o anticorpo CD81 a uma concentração de 1 μg/mL em 200 μL de 5% de BSA (p/v) em DPBS. Para o mSAL do CD81, a concentração final de anticorpos foi de 0,5 nM para células T de Jurkat e 2 nM para células U2OS.
    NOTA: A concentração de anticorpos depende da abundância local do substrato e da afinidade do anticorpo. É fundamental otimizar as concentrações de anticorpos para cada alvo proteico, cada anticorpo usado para imagem e cada tipo celular. Consulte o passo 3.1 para mais detalhes sobre otimização.
  14. Adicione o buffer de imagem preparado ao poço e inicie a aquisição.

3. Otimização de parâmetros de imagem

NOTA: os parâmetros de imagem do mSAL são influenciados pela expressão da proteína, sua organização local e pela escolha do anticorpo usado para imagem. O objetivo de otimizar os parâmetros de imagem é identificar a concentração de anticorpos e o NII que produzem eventos de molécula única espacialmente resolvidos, mantendo densidades suficientemente altas para maximizar a amostragem do epítopo.

  1. Concentração de anticorpos
    1. Dilua o anticorpo para 0,5 nM para células de Jurkat e 2 nM para células U2OS em 200 μL de 5% (p/v) de BSA em DPBS e adicione a solução de anticorpos ao poço. Para uma marcação ótima de anticorpo único, use uma concentração de anticorpos em ou próxima à sua constante de dissociação de equilíbrio (Kd); se Kd for desconhecido, recomenda-se começar em 1 nM.
    2. Use a função de visualização ao vivo no software de imagem configurado para mSAL para monitorar a ligação de anticorpos.
    3. Ajuste o ângulo do TIRF e os parâmetros de imagem para alcançar uma relação sinal-ruído (SNR) de ≥ 3.
      NOTA: Um ângulo ótimo do TIRF melhora a SNR ao limitar a fluorescência fora de foco causada pela difusão de anticorpos no buffer de imagem. Uma densidade de potência de laser de 100-200 W/cm2 e um tempo de integração de câmera de 50 ms podem ser usados no início. Se o SNR estiver baixo, aumente gradualmente a potência do laser e/ou o tempo de integração da câmera e monitore as mudanças no SNR até que atinja um valor ideal.
    4. Configure os parâmetros de imagem no software de aquisição de imagem para obter pelo menos uma aquisição de 10 quadros com um NII de 5 s (veja o passo 2.12).
      NOTA: Recomenda-se um NII de 5 s como ponto de partida. Deve ser realizada uma tomografia NII para identificar a NII ideal para um novo sistema de anticorpo-alvo (passo 3.2).
    5. Comece a aquisição. Avalie a escassez das localizações de molécula única do filme gravado.
      NOTA: Etapas detalhadas para obter a densidade de localização são descritas em uma publicaçãoanterior 24. Uma densidade de localização de molécula única entre 0,02 e 0,15 eventos/μm2 foi considerada ótima para mSAL.
    6. Se múltiplos eventos sobrepostos de ligação de anticorpos forem observados imediatamente após a adição do tampão de imagem ou se as localizações de moléculas individuais se acumularem ao longo do tempo à medida que o registro avança, aborte a aquisição. Reduza a concentração de anticorpos em duas vezes e repita a aquisição em uma nova amostra. Repita esse processo de redução da concentração de anticorpos em duas vezes e reavalie o número de eventos por unidade de área até que a densidade desejada de localização de uma única molécula seja alcançada.
      NOTA: Eventos sobrepostos se manifestam como múltiplos pontos grandes que se tornam mais brilhantes ou maiores ao se ligar a um novo anticorpo dentro do limite de difração do primeiro anticorpo.
    7. Se a densidade de eventos for escassa, aumente a concentração de anticorpos no buffer de imagem em duas vezes e repita a aquisição em uma nova amostra. Repita esse processo de aumentar a concentração de anticorpos em 2 vezes e reavaliar o número de eventos de ligação por unidade de área até que a densidade desejada de localização de uma única molécula seja alcançada.
      NOTA: Recomenda-se usar uma amostra nova para cada ensaio de otimização de concentração para evitar possíveis interferências de anticorpos pré-ligados em avaliações subsequentes de densidade de localização.
  2. Otimização NII
    1. Configure os parâmetros de imagem no software de aquisição de imagem para obter uma aquisição de 50 quadros (veja o passo 2.12). Defina o NII para 0 (sem atraso).
    2. Prepare o buffer de imagem para a concentração otimizada de anticorpos do passo 3.1 e adicione-o ao poço da amostra. Comece a aquisição.
    3. Repita os passos 3.2.1-3.2.2, ajustando os NIIs para 1, 3, 5, 10 ou 20 s. Realize cada aquisição em uma nova amostra.
    4. Avalie a densidade e a escassez das localizações de molécula única do filme gravado (veja os passos 3.1.5-3.1.7). O NII mais baixo com a densidade ideal de eventos de molécula única é determinado como o NII ótimo.
      NOTA: A concentração de anticorpos pode precisar ser otimizada ainda mais para alcançar a densidade ideal de localização de molécula única para o NII correspondente. Consulte o passo 3.1. Relatórios anteriores mostram que NIIs mais longos (10-20 s) foram mais seletivos em relação a eventos de ligação de maior densidade, mas estender o NII além de 20 s não trouxe melhoriasadicionais 23,24. Se eventos de ligação espacialmente sobrepostos ocorrerem à medida que a aquisição da imagem avança, introduza uma etapa de fotobranqueamento em intervalos suficientes para remover a fluorescência dos anticorpos ligados. Por exemplo, se eventos sobrepostos aparecerem até o quinto quadro, aplique fotobranqueamento a cada quinto quadro. A aparência de eventos espacialmente sobrepostos é descrita na NOTA do passo 3.1.6.

4. Análise de dados

NOTA: a reconstrução de imagem mSAL usa o software gratuito do NIH, Fiji29, com o pluginThunderSTORM 30 . Fiji versão v1.54r e ThunderSTORM versão 1.3 foram utilizadas neste protocolo. A análise detalhada de imagens já foi descrita em um protocolo anterior 24. Nesta seção, descrevemos o fluxo de trabalho de análise usado especificamente para mSAL. A análise apresentada neste protocolo utilizou uma câmera Prime95B sCMOS (número de série A18B203004) com fotoelétrons por A/D de 0,98 e o nível de base da câmera de 100. O tamanho do pixel da imagem definido para 147 nm.

  1. Defina os parâmetros para a reconstrução na janela de Análise de Execução. Os parâmetros usados para reconstruções de imagens CD81 mSAL são descritos abaixo. A função de Pré-visualização deve ser usada para avaliar os eventos de ligação de molécula única detectados no quadro selecionado antes de executar a análise completa.
    Filtragem de Imagens:
    Filtro: Filtro wavelet (B-spline)
    Ordem B-Spline: 2
    Escala B-Spline: 4
    Localização aproximada das moléculas:
    Método: Máximo Local
    Limiar de intensidade máxima: std(Onda.F1)
    Conectividade: 8-bairros
    Localização sub-pixel das moléculas:
    Método: PSF: Gaussiana integrada
    Raio de encaixe [px]: 2
    Método de ajuste: Máxima verosimilhança
    Sigma inicial [px]: 0,75
    Análise de ajuste multiemissor: não selecionada
    Visualização dos resultados:
    Método: Gaussiana Normalizada
    Ampliação: 7,3
    Frequência de atualização [quadros]: 50
    Incerteza lateral: 20
    NOTA: Os parâmetros de pré-filtragem são usados para aprimorar a detecção de emissor único sobre o fundo de fundo. Eles servem como pontos de partida, mas devem ser otimizados para cada conjunto de dados. Os parâmetros aproximados do método de localização e detecção são usados para eventos de ligação de molécula única. O uso de máximos de intensidade local com conectividade de 8 vizinhanças demonstrou fornecer desempenho confiávelde 31. O método Gaussiano integrado com ajuste de máxima verosimilhança foi selecionado, pois é amplamente utilizado e fornece uma aproximação confiável da função de espalhamento pontual (PSF) em aplicações de imagem de moléculaúnica 32,33,34,35. O método de visualização utilizado neste protocolo é o Gaussiano Normalizado. Os usuários podem selecionar o método de visualização que melhor se adequa aos seus dados. A ampliação foi ajustada para gerar um tamanho de pixel reconstruído de 20 nm, o que é apropriado para a precisão de localização esperada alcançada com marcagem baseada em anticorpos, onde o erro de ligação é da ordem de ~10 nm. O fator de ampliação de 7,3 foi calculado dividindo o tamanho do pixel limitado pela difração pelo tamanho desejado do pixel reconstruído (147 nm / 20 nm = 7,3). A frequência de atualização determina com que frequência a imagem reconstruída é atualizada durante o processamento, mas não influencia o resultado final. A incerteza lateral é definida para 20 (mas não forçada) para que a reconstrução incorpore as incertezas de localização calculadas. Para mais detalhes sobre opções disponíveis, consulte o Guia do Usuário30 do ThunderSTORM ou clique no ponto de interrogação ao lado do campo de entrada.
  2. Comece a análise do ThunderSTORM com um sigma inicial de 1,6 pixels e um raio de ajuste de 3. Refinar os parâmetros conforme necessário. O ajuste multiemissor não foi utilizado, pois as densidades de eventos foram mantidas não sobrepostas nas imagens limitadas por difração.
  3. Clique em Ok para executar a reconstrução. Uma vez concluído, a janela de resultados será aberta automaticamente.
  4. Use a função Plot histogram para encontrar o pico sigma. Converta esse valor (nm) em pixels dividindo pelo tamanho dos pixels brutos dos dados, depois reexecute a análise ThunderSTORM usando o novo valor para sigma inicial e o raio de ajuste definido para um inteiro próximo a 3x sigmainicial 30.
  5. Determine a correção de deriva usando o marcador fiduciárioselecionado 24.
  6. Realize a reconstrução da imagem em todo o campo de visão e aplique a correção de deriva calculada.
  7. Para pós-processamento da imagem, clique na aba Filtro da janela de resultados. Aplique filtros para remover eventos mal localizados. Nos resultados exibidos para CD81, eventos com sigma maior que 200 nm e incerteza superior a 20 nm foram removidos. Use a função histograma plotar para examinar a distribuição sigma e determinar um corte apropriado.
    NOTA: Localizações de moléculas únicas com valores sigma altos normalmente surgem de fluoróforos fracos com baixa contagem de fótons ou de emissores sobrepostos. Localizações com incerteza maior que 20 nm também foram removidas, pois uma incerteza que excede o tamanho final do pixel indica baixa precisão de localização. Para orientações adicionais sobre parâmetros de filtragem, consulte o Guia do Usuário30 do ThunderSTORM.
  8. Salve a tabela de resultados com dados de localização de molécula única para análises posteriores selecionando Exportar. O arquivo exportado estará em .csv formato e será chamado de mSAL.csv neste protocolo. Salve a imagem Gaussiana Normalizada resultante.

5. Análise de clusters

NOTA: Durante a sondagem do epítopo, os anticorpos interagem com seus alvos pretendidos (interações específicas), assim como com moléculas fora do alvo (interações não específicas). Como o mSAL depende da detecção cumulativa de eventos únicos de ligação anticorpo-antígeno, algumas interações inespecíficas inevitavelmente contribuem para a imagem reconstruída. As interações anticorpo-epítopo exibem impressões digitais cinéticas distintas que, em princípio, podem distinguir a ligação específica da não específica, onde eventos específicos e não específicos são diferenciados por suas densidades locais de interação, em vez de por permanência de molécula única multiplicadapor 36. Aqui, é descrita uma análise baseada em densidade de agrupamento espacial de aplicações com ruído (DBSCAN)37 para remover eventos de baixa densidade, mantendo eventos de alta densidade que têm maior probabilidade de refletir uma ligação específica de anticorpos. Além disso, o agrupamento baseado em densidade também pode fornecer insights quantitativos sobre a organização espacial em nanoescala de proteínas, especialmente aquelas conhecidas por se organizarem naturalmente em clusters, como CD81 em microdomínios enriquecidos comtetraspanina 38,39,40,41,42. A análise DBSCAN fornecida foi realizada usando o MATLAB 2025a. Para usuários sem acesso ao MATLAB, recomenda-se realizar análises DBSCAN semelhantes com alternativas de código aberto como Python ou R 43,44,45. O código utilizado neste protocolo pode ser obtido em: https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main.

  1. Rodando o código
    1. Baixe o arquivo MATLAB pelo link do GitHub acima.
    2. Inicie o MATLAB e abra o código. Nas linhas 37 e 38, defina o número mínimo de pontos (minPTS) e épsilon para os parâmetros de agrupamento. Os seguintes parâmetros foram utilizados:
      Células T de Jurkat:
      minPTS: 7
      Epsilon: 60
      Células U2OS:
      minPTS: 7
      Épsilão: 80
      NOTA: Veja o passo 5.2 para mais detalhes sobre como otimizar esses parâmetros.
    3. Defina o caminho do arquivo no software MATLAB para a pasta que contém o arquivo mSAL.csv reconstruído.
    4. Execute o código clicando em Executar. O código pedirá ao usuário que selecione um arquivo. Selecione o arquivo mSAL.csv e clique em Abrir.
    5. Os dados agrupados são automaticamente salvos na pasta chamada MATLAB Data, no caminho de arquivo designado dentro do código. Abra este arquivo no ThunderSTORM clicando em Plugins > ThunderSTORM > Importar/Exportar > Importar resultados.
    6. Salve a imagem resultante da microscopia de localização de molécula única.
  2. Otimização das entradas de clustering
    NOTA: Os dois parâmetros de entrada para o algoritmo DBSCAN são o minPTS e o epsilon. Epsilon define o raio ao redor de um ponto para estabelecer sua vizinhança, enquanto minPTS especifica o número mínimo de pontos dentro dessa vizinhança necessários para formar uma região densa. Pontos que satisfazem esse requisito de densidade são classificados como pontos centrais, e suas vizinhanças são adicionadas recursivamente ao agrupamento. Pontos que não atendem ao requisito de densidade, mas se encaixam na vizinhança de um ponto central, são rotulados como pontos de borda, enquanto todos os pontos restantes são considerados pontos de ruído.
    1. Execute a análise usando as entradas descritas acima (passo 5.1.2) como ponto de partida. Escolha um valor minPTS que seja maior que o número de localizações de ruído, mas menor que o número de localizações na célula. Após selecionar o minPTS, ajuste o épsilon para que esse número de localizações possa ser capturado dentro do raio de vizinhança para regiões representativas na célula.
      NOTA: minPTS e épsilon podem ser ajustados independentemente um do outro. Uma abordagem prática para selecionar esses parâmetros é primeiro examinar o gráfico de dispersão dos pontos de ruído fora da célula e compará-los com o número de localizações observadas em áreas de tamanho semelhante na célula.
    2. Avalie a janela rotulada como Figura 2 que mostra os dados agrupados. Se os dados mantiverem agrupamentos na célula contendo o fenótipo esperado com localizações minimizadas fora da célula, as entradas de agrupamento são adequadas.
      NOTA: Os dados agrupados devem manter a estrutura dos dados adquiridos usando mSAL. Se os agrupamentos parecerem pequenos, localizados apenas nas regiões de densidade muito alta dos dados originais e excluirem um número significativo de eventos de ligação que se correlacionem com o fenótipo esperado, os parâmetros de agrupamento podem ser muito restritivos. Se a ligação inespecífica fora da célula não for suficientemente reduzida em grandes agrupamentos, os parâmetros de agrupamento podem ser muito inclusivos.
    3. Se os parâmetros de agrupamento forem muito restritivos, diminua o minPTS e aumente o épsilon para incluir mais pontos nos dados agrupados. Se os parâmetros de agrupamento forem muito inclusivos, aumente o minPTS e diminua o epsilon.
    4. Depois de ajustar o minPTS e o epsilon, execute o código novamente. Repita os passos 5.2.2-5.2.3 até que o agrupamento ideal seja alcançado.

6. Validação da ligação de anticorpos ao seu alvo

NOTA: Para proteínas de membrana sem morfologia bem definida, validar a precisão das estruturas resolvidas pode ser desafiador. Para validar a especificidade dos anticorpos, os usuários podem expressar uma fusão de proteína fluorescente (FP) da proteína alvo. Como verificação inicial, a coloração convencional por imunofluorescência pode ser realizada em células que expressam a fusão FP. Para validação mais precisa ao avaliar novos anticorpos, o mSAL pode ser realizado nas células que expressam FP para confirmar que eventos de ligação localizados correspondem ao alvo marcado fluorescente. Aqui, um protocolo para transfecção de células U2OS com CD81-mStayGold é descrito como exemplo, permitindo a confirmação de que as localizações do CD81 mSAL correspondem ao CD81 rotulado com FP na superfície da célula. Os usuários podem substituir qualquer proteína fluorescente adequada, desde que sua emissão não se sobreponha ao canal de fluorescência do anticorpo validado.

  1. Seme células U2OS em uma lâmina de câmara de 8 poços e cresce até ~70% de confluência. Manter as células em 200 μL de meio de crescimento completo (DMEM suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina).
  2. Combine 100 ng do construto de DNA que codifica a proteína com um repórter fluorescente com 5 μL de Lipofectamina 2000. Faça vórtice por 30 s e incube por 30 minutos em temperatura ambiente.
    NOTA: Este estudo utilizou CD81 fundido ao mStayGold. Técnicas padrão de clonagem molecular foram empregadas na geração de plasmídeos de DNA, embora estes não sejam descritos neste protocolo. O DNA: As proporções de lipofectamina fornecidas são otimizadas para células semeadas em lâminas de câmara de 8 poços e podem precisar de ajuste conforme as instruções do fabricante para outros formatos de amostras.
  3. Adicione 5 μL de solução de DNA/Lipofectamina às células. Incube a lâmina da câmara por 4 horas a 37 °C, suplementada com 5% deCO2 em ambiente úmido.
  4. Substitua o meio por meio de crescimento completo pré-aquecido. Incubar por > 8 horas a 37 °C suplementado com 5% deCO2 em ambiente úmido para permitir níveis detectáveis de expressão proteica.
  5. Avalie os níveis de expressão de fluorescência nas células usando um microscópio de fluorescência ou um imageador. Recomenda-se uma eficiência de transfecção de ≥ 30%. Se os níveis de expressão de fluorescência forem subótimos, otimize a proporção DNA: Lipofectamina de acordo com as diretrizes do fabricante.
    NOTA: Células que expressam transitoriamente devem ser usadas para validação de anticorpos dentro de 24 a 48 horas após a transfecção.
  6. Para consertar as células, siga os passos 1.2.8-1.2.13.
  7. Armazene as amostras fixas em 200 μL de DPBS com 5 mM de azida de sódio até estar pronta para a obtenção de imagem. As amostras podem ser armazenadas a 4 °C por até 1 mês.
    ATENÇÃO: A azida de sódio é extremamente tóxica e pode ser fatal se ingerida. Use EPI adequado ao manusear esse reagente. Em caso de contato com a pele, lave imediatamente a área afetada cuidadosamente com sabão e água. Descarte o reagente de acordo com as diretrizes da instituição do usuário e todas as regulamentações locais, estaduais e federais aplicáveis.
  8. Siga os passos 2.1-2.12 para montar o microscópio e montar a amostra. Identifique uma célula que expressa a proteína de interesse usando o sinal de fluorescência.
  9. Para referência, capture uma imagem TIRF da célula. Se uma proteína fluorescente no mesmo canal de imagem do anticorpo mSAL for utilizada, realize o fotobranqueamento da proteína fluorescente. Para fotobranquear a proteína, utilize a potência máxima do laser por > 10 minutos até que nenhum sinal seja observado.
  10. Adicione o buffer de imagem preparado ao poço e comece a fazer a imagem. A análise deve ser concluída conforme descrito anteriormente (passo 4).
  11. Abra tanto a imagem reconstruída quanto a imagem TIRF da proteína fluorescente adquirida antes da aquisição do mSAL. Avalie as localizações de ligação dos anticorpos mSAL comparando a aparência e localizações da proteína expressa, representada na imagem TIRF limitada por difração, com a imagem mSAL.

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Resultados

A técnica mSAL descrita neste protocolo permite a visualização de eventos únicos de ligação de anticorpos aos respectivos alvos proteicos de membrana plasmática, produzindo um mapa de super-resolução da distribuição das proteínas de membrana. CD81 é usado aqui como um exemplo representativo, embora a abordagem seja facilmente adaptável a outras proteínas de membrana.

Imobilizar células T de Jurkat com espaçamento suficiente entre as células garante acesso ao e...

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Discussão

A organização das proteínas da membrana plasmática desempenha um papel vital na regulação da função celular. As técnicas convencionais de microscopia de fluorescência são limitadas pelo limite de difração da luz, mascarando sua organização em escala nanométrica. O SMLM supera essa limitação ao alcançar resoluções espaciais de 10-20nm 47, permitindo a caracterização de seus conjuntos em nanoescala 10,48,49....

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Divulgações

Todos os autores declaram que não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R35GM146786 e pela Faculdade de Artes Liberais e Ciências da Universidade de Illinois Chicago. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo anti-CD81 Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificMA5-44132Anticorpo de imagem
Centrífuga de bancadaEppendorf5424
Albumina sérica bovinaMilliporeSigmaA7906-100G
Vidro com tampa com câmara, 8 poçosCellvisC8-1-N
Mídia DMEMThermo Fisher Scientific11960069
Soro Tamponado de Fosfato da DulbeccoThermo Fisher Scientific14190-144
Soro fetal bovinoMilliporeSigmaF0926-500ML
Glutaraldeído, 10 %Ciências da Microscopia Eletrônica16120
Coloides de ouro, 100 nmTed Pella15711 e menos; 20Marcador fiducial
Óleo de imersão  Laboratórios Cargille16245
Microscópio invertido  equipado com módulo TIRFInstrumentos NikonEclipse Ti2-EMicroscópio
Linha celular Jurkat E6.1MilliporeSigma88042803-1VLCélulas de suspensão
Lançamento a laser, 6 linhasOxxiusL6CC-CS8-1511Laser de excitação
Lipofectamina 2000Thermo Fisher Scientific11668019Reagente de transfecção
Tubo de microcentrífuga, 1,5 mL VWR89000-028
Software de imagem por microscopiaInstrumentos NikonPesquisa Avançada NIS-ElementosSoftware de avaliação de imagens
Objectivo, 100x/1.49 CFI APO TIRF & nbsp;Instrumentos NikonMRD01991Objetivo do microscópio
Paraformaldeído, 16 %Ciências da Microscopia Eletrônica15710
Penicilina-EstreptomicinaThermo Fisher Scientific15140-122Antibióticos
Solução de poli-L-lisina, 0,01% MilliporeSigmaP4707-50ML
Câmera Prime 95B sCMOSSoluções Teledyne Vision01-PRIME-95B-R-M-16-CCâmera
Mídia RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093Mídia para células de suspensão
Azida de sódioThermo Fisher Scientific19038-1000
Borohidreto de sódioMilliporeSigma213462-25G
Frascos de cultura T25Thermo Fisher Scientific169900
Microsferas TetraSpeckMarcador fiducial
Placa de cultura de tecidos, 100 mm & nbsp;Corning353003
Linha celular U2OSATCCHTB-96Células aderentes

Referências

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