Perfil Fitoquímico, Cromatografia de Gases – Análise por Espectrometria de Massas e Atividade In Vivo de Terminalia mantaly em ratos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que integra análise fitoquímica, caracterização por Cromatografia Gasosa e Espectrometria de Massas, e ensaios in vivo validados para avaliar as atividades anti-inflamatórias, analgésicas e antipiréticas da Terminalia mantaly, fornecendo uma estrutura reprodutível para avaliação farmacológica de plantas medicinais.

Resumo

Medicamentos sintéticos para inflamação, dor e febre são eficazes, mas frequentemente causam efeitos adversos, aumentando o interesse em alternativas terapêuticas derivadas de plantas. Terminalia mantaly H. Perrier, tradicionalmente usada na medicina africana, tem validação científica limitada. Este estudo apresenta um protocolo experimental integrado que combina triagem fitoquímica, análise quantitativa de compostos fenólicos e flavonoides, caracterização de cromatografia gasosa–espectrometria de massas (GC-MS) e testes farmacológicos in vivo para avaliar o potencial terapêutico do extrato metanolo de T. mantaly. A triagem fitoquímica confirmou a presença de múltiplas classes bioativas, e a análise GC–MS identificou vinte constituintes, incluindo ácidos graxos, fitoesteróis, tocoferóis e outros compostos bioativos com propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes conhecidas. A avaliação farmacológica in vivo em ratos demonstrou atividade anti-inflamatória dependente de dose no modelo de edema das patas induzido por carragenina, prolongamento significativo da latência de abstinência de dor no ensaio de imersão caudal e redução da pirexia induzida por leveduras. Em doses mais altas, o extrato apresentou efeitos comparáveis a medicamentos padrão como diclofenaco e paracetamol. Avaliações de toxicidade aguda e citotoxicidade indicaram um perfil de segurança favorável dentro da faixa de dose testada. Juntos, esses achados validam o uso etnomedicinal de T. mantaly e demonstram uma estrutura experimental reprodutível para vincular composição fitoquímica à atividade farmacológica. O protocolo fornece uma referência metodológica prática para pesquisadores que investigam plantas medicinais e apoia o desenvolvimento de agentes derivados de plantas para o manejo de condições inflamatórias e febris.

Introdução

Inflamação, dor e febre são processos patológicos interligados que estão na base de uma ampla gama de doenças agudas e crônicas. Embora medicamentos sintéticos como agentes anti-inflamatórios não esteroides, corticosteroides e paracetamol continuem sendo a base da terapia, seu uso prolongado está frequentemente associado a irritação gastrointestinal, complicações renais, hepatotoxicidade e outros efeitos^adversos. Essas limitações despertaram um interesse crescente por plantas medicinais como alternativas mais seguras e sustentáveis para o manejo de condições inflamatórias e febris. Produtos naturais são amplamente reconhecidos por sua rica diversidade de moléculas bioativas, muitas das quais servem como líderes para o desenvolvimento moderno de medicamentos. Nesse contexto, T. mantaly, membro da família Combretaceae, chamou atenção devido ao seu uso etnomedicinal em sistemas tradicionais africanos para tratar infecções, doenças gastrointestinais e distúrbios^{inflamatórios 2,3}. Apesar de sua relevância tradicional, estudos farmacológicos sistemáticos que validam seu potencial terapêutico permanecem limitados. Em particular, há escassez de investigações abrangentes que integrem triagem fitoquímica, avaliações biológicas in vivo e métodos avançados de perfilamento químico, como GC–MS. Abordar essa lacuna é crucial para fundamentar cientificamente suas aplicações folclóricas e identificar potenciais compostos principais para uso^{farmacêutico 4}. No presente estudo, o extrato metanolo de T. mantaly foi submetido a uma avaliação fitoquímica e farmacológica detalhada. Análises preliminares confirmaram a presença de metabólitos-chave, incluindo fenólicos, flavonoides, taninos, saponinas e terpenoides, todos conhecidos por contribuir para efeitos anti-inflamatórios, analgésicos e^{antioxidantes 5}. Testes quantitativos revelaram ainda que o extrato continha níveis substanciais de compostos fenólicos e flavonoides, com valores comparáveis aos padrões de referência, sugerindo um forte potencial antioxidante.

Modelos animais foram utilizados porque as respostas farmacológicas avaliadas envolvem vias inflamatórias, neurais e termorregulatórias integradas que não podem ser reproduzidas in vitro. Os ensaios in vivo forneceram evidências farmacológicas claras de bioatividade. As propriedades anti-inflamatórias (edema das patas induzidas pela carragenina), analgésicas (imersão da cauda) e antipiréticas (pirexia induzida por leveduras) foram testadas em ratos, demonstrando atividade anti-inflamatória dependente de dose semelhante à do diclofenaco sódico em doses mais altas. Da mesma forma, o extrato aumentou as latências de imersão na cauda em ratos, confirmando sua eficácia analgésica, enquanto modelos de pirexia induzida por leveduras mostraram efeitos antipiréticos marcantes, muito semelhantes aos do paracetamol⁶. O perfil químico por meio da análise GC–MS proporcionou insights mais profundos sobre sua composição bioativa. Um total de 20 compostos foram identificados, incluindo 3,5-dihidroxi-6-metil-2,3-dihidro-4H-piran-4-ona, ácido linoleico, γ-sitosterol, esqualeno e vitamina E. Esses compostos são bem documentados por suas propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e cardioprotetoras, apoiando os resultados farmacológicos^{observados 7,8}. Importante, as avaliações de toxicidade revelaram efeitos citotóxicos negligenciáveis, ressaltando sua segurança nas doses testadas. Em conjunto, este estudo aborda uma lacuna crítica ao fornecer evidências tanto fitoquímicas quanto farmacológicas sobre o valor medicinal do T. mantaly. Os achados não apenas comprovam suas aplicações tradicionais, mas também destacam seu potencial como fonte natural de compostos principais para o desenvolvimento de novas terapias contra inflamação e distúrbios relacionados. Os modelos experimentais utilizados neste estudo refletem principalmente respostas inflamatórias agudas e nociceptivas e, portanto, fornecem evidências farmacológicas preliminares, em vez de uma indicação direta de eficácia terapêutica crônica.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes internacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório e cumpriram as recomendações da OCDE. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal (IACUC) da Universidade Bahauddin Zakariya, em Multan. (Aprovação nº: 3 /UREC/2025). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal e reduzir o número de animais utilizados.

1. Preparação do extrato metanólico integral de T. mantaly (TMWM)

1. Colete caules, raízes e folhas frescas de T. mantaly, autentique o material vegetal e deposite um espécime voucher em um herbário reconhecido.
   NOTA: O material vegetal utilizado neste estudo foi coletado no Punjab Nursery, Mattital Road, Multan, em 12 de novembro de 2023. As coordenadas geográficas do local de coleta são 30,2236° N, 71,4755° E. A planta foi autenticada taxonomicamente pelo taxonomista Prof. Dr. Zafar Ullah Zafar, professor de botânica da Universidade Bahauddin Zakariya, Multan, e um espécime voucher (www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2434420) foram depositados no herbário da Universidade Bahauddin Zakariya, em Multan. A planta foi coletada de seu habitat natural sob condições ambientais adequadas, e o local de coleta foi documentado com fotografias.
2. Lave o material vegetal com água da torneira, seguida de água destilada para remover contaminantes, depois sece à sombra a 25–30 °C por 7–10 dias até atingir peso constante.
3. Moa o material seco até virar pó grosso e pesar 500 g usando uma balança analítica. Transfira o pó para um recipiente de vidro limpo e adicione 2,5 L de metanol.
4. Macera a mistura em temperatura ambiente por 72 horas, agitando intermitentemente a cada 6–8 horas. Filtre através do papel filtro Whatman No.1.
5. Concentre o filtrado sob pressão reduzida usando um evaporador rotativo a 39 °C, depois armazene o extrato seco em recipientes herméticos em temperatura ambiente até o uso.
   ATENÇÃO: O metanol é tóxico e inflamável. Realize o manuseio dentro de uma capuza usando luvas e óculos de proteção. Descarte resíduos de solventes conforme as diretrizes institucionais de segurança química.
   NOTA: O extrato seco pode ser armazenado em recipientes herméticos em temperatura ambiente por várias semanas antes de análise adicional.

2. Estimativa do conteúdo fenólico total (método Folin–Ciocalteu)

1. Prepare solução de estoque de ácido gálico (100 μg/mL) dissolvendo 10 mg de ácido gálico em 100 mL de metanol e prepare diluições seriadas que variam de 1 a 10 μg/mL.
2. Dissolva extrato de 10 mg em 10 mL de metanol para obter uma solução de 1 mg/mL. Transfira 0,5 mL de cada padrão ou amostra para tubos de ensaio.
3. Adicione 2,5 mL de reagente Folin–Ciocalteu diluído 1:1 com água, depois adicione 2,0 mL de solução de carbonato de sódio a 7,5%. Misture e incube a 25 ± 2 °C por 30 minutos.
4. Meça a absorção em 765 nm em relação a um reagente em branco e calcule o conteúdo fenólico total como mg equivalentes de ácido gálico por g de extrato.

3. Estimativa do teor total de flavonoides (método do cloreto de alumínio)

1. Prepare uma solução de estoque de rutina (1000 μg/mL) dissolvendo rutina em metanol, depois prepare diluições seriadas na faixa de 10–80 μg/mL.
2. Transfira 0,5 mL da solução padrão ou extraída para tubos de ensaio e adicione 1,5 mL de metanol, 0,1 mL de solução de cloreto de alumínio a 10% (AlCl₃), 0,1 mL de solução de acetato de potássio de 1 M e 2,8 mL de água destilada.
3. Incube em temperatura ambiente por 30 minutos e meça a absorção a 415 nm. Expresse os resultados como mg equivalentes de rutina por g^{extrato 9}.

4. Análise de cromatografia gasosa–espectrometria de massa (GC–MS)

1. Dissolva o extrato de 10 mg em metanol de grau HPLC de 1 mL e filtre através de um filtro de seringa de 0,22 μm para um frasco de GC.
2. Realizar análise usando um GC Agilent 7890B acoplado a um MS 5977A equipado com coluna capilar HP-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Use hélio como gás transportador a 1,0 mL/min com temperatura do injetor a 250 °C.
3. Manter a temperatura da fonte iônica em 230 °C e a temperatura quadrupolar em 150 °C. Programe o forno de 60 °C (2 min de seguração) para 180 °C a 10 °C/min e depois para 280 °C a 5 °C/min com uma última retenção de 10 min.
4. Injete 1 μL do extrato filtrado em modo dividido (10:1) e registre cromatogramas em uma faixa m/z de 40–600. Faça um filtro de solvente antes da injeção da amostra.
5. Identifique compostos comparando espectros com a biblioteca espectral de massa do NIST e confirme identidades usando a normalização do tempo de retenção e da área de pico.

5. Atividade anti-inflamatória (edema das patas induzido por carragenina)

1. Use ratos Wistar Albinos saudáveis pesando entre 180 e 220 g e aclimate por 7 dias. Animais rápidos durante a noite antes do experimento com acesso livre à água.
2. Divida aleatoriamente os animais em cinco grupos (n = 5 por grupo). Administrar soro fisiológico normal aos controles; administrar oralmente 100, 200 e 300 mg/kg aos grupos de tratamento; e administrar diclofenaco sódico (40 mg/kg, subcutâneo) ao grupo padrão.
3. Após 1 hora, injete 0,1 mL de 1% de carragenina recém-preparada na região subplantar da pata traseira direita.
4. Meça a espessura da pata em 0, 1, 2, 3 e 4 h usando um pinça digital vernier e calcule o aumento em relação à linha de base.
5. Determinar a porcentagem de inibição do edema em comparação com o grupo^{controle 10}.
   ATENÇÃO: O pó de carragenina pode causar irritação. Evite inalação e contato com a pele e descarte resíduos biológicos de acordo com os procedimentos institucionais de biossegurança.

6. Atividade analgésica (teste de imersão da cauda)

1. Use ratos Wistar Albinos aclimatados, mantidos em um ciclo de 12 horas de luz/escuridão com acesso livre a comida e água.
2. Divida os animais em cinco grupos (n = 5). Administrar água destilada aos controles, extrair oralmente a 100, 200 e 300 mg/kg aos grupos de tratamento, e paracetamol (20 mg/kg) ao grupo padrão.
3. Mantenha o banho-maria a 55 ± 1 °C. Imergir 1–2 cm da cauda distal e registrar a latência de retirada de base usando um tempo de corte de 15 s.
4. Repita as medições em 30, 60, 90 e 120 minutos após o tratamento, garantindo que a mesma porção da cauda seja imersa a cada vez.
5. Calcule o aumento percentual na latência e expresse os resultados como média ± SD.

7. Atividade antipirética

1. Use ratos aclimatados e registre a temperatura retal normal usando um termômetro digital lubrificado.
2. Prepare uma suspensão de levedura de 20% em água destilada e injete subcutâneamente a 10 mL/kg no dorso para induzir pirexia.
3. Após 18 horas, meça novamente a temperatura retal e exclua animais que não apresentam pelo menos 0,5 °C de aumento.
4. Divida aleatoriamente os ratos febris em cinco grupos (n = 5 por grupo). Administrar soro fisiológico normal ao grupo controle, extrato vegetal por via oral a 100, 200 e 300 mg/kg aos grupos de tratamento, e paracetamol (150 mg/kg) ao grupo padrão.
5. Meça a temperatura retal em 0, 1, 2 e 3 h após o tratamento e calcule a redução em relação ao ponto^{de partida 11}.
   ATENÇÃO: As suspensões de levedura de cervejeira são materiais biológicos e devem ser manuseadas seguindo as precauções padrão de biossegurança. Descarte materiais suspensos não utilizados e contaminados como resíduos biológicos.
   NOTA: Após a injeção de levedura, os animais podem ser devolvidos às gaiolas e mantidos sob condições padrão até a medição da temperatura.

8. Estudos de toxicidade aguda

1. Conduza o estudo de acordo com a diretriz 423 da Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) usando ratos Wistar Albinos saudáveis de ambos os sexos, pesando entre 180 e 220 g.
2. Jejue animais durante a noite antes da dosagem e divida-os aleatoriamente em grupos (n = 5 por grupo).
3. Administrar uma dose oral única de 5 g/kg de peso corporal do extrato aos animais de tratamento e água destilada (1 mL/kg) aos animais controle.
4. Observe os animais continuamente nas primeiras 4 horas após a dosagem, periodicamente durante as primeiras 24 horas e diariamente por 14 dias.
   NOTA: Os critérios de observação incluem alterações na condição da pele e pelo, olhos e mucosas, padrão respiratório, salivação, tremores, convulsões, atividade locomotora e respostas comportamentais gerais.
5. Registre sinais clínicos de toxicidade, mortalidade e peso corporal nos dias 0, dia 7 e dia 14.
6. Avalie a segurança com base na taxa de sobrevivência e nas mudanças comportamentais ou físicas^{observadas 12}.
   NOTA: A pontuação comportamental inclui monitoramento da postura, marcha, nível de atividade, comportamento de cuidado, resposta a estímulos externos e sinais de letargia ou hiperatividade.

9. Análise estatística

1. Compile todos os dados experimentais e expresse os resultados como média ± desvio padrão com n = 5 animais por grupo.
2. Insira os dados no software GraphPad Prism em formato coluna.
3. Avalie a normalidade dos dados usando o teste de Shapiro–Wilk antes de aplicar a análise comparativa.
4. Realize análise estatística usando o software GraphPad Prism selecionando: Analisar → ANOVA unidirecional → comparações múltiplas de Tukey.
5. Realize uma análise unidirecional da variância seguida pelo teste de comparação múltipla post hoc de Tukey para determinar a significância estatística entre os grupos.
6. Considere diferenças estatisticamente significativas em p < 0,05.

Resultados

As abordagens experimentais descritas neste estudo geraram dados reprodutíveis in vitro e in vivo que permitiram avaliar tanto a composição fitoquímica quanto as atividades farmacológicas do extrato metanolo de T. mantaly. Todas as medições experimentais foram realizadas em réplicas, e os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (DS). A significância estatística entre os grupos foi determinada usando ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc de Tukey, com p < 0,05 considerado significativo...

Discussão

Neste estudo, uma combinação de caracterização fitoquímica e modelos farmacológicos estabelecidos in vivo foi usada para avaliar o potencial anti-inflamatório, analgésico e antipirético do extrato metanolo de T. mantaly. Os modelos experimentais empregados são amplamente utilizados em pesquisas de produtos naturais e fornecem uma estrutura prática para avaliação preliminar da atividade biológica.

Os tempos de retenção reproduzíveis dos compostos suste...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ratos Wistar albinos	Casa de animais institucional	N/A	Animais experimentais
Cloreto de alumínio	Sigma-Aldrich	237051	Ensaio flavonoide
Brewer' S levedura	Sigma-Aldrich	YSC2	Indução por pirexia
Carragenino	Sigma-Aldrich	C1013	Indução do edema da pata
Centrífuga	Eppendorf	5810R	Processamento de amostras
Diclofenaco sódico	Sigma-Aldrich	D6899	Padrão anti-inflamatório
Termômetro digital retal	Omron	MC-246	Medição de temperatura retal
Pinzer vernier digital	Mitutoyo	500-196-30	Medição da espessura da pata
Água destilada	Interno	N/A	Solvente
Folin– Reagente de ciocalteu	Sigma-Aldrich	F9252	Ensaio fenólico
Ácido gaulês	Sigma-Aldrich	G7384	Padrão fenólico
GC– Sistema MS	Tecnologias Agilent	7890B– 5977A	Perfilamento fitoquímico
GraphPad Prisma	GraphPad Software	Versão 8.0	Software de análise estatística
Metanol (grau HPLC)	Merck	106009	Solvente de extração
Agulha gavage oral	Instech	FTP-20-38	Administração oral
Paracetamol	Sigma-Aldrich	P0300000	Padrão de analgésicos e antipiréticos
Acetato de potássio	Merck	104820	Ensaio flavonoide
Evaporador rotativo	Bü chi	R-200	Concentração do extrato
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143	Padrão flavonoide
Carbonato de sódio	Merck	106392	Ensaio fenólico
UV– Espectrofotômetro visível	Shimadzu	UV-1800	Medição de absorvância
Banho-maria (termostático)	Memmert	WNB14	Teste de imersão da cauda