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Artigo de investigação

A Decocção Gegen Qinlian Atenua a Colite Ulcerativa ao Inibir a PANoptose: Um Estudo Multi-Ômico e Experimental

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DOI:

10.3791/69858

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22 de maio de 2026

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1College of Clinical Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Gynaecology, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou University, 4College of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5College of Health and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6State Key Laboratory of Oral Diseases, National Center for Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Traditional Chinese Medicine, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 7Department of Stomatology, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que integra análise multi-ômica com validação in vivo para investigar como a Decocção Gegen Qinlian alivia a colite ulcerosa ao regular alvos relacionados à PANoptose e vias de sinalização inflamatória.

Resumo

Apresentamos um protocolo integrado de bioinformática e farmacologia em rede para esclarecer os mecanismos terapêuticos da Decocção de Gegen Qinlian (GQD) na colite ulcerativa (UC), com foco especial na regulação relacionada à PANoptose. Esse protocolo foi projetado para identificar sistematicamente potenciais compostos bioativos, alvos terapêuticos, vias de sinalização e mecanismos relacionados ao sistema imunológico por meio de mineração multibanco de dados e análise transcriptômica. Perfis de expressão gênica de coortes de, incluindo GSE87466 e GSE92415 do banco de dados GEO, são analisados por meio de análise diferencial de expressão e análise ponderada de redes de coexpressão gênica para identificar genes relacionados à doença. Alvos candidatos da GQD são coletados de bancos de dados públicos de farmacologia e intersectados com genes associados à UC- e PANoptose para determinar os principais alvos terapêuticos. A construção de redes de interação proteína-proteína, análises de enriquecimento e modelagem de redes composto-alvo-via são então realizadas para revelar a base molecular da atividade GQD. Além disso, a análise de infiltração imune é incorporada para explorar a relação entre genes-chave e o microambiente imunológico intestinal. O acoplamento molecular é ainda utilizado para avaliar o potencial de ligação entre compostos ativos principais e alvos centrais. Esse protocolo fornece uma estrutura sistemática e reprodutível para investigar como a GQD alivia a modulando a PANoptose e vias inflamatórias relacionadas, podendo servir como referência útil para estudos mecanicistas de outras fórmulas da medicina tradicional chinesa em doenças inflamatórias complexas.

Introdução

A colite ulcerativa (), uma das principais formas de doença inflamatória intestinal, é um distúrbio inflamatório crônico recorrente que envolve principalmente a mucosa do cólon e normalmente começa no reto com extensão proximal contínua. Sua patogênese é complexa e envolve ativação imune mucosa aberrante, disfunção da barreira epitelial, perturbação microbiana e interações desreguladas entre hospedeiro e ambiente, impondo juntas uma carga global substancial e crescentede saúde 1,2. A inflamação mucosa persistente não só causa sintomas recorrentes como dor abdominal, diarreia e hematoquezia, mas também aumenta o risco a longo prazo de câncer colorretal associado à colite, especialmente em pacientes com doença extensa e de longaduração 3,4.

O manejo farmacológico atual da depende principalmente de 5-aminosalicilatos, corticosteroides, imunomoduladores, biológicos e agentes de pequenas moléculas, dependendo da gravidade da doença e da respostaterapêutica 5. Embora essas estratégias tenham melhorado os resultados clínicos, uma proporção considerável de pacientes ainda apresenta não resposta primária, perda secundária de resposta, intolerância, dependência de esteroides ou eventos adversos relacionados ao tratamento, destacando a necessidade de opções terapêuticas mais seguras e orientadas paramecanismos 6. Portanto, identificar programas moleculares a montante que regulam simultaneamente a lesão epitelial e a desregulação imunológica intestinal é de grande importância para a translação.

Estudos recentes mostraram que a morte celular programada desregulada está profundamente envolvida na patogênese da. Além da apoptose clássica, piroptose e necroptose têm sido implicadas na destruição da barreira epitelial e na amplificação da inflamaçãomucosa 7. A PANoptose, uma via inflamatória de morte celular programada recentemente definida que integra características-chave da piroptose, apoptose e necroptose, emergiu como uma estrutura mecanicista particularmente relevante para doenças inflamatóriascrônicas 8. Esse processo é coordenado por complexos PANoptossomo multiproteicos e envolve mediadores centrais como ZBP1, RIPK1/RIPK3, CASP8 e moléculas relacionadas a inflamasomas, incluindo NLRP3, de forma dependente docontexto 9. Importante, evidências acumuladas indicam que a PANoptose é ativada na e pode promover danos epiteliais intestinais, quebra da barreira e desequilíbrio imunológico, contribuindo assim para a progressão dadoença 10,11,12. Esses achados sugerem que a panoptose não é apenas uma consequência posterior da inflamação, mas pode representar um nódulo mecanicamente acionável que liga a lesão epitelial à amplificação imune mucosa.

A Decocção Gegen Qinlian (GQD), uma prescrição clássica registrada pela primeira vez em Shang Han Lun, consiste em Pueraria lobata, Scutellaria baicalensis, Coptis chinensis e Glycyrrhiza uralensis. Há muito tempo é usado na medicina tradicional chinesa para diarreia e distúrbios inflamatórios intestinais. Estudos farmacológicos modernos mostraram que a GQD pode aliviar a colite experimental ao suprimir respostas inflamatórias, restaurar a integridade da barreira intestinal, remodelar a microbiota intestinal e modular a homeostase imunológica, incluindo sinalização relacionada ao Th17/Treg e atividadeinflamassoma 13,14. Essas ações multialvo tornam a GQD uma candidata plausível para intervir em processos patológicos relacionados à PANoptose na UC15. No entanto, apesar das crescentes evidências de sua eficácia anti-cólica, ainda não está claro se a GQD exerce efeitos terapêuticos por meio da regulação coordenada das redes moleculares associadas à PANoptose.

Atualmente, duas grandes lacunas permanecem. Primeiro, estudos existentes sobre os mecanismos de morte celular da têm focado principalmente em vias isoladas como apoptose, piroptose ou ferroptose, enquanto o papel integrado da PANoptose na mediação dos efeitos terapêuticos das fórmulas herbais não foi suficientementeesclarecido 7,10,11. Segundo, embora a farmacologia de redes seja bem adequada para caracterizar a natureza "multi-componente-múltiplo-alvo-múltiplas vias" das fórmulas tradicionais, previsões baseadas apenas em bancos de dados composto-alvo podem não ter especificidade no contexto da doença e exigir priorização transcriptômica e validação experimental para melhorar a plausibilidade biológica e a confiabilidadetranslacional 16,17,18,19 . Assim, uma estratégia integrada que combine transcriptômica de doenças, farmacologia em redes e verificação in vivo pode fornecer uma estrutura mais rigorosa para elucidar o mecanismo da DBG na.

Comparado a abordagens baseadas exclusivamente em observação histopatológica, ensaios moleculares de via única ou farmacologia em redes baseadas apenas em bancos de dados, o fluxo de trabalho atual é mais adequado a essa questão porque permite a validação cruzada entre sinais transcriptômicos do contexto da doença, predição de alvo de fórmula e verificação biológica em um modelo experimental de colite. Leituras histológicas ou moleculares isoladas podem capturar apenas dimensões limitadas da patologia da, enquanto a farmacologia em rede sozinha pode carecer de especificidade suficiente da doença e suporte experimental. Ao integrar a priorização transcriptômica com validação in vivo, esse fluxo de trabalho melhora a plausibilidade biológica da identificação de alvos e fornece uma estrutura mais coerente para ligar a intervenção GQD aos mecanismos associados à PANoptose na.

Este protocolo é mais adequado para estudos mecanicistas que visam avaliar como intervenções multicomponentes regulam lesão epitelial, respostas inflamatórias e vias relacionadas à PANoptose em experimental. É particularmente útil quando o objetivo é conectar a previsão computacional à validação biológica em nível animal em um fluxo de trabalho padronizado. No entanto, não se destina a substituir abordagens clínicas diagnósticas, nem aborda de forma abrangente todas as dimensões da patogênese da, como heterogeneidade de longo prazo do paciente, interações causais em todo o microbioma ou mapeamento imunocelular e espacialmente resolvido. Portanto, seu escopo é melhor definido como uma estrutura pré-clínica reprodutível para avaliação orientada a mecanismos e terapêutica.

Portanto, hipotetizamos que a GQD melhora a modulando as redes de sinalização relacionadas à PANoptose, atenuando assim a lesão epitelial intestinal e reprogramando o microambiente inflamatório. Para testar essa hipótese, integramos a análise transcriptômica da com farmacologia em rede para identificar alvos terapêuticos compartilhados e caminhos-chave da GQD, com foco especial nos reguladores associados à PANoptose. Validamos ainda os mecanismos previstos em um modelo de colite murina induzida por sulfato de dextrano sódico (DSS). Ao combinar a priorização computacional de alvos com verificação biológica, este estudo buscou fornecer uma explicação mais relevante para a doença e mecanicamente fundamentada para os efeitos anti-UC da GQD, além de oferecer novas evidências que apoiem a PANoptose como um possível eixo terapêutico na UC.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados antes do início do estudo pelo Comitê Ético da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Aprovação nº 2022-126). Apenas conjuntos de dados GEO e GWAS disponíveis publicamente foram usados para as análises de bioinformática; portanto, não foi necessário consentimento informado adicional ou aprovação ética para o componente computacional deste estudo. Todos os procedimentos envolvendo produtos químicos perigosos, amostras biológicas e resíduos animais foram realizados de acordo com as regulamentações institucionais de segurança laboratorial e procedimentos institucionais para descarte de resíduos perigosos.

Aquisição e pré-processamento de conjuntos de dados GEO

Conjuntos de dados transcriptômicos humanos relacionados à colite ulcerativa () foram retirados do banco de dados GEO usando a palavra-chave "colite ulcerativa". Após triagem para conjuntos de dados de perfil de expressão com grupos de controle e saudáveis claramente definidos e tamanho de amostra suficiente, GSE8746620 eGSE92415 21, ambos gerados na plataforma GPL13158, foram selecionados como a coorte de treinamento. Esses conjuntos de dados continham 87 amostras de e 21 controles saudáveis, e 53 amostras de e 21 controles saudáveis, respectivamente. Para validação externa, GSE8747322 (106 amostras de e 21 controles saudáveis) e GSE1687923 (48 amostras de e 12 controles saudáveis; Foram incluídas a plataforma GPL570). Arquivos brutos ou de matriz em série eram baixados e importados para o R para pré-processamento. Os identificadores da sonda eram convertidos em símbolos genéticos de acordo com os arquivos de anotação correspondentes da plataforma. Quando múltiplas sondas mapeavam para o mesmo símbolo do gene, o valor médio de expressão era mantido. Amostras que não apresentavam informações claras sobre o grupo foram excluídas antes da análise a jusante. Os dois conjuntos de dados de treinamento foram fundidos por símbolos genéticos comuns. Os valores de expressão eram transformados log2 quando necessário, normalizados usando um procedimento padrão de normalização entre arrays, e corrigidos para efeitos de lote usando um método de ajuste por lote após definir a origem do conjunto de dados como variável de lote. Análise de componentes principais e inspeção por boxplot foram usadas antes e depois da normalização/correção por lote como pontos de controle de qualidade. O pré-processamento bem-sucedido foi definido pela melhor sobreposição das distribuições amostrais entre conjuntos de dados e pela atenuação do agrupamento orientado por conjuntos de dados. Um total de 902 genes relacionados à PANoptose foram compilados a partir da literatura publicada e usados como conjunto de genes de referência para análise integrativa.

Identificação de genes diferencialmente expressos e construção da rede WGCNA

A matriz de treinamento combinada foi analisada em R usando um fluxo de trabalho de expressão diferencial. Genes com|log 2 de variação| ≥ 0,585 e P ajustado < 0,05 foram definidos como genes diferencialmente expressos (DEGs). Gráficos vulcânicos e mapas de calor foram gerados como resultados intermediários para confirmar que os critérios de filtragem apresentavam diferenças de expressão biologicamente interpretáveis entre grupos UC e controle. Para a análise ponderada da rede de coexpressão gênica (WGCNA), os genes foram classificados por variância entre amostras, e os 25% mais variáveis foram mantidos como entrada. Uma árvore de agrupamento de amostras foi examinada primeiro para identificar potenciais amostras de valores atípicos; Nenhum valor fora da ordem era mantido para a construção da rede, a menos que a remoção fosse justificada por critérios de controle de qualidade. Uma potência de limiar suave foi selecionada com base no índice de ajuste topológico livre de escala, e a menor potência que alcançava uma rede aproximadamente livre de escala foi usada para construir a matriz de adjacência. A matriz de adjacência foi então transformada em uma matriz de sobreposição topológica, e o agrupamento hierárquico foi realizado usando dissimilaridade baseada em TOM. Os módulos foram identificados usando corte dinâmico em árvore com tamanho mínimo de módulo de 100 genes. Módulos intimamente relacionados foram fundidos quando sua correlação autogênica excedeu o critério de fusão pré-definido. Autogênios dos módulos, significância dos módulos e valores de significância gênica foram calculados para identificar os módulos mais fortemente associados ao fenótipo da. Um passo bem-sucedido do WGCNA foi definido pela separação estável dos módulos, tamanhos biologicamente plausíveis dos módulos e um ou mais módulos mostrando clara correlação com o status da doença.

Identificação de alvos candidatos no GQD

Compostos candidatos e alvos correspondentes aos quatro componentes herbais da Decocção Gegen Qinlian (GQD) — Pueraria lobata, Scutellaria baicalensis, Coptis chinensis e Glycyrrhiza uralensis — foram coletados do TCMSP24 e doBATMAN-TCM 25. Os limiares de triagem foram estabelecidos da seguinte forma: biodisponibilidade oral ≥ 30% e semelhança com fármacos ≥ 0,18 para registros derivados de um único banco de dados; O escore de confiança ≥ 0,84 e ajustou o P < 0,05 para registros derivados de outro banco de dados. Compostos adicionais foram complementados a partir de um banco de dados de fitoterapia quando registros relevantes não foram capturados na busca inicial. As sequências canônicas SMILES de compostos retidos foram enviadas a uma plataforma online de avaliação ADME. Os compostos foram retidos quando apresentaram alta absorção gastrointestinal e atenderam pelo menos dois conjuntos de regras de semelhança de medicamentos entre Lipinski, Ghose, Veber, Egan e Muegge. Os alvos supostos foram então previstos usando uma plataforma de previsão de alvo com probabilidade > 0,1 e padronizados para símbolos genéticos oficiais usando um banco de dados de anotação proteica. Compostos duplicados e alvos duplicados foram removidos após a fusão do banco de dados. O resultado esperado dessa etapa foi um conjunto de dados composto-alvo GQD não redundante, adequado para análise de sobreposição.

Identificação da ação de genes sobrepostos e desempenho da análise funcional

Os potenciais alvos terapêuticos foram definidos como a interseção entre alvos relacionados à GQD, genes relacionados à identificados a partir da expressão diferencial e WGCNA, e o conjunto genético relacionado à PANoptose. As relações de sobreposição foram visualizadas usando um diagrama de Venn. Os genes que se intersectam foram então submetidos a um banco de dados de interação proteína-proteína (PPI), e pares de interação com escore de confiança ≥ 0,4 foram mantidos. A rede PPI resultante foi exportada e visualizada em uma plataforma de análise de rede. Um passo bem-sucedido do PPI foi definido pela presença de uma rede conectada contendo a maioria dos genes que se intersetam, em vez de apenas nós isolados. A análise de enriquecimento funcional, incluindo a Ontologia Genética (GO) e a análise da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG), foi realizada em R, com q < 0,05 como limiar de significância. Termos ou caminhos que não atendiam esse limite foram excluídos. Os processos biológicos e vias de sinalização altamente enriquecidos foram resumidos para inferir o mecanismo potencial pelo qual a GQD pode regular a. Gráficos de barra e gráficos de bolhas foram gerados como saídas intermediárias para verificar se os resultados do enriquecimento foram dominados por vias relacionadas à inflamação, imunidade ou lesão epitelial, conforme esperado no contexto biológico.

Análise de padrões de expressão, localização cromossômica e correlações

Os níveis de expressão dos genes compartilhados foram comparados entre os grupos de e controle usando um fluxo padrão de visualização de expressão diferencial em R. Boxplots e mapas de calor foram gerados, e P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Apenas genes com direção de expressão interpretável e comportamento consistente entre a coorte de treinamento foram mantidos para avaliação mecanicista subsequente. A localização cromossômica dos genes centrais selecionados foi mapeada após formatar arquivos de anotação genética na estrutura de entrada necessária, e as posições genômicas foram visualizadas usando um fluxo de trabalho de plotagem de cromossomos circulares. Matrizes de correlação entre os genes centrais foram então calculadas usando análise de correlação par a par. O resultado esperado dessa etapa foi a identificação de pares de genes que apresentassem padrões coordenados de expressão que pudessem apoiar a regulação compartilhada ou a interação funcional.

Construção e avaliação de modelos de aprendizado de máquina

O desenvolvimento do modelo diagnóstico foi realizado usando a coorte de treinamento fundida (GSE87466 + GSE92415), enquanto GSE16879 e GSE87473 foram usados como conjuntos de dados externos independentes de validação. Doze algoritmos de aprendizado de máquina — Lasso, Ridge, Stepglm, XGBoost, Random Forest, Enet, plsRglm, GBM, NaiveBayes, LDA, glmBoost e SVM — foram usados para gerar 113 combinações demodelos, 26. Uma validação cruzada dez vezes foi aplicada dentro da coorte de treinamento. Em cada dobra, o treinamento do modelo, a seleção de características e a estimativa de desempenho foram realizados usando a mesma lógica de particionamento de treinamento/teste para evitar vazamento de informações. O desempenho do modelo foi avaliado principalmente pela área sob a curva característica operacional do receptor (AUC). O modelo ideal foi definido como o modelo com a maior média de AUC nos conjuntos de dados de treinamento e validação, em vez do AUC de maior treinamento isoladamente. Modelos que apresentavam AUC de treinamento muito alto, mas desempenho de validação externa ruim, não eram mantidos. Curvas ROC foram geradas para cada modelo retido, e um nomograma foi construído a partir dos biomarcadores finais selecionados. Uma etapa bem-sucedida de modelagem foi definida pelo desempenho estável de validação cruzada e pela preservação da capacidade discriminativa nos conjuntos de dados externos.

Desempenho da expressão gênica do GSVA e do núcleo de perfil

Foi realizada a Análise de Variação do Conjunto de Genes (GSVA) para comparar o enriquecimento de vias entre grupos de alta e baixa expressão definidos pelo valor mediano de expressão de cada gene central. O P ajustado < 0,05 foi usado como corte para diferenças significativas de caminho. Caminhos que não atingiram esse limite foram excluídos da interpretação. Mapas de calor e gráficos de correlação foram gerados para ilustrar a atividade das vias e os padrões de coexpressão. O sucesso intermediário dessa etapa foi indicado por perfis de enriquecimento consistentes com desregulação inflamatória, imunológico ou metabólica relevante para a.

Análise do cenário imunológico e construção da rede de ceRNA

A composição das células imunes foi estimada usando um algoritmo de deconvolução com 1.000 permutações. Amostras que não cumpriram o critério interno de significância da deconvolução foram excluídas da análise subsequente de correlação imunológica. Para complementar essa análise, a análise de enriquecimento de conjuntos gênicos de amostra única (ssGSEA) também foi usada para avaliar padrões de infiltração imunológica. As correlações entre frações das células imunes e a expressão gênica central foram então calculadas e visualizadas. Para a construção de rede de ceRNA, miRNAs direcionados aos mRNAs centrais foram identificados a partir de bancos de dados de interação públicos disponíveis, e lncRNAs candidatos interagindo com esses miRNAs foram posteriormente avaliados. Apenas interações suportadas por registros de previsão ou anotação do banco de dados foram mantidas. A rede reguladora mRNA-miRNA-lncRNA foi visualizada em uma plataforma de análise de rede. O resultado esperado dessa etapa era uma rede estruturada de ceRNA com reguladores a montante biologicamente plausíveis ligados aos genes centrais.

Desempenho da análise de célula única

O conjunto de dados de célula única GSE214695 foi importado para R e convertido em objetos de célula única usando um fluxo de trabalho padrão de análise de célula única. O controle de qualidade foi realizado filtrando células de acordo com métricas padrão, incluindo células de baixa característica, potenciais gotículas vazias e células com baixa qualidade de transcrito. As células que passaram pelo controle de qualidade foram normalizadas, e os 2.000 genes altamente variáveis foram selecionados para análise de componentes principais. Os principais componentes que contribuíram com variância biológica significativa foram mantidos para agrupamento não supervisionado, e a UMAP foi usada para visualização bidimensional. Genes marcadores de cluster foram identificados por meio de análise de expressão diferencial entre clusters. A anotação por tipo de célula era então realizada por classificação baseada em referência, e as anotações eram cruzadas com a expressão canônica dos marcadores sempre que possível. Um passo bem-sucedido de célula única foi definido pela separação clara das principais populações celulares no gráfico UMAP, genes marcadores interpretáveis para cadagrupo 27 e anotação consistente dos principais tipos celulares imunes e estromais relevantes para a.

Desempenho da análise de randomização mendeliana

Foi realizada randomização mendeliana (RM) em duas amostras para avaliar possíveis relações causais entre a expressão gênica central e a suscetibilidade à. Variáveis instrumentais foram extraídas de conjuntos de dados quantitativos de locus de traços de expressão, e estatísticas resumidas de estudos de associação genomica em toda a UC foram usadas como conjunto de dados de desfecho. Os SNPs foram avaliados de acordo com critérios padrão de controle de qualidade da RM, incluindo relevância para a característica de exposição e remoção de variantes ambíguas ou duplicadas quando exigidas pela harmonização. O método ponderado pela inversa da variância foi usado como estimador causal primário. O teste Q de Cochran foi aplicado para avaliar a heterogeneidade. Análises MR-Egger e MR-PRESSO foram usadas como análises de sensibilidade para avaliar e, quando necessário, corrigir a pleiotropia horizontal. Um passo bem-sucedido da RM foi definido por harmonização válida do instrumento, ausência de heterogeneidade ou pleiotropiamaior 28, e estimativas direcionalmente consistentes entre métodos complementares de RM.

Desempenho do acoplamento molecular de compostos candidatos

Estruturas tridimensionais de proteínas alvo foram obtidas do Banco de Dados de Proteínas, e estruturas de ligantes foram obtidas de um banco de dados público de pequenas moléculas. Antes do acoplamento, proteínas e ligantes eram pré-processados removendo moléculas de água quando apropriado, adicionando hidrogênios, definindo tipos de átomos e convertendo os formatos de arquivo necessários para o acoplamento. O acoplamento foi então realizado usando um fluxo de trabalho de acoplamento molecular, e as energias de ligação foram calculadas para cada par ligante-alvo. Afinidades de ligação menores que -5 kcal/mol foram interpretadas como ligação favorável, enquanto valores menores que -7 kcal/mol foram interpretados como ligação relativamente forte. Mapas de calor de acoplamento foram traçados para comparar padrões globais de ligação entre alvos. As conformações de melhor classificação foram visualizadas em três dimensões para inspecionar ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e proximidade de resíduos. A conclusão bem-sucedida dessa etapa foi definida por arquivos de saída estáveis de acoplamento, poses plausíveis de ligantes dentro da região de ligação alvo e energias de ligação consistentes com a priorização candidata.

Desempenho da validação experimental in vivo

Preparação para GQD

O GQD foi preparado a partir de quatro ervas medicinais tradicionais chinesas nas seguintes proporções de medicamentos brutos: 24 g de Puerariae Lobatae Radix (Gegen), 9 g de Scutellariae Radix (Huangqin), 9 g de Coptidis Rhizoma (Huanglian) e 6 g de Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (Gancao). Detalhes dos materiais botânicos e suas fontes são fornecidos na Tabela de Materiais. As ervas foram moídas até virar pó fino, bem misturadas e deixadas de molho em 390 mL de água destilada por 1 hora. A mistura foi decoctada duas vezes. Na primeira decocção, as ervas foram fervidas em fogo alto e depois cozidas em fogo baixo por 30 minutos. Após a filtração através de gaze, os resíduos eram re-encuwidos com um volume dez vezes maior de água. Os dois filtrados foram combinados e concentrados em banho-maria até atingir a concentração final de droga bruta de 5 g/mL. O extrato era então filtrado, resfriado e armazenado a 4 °C até o uso.

Estabelecimento do modelo de camundongos UC induzido pelo DSS

Dezoito camundongos BALB/c machos (com 8 semanas) foram usados neste estudo, e todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Aprovação nº 2022-126). Detalhes da origem animal são fornecidos na Tabela de Materiais. Os camundongos foram alojados sob condições específicas livres de patógenos a 20–22 °C e 55% de umidade em um ciclo de 12 horas de luz/escuro. Após um período de aclimatação de 1 semana, os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos (n = 6 por grupo): NC, UC e GQD. O grupo NC recebeu água potável estéril durante todo o experimento, enquanto os grupos UC e GQD receberam 1,5% (p/v) de dextrano sulfato de sódio (MW 36-50 kDa) em água potável por 5 dias consecutivos, seguidos por 2 dias de água regular. Esse ciclo foi repetido três vezes para estabelecer colite crônica. Durante o período de intervenção, os grupos NC e foram manipulados duas vezes ao dia com 200 μL de carboximeticelulose de sódio 0,5%, enquanto o grupo GQD recebeu GQD por gavage oral duas vezes ao dia.

A prescrição clínica de GQD consistia em 24 g de Gegen, 9 g de Huangqin, 9 g de Huanglien e 6 g de Gancao, correspondendo a uma quantidade total de 48 g de medicamento bruto por dia para adultos. Assumindo um peso corporal adulto padrão de 60 kg, a dose equivalente para adultos era de 0,8 g/kg/dia. Com base no coeficiente convencional de conversão de humano para rato de 1:12, a dose correspondente para camundongos era de 9,6 g/kg/dia. De acordo com a razão pré-definida de baixa, média e alta dose de 1:2:4, as doses calculadas foram 9,6, 19,2 e 38,4 g/kg/dia, respectivamente. Considerando a gravidade e persistência da inflamação do cólon no modelo repetido de colite induzida pelo DSS, o regime de alta dose foi selecionado para garantir uma intervenção farmacológica adequada durante a validação in vivo. Para apoiar exposição farmacológica suficiente durante a fase inflamatória ativa, a dose diária total de 38,4 g/kg/dia foi dividida em duas administrações iguais. Durante todo o experimento, o peso corporal, a consistência das fezes e o sangramento retal foram monitorados diariamente. Ao final do protocolo, os camundongos foram eutanasiados e tecidos do cólon foram coletados para análises subsequentes.

Avaliação do peso corporal e do índice de atividade da doença

O peso corporal foi registrado diariamente e expresso como a porcentagem do peso corporal inicial no Dia 0. A gravidade da doença foi avaliada usando o índice de atividade da doença (DAI), que incluiu três parâmetros: perda de peso corporal, consistência das fezes e sangramento retal. Cada parâmetro foi pontuado independentemente em uma escala de 0 a 4 de acordo com a gravidade das manifestações clínicas, com escores mais altos indicando atividade da doença mais grave. O DAI final foi calculado como a média das três pontuações individuais, resultando em uma pontuação total variando de 0 a 4. Resumidamente, uma pontuação de 0 indicou ausência de anormalidade, enquanto as pontuações de 1 a 4 refletiram perda de peso progressivamente maior, consistência mais frouxa e sangramento retal mais severo. Os critérios detalhados de pontuação são apresentados na Tabela 1.

Desempenho da coloração H&E e cálculo do índice histológico de atividade

Para avaliação histológica, os tecidos do cólon foram fixados em 4% de paraformaldeído, desidratados por etanol graduado, embutidos em parafina e seccionados com espessura de 4 μm. As seções foram desparafinizadas, reidratadas, coradas com hematoxilina, contra-coloridas com eosina, desidratadas, limpas e montadas. Imagens histológicas foram observadas usando um microscópio de campo claro e escaneadas com um sistema de varredura de lâminas. Informações específicas sobre equipamentos estão listadas na Tabela de Materiais. A lesão histopatológica foi avaliada com base em três parâmetros, incluindo depleção das células do cálcer, dano arquitetônico da cripta e infiltração de células inflamatórias. Cada parâmetro foi pontuado de acordo com o grau de lesão tecidular, e a soma dos escores dos três parâmetros foi definida como o índice histológico de atividade (HAI), variando de 0 a 10, conforme resumido na Tabela 2. Para a quantificação da célula goblet, cinco campos não sobrepostos selecionados aleatoriamente por seção foram analisados com ampliação de 400×. O número de células goblet por campo foi contado manualmente de forma cega, e a contagem média por campo foi calculada para cada seção colônica representativa.

Desempenho da coloração imuno-histoquímica

Após a desparafinização e reidratação, as seções do tecido passaram por coleta de antígeno com 0,1% de tripsina a 37 °C por 30 minutos, seguida de incubação com peróxido de hidrogênio a 3% para bloquear a atividade endógena da peroxidase. As seções foram então incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários de coelho contra STAT3 (1:200, HUABIO, ET1605-45), TIMP1 (1:1000, Proteintech, 26847-1-AP), SPHK2 (1:500, Proteintech, 17096-1-AP) e HSPA5 (1:1000, Cell Signaling Technology, #3177), diluídos em 1% de BSA. Detalhes dos anticorpos e suas fontes são fornecidos na Tabela de Materiais. Após a lavagem com PBS, as seções foram incubadas com o correspondente anticorpo secundário (1:2000) em temperatura ambiente por 1,5 h. A imunorreatividade foi visualizada usando um reagente de detecção cromogênica, e núcleos foram contra-coloridos com hematoxilina. A análise quantitativa de imagens foi realizada usando softwares de análise de imagem listados na Tabela de Materiais.

Desempenho da análise qRT-PCR

O RNA total foi extraído usando um reagente de extração de RNA à base de fenol e transcrito reversamente usando um kit de síntese de cDNA de primeira fita. A transcrição reversa foi realizada a 25 °C por 10 minutos, 55 °C por 15 minutos e 85 °C por 5 minutos. Posteriormente, foi realizada uma qRT-PCR usando um sistema de PCR em tempo real e uma mistura SYBR Green qPCR. As condições de amplificação foram as seguintes: desnaturação inicial a 95 °C por 60 s, seguida por 40 ciclos a 95 °C por 15 s, 60 °C por 15 s e 72 °C por 45 s. As sequências de primers foram projetadas usando software de design de primers e estão listadas na Tabela 3. O GAPDH foi usado como referência interna, e os níveis relativos de expressão de mRNA foram calculados usando o método 2^-ΔΔCt . Cada amostra foi analisada em triplicado, e cada experimento foi repetido pelo menos três vezes. Detalhes dos reagentes, instrumentos e softwares são fornecidos na Tabela de Materiais.

Desempenho da análise do western blot

Os tecidos do cólon foram homogeneizados em tampão de lise contendo inibidor de protease sobre gelo e lisados completamente por 2 horas. As concentrações de proteína foram determinadas usando um kit de ensaio proteico. Quantidades iguais de proteína foram misturadas com tampão de carga, desnaturadas antes da eletroforese, separadas por 10% de SDS-PAGE e transferidas para as membranas da PVDF a 100 V por 1 hora. Após o bloqueio com leite desnatado a 5% por 1 hora em temperatura ambiente, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários de coelho contra STAT3 (1:200, HUABIO, ET1605-45), TIMP1 (1:1000, Proteintech, 26847-1-AP), SPHK2 (1:500, Proteintech, 17096-1-AP), HSPA5 (1:1000, Cell Signaling Technology, #3177) e GAPDH na diluição de trabalho correspondente. Após lavagem com TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20; pH 7,4), as membranas foram incubadas com o correspondente anticorpo secundário (1:5000) em temperatura ambiente por 1 hora. As bandas proteicas foram visualizadas usando um reagente de detecção quimioluminescente. As intensidades das bandas foram analisadas usando software de análise de imagem, e os níveis de expressão das proteínas alvo foram normalizados para GAPDH. Os pesos moleculares esperados das proteínas detectadas foram aproximadamente 88 kDa para STAT3, 21 kDa para TIMP1, 28 kDa para SPHK2, 70 kDa para HSPA5 e 36 kDa para GAPDH. Detalhes dos anticorpos, membranas, reagentes e softwares são fornecidos na Tabela de Materiais. Nomes específicos de produtos, fabricantes, números de catálogo, modelos de instrumentos e detalhes de software são fornecidos na Tabela de Materiais, enquanto descrições genéricas são usadas no texto principal para melhorar a neutralidade e aplicabilidade geral.

Desempenho da análise estatística

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Os testes estatísticos foram realizados usando software estatístico. ANOVA unidirecional seguido pelo teste post hoc de Tukey foi usado para comparações multigrupos. Um valor P ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

Aquisição de conjuntos de dados GEO e identificação de genes relacionados à UC

Para investigar mudanças na expressão gênica na, dois conjuntos de dados transcriptômicos — GSE87466 e GSE92415 — foram obtidos do banco de dados GEO usando "colite ulcerativa" como termo de busca, com critérios de seleção incluindo tipo de conjunto de dados, anotação clara de doença/controle e tamanho suficiente da amostra. Esses conjuntos de dados abrangeram 140 c...

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Discussão

A colite ulcerativa () é uma condição inflamatória crônica e idiopática do intestino que afeta principalmente a mucosa do cólon, caracterizada por inflamação persistente ou episódica. A doença diminui significativamente a qualidade de vida do paciente e aumenta o risco de desenvolver carcinoma colorretal. Embora sua prevalência global esteja aumentando de forma constante, a etiologia precisa e os mecanismos subjacentes permanecem apenas parcialmente compreendidos. As opções de tratamento...

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Divulgações

Os autores afirmam que não possuem interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

Os autores também agradecem ao banco de dados GEO pelo acesso aberto aos dados e aos revisores por seus comentários construtivos.

FINANCIAMENTO: Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81973684, 82174358), Fundação de Ciências Naturais da Província de Sichuan (2023NSFSC1760, 2025ZNSFSC1834), Projeto Especial de Pesquisa em Medicina Tradicional Chinesa da Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan (2023MS365, 2020JC0094) e Fundo Conjunto de Inovação da Comissão de Saúde de Chengdu e da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (WXLH202402019, WXLH202403012, WXLH202501238, WXLH202501201).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Puerariae Lobatae RadixMedicina Tradicional Chinesa de Sichuan Neautus Co., Ltd.NTC-001Material herbal para preparação de GQD
Scutellariae RadixMedicina Tradicional Chinesa de Sichuan Neautus Co., Ltd.NTC-002Material herbal para preparação de GQD
Rizoma de coptidisMedicina Tradicional Chinesa de Sichuan Neautus Co., Ltd.NTC-003Material herbal para preparação de GQD
Glycyrrhizae Radix et RhizomaMedicina Tradicional Chinesa de Sichuan Neautus Co., Ltd.NTC-004Material herbal para preparação de GQD
Camundongos BALB/c, macho, 8 semanas de idadeBeijing HFK Bioscience Co., Ltd.N/AAnimais experimentais
Dextrano sulfato de sódio (DSS), MW 36-50 kDaMP Biomédicos160110Reagente indutor de colite
Carboximetil celulose de sódioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUAC5678Veículo para gavage oral
ParaformaldeídoSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA158127Fixador tecidular
HematoxilinaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUAH9627Mancha nuclear
EosinaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUAE4009Contracoloração para histologia
Microscópio de campo claroNikonEclipse 80iObservação histológica
Sistema de varredura de slides3DHISTECH Ltd.Panoramic 250Aquisição digital de imagem com slides inteiros
TripsinaGibco, Carlsbad, CA, EUA25200-056Reagente de recuperação de antígeno
Peróxido de hidrogênioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUAH1009Bloqueio da atividade endógena da peroxidase
Albumina sérica bovina (BSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUAA7906Diluente de anticorpos / reagente bloqueante
Anticorpo primário anti-STAT3, coelhoTecnologia de Sinalização Celular9139Anticorpo primário para IHC/WB
Anticorpo primário anti-TIMP1, coelhoAbcamab211925Anticorpo primário para IHC/WB
Anticorpo primário anti-SPHK2, coelhoAbcamab187030Anticorpo primário para IHC/WB
Anticorpo primário anti-HSPA5, coelhoTecnologia de Sinalização Celular3177Anticorpo primário para IHC/WB
Anticorpo primário anti-GAPDH, coelhoAbcamab9485Controle de carregamento para WB
Anticorpo secundário anti-coelho de bodeYeasen Biotechnology33201Anticorpo secundário para IHC/WB
Reagente de detecção cromogênicaBeyotime Biotechnology [Shanghai] Co., Ltd., Xangai, ChinaP0202Desenvolvimento de sinais para imunohistoquímica
Software de análise de imagensCibernética MidiáticaImage-Pro Plus 7.0Quantificação da coloração e intensidade da faixa
Reagente de extração de RNA à base de fenolInvitrogenReagente Trizol, 15596026Extração total de RNA
Kit de síntese de cDNA de primeira fitaBeyotime BiotecnologiaDRR047ATranscrição reversa
Sistema de PCR em tempo realBiossistemas AplicadosABI Prism 7300Amplificação quantitativa por PCR
SYBR Mistura verde qPCRBeyotime BiotecnologiaDRR420AReagente de detecção qPCR
Software de design de primerPremier Biosoft International, Palo Alto, CA, EUAPrimer 5.0Design do primer
Buffer de lise RIPABeyotime BiotecnologiaP0013BReagente de extração proteica
Inibidor de protease (PMSF)Beyotime BiotecnologiaST506Proteção proteica durante a lise
Kit de ensaio proteico BCABeyotime BiotecnologiaP0010Quantificação de proteínas
Membrana PVDFMerck MilliporeIPVH00010Membrana de transferência de proteínas
Reagente/sistema de detecção quimioluminescenteThermo Fisher Scientific32106Detecção de sinal para western blot
Software estatísticoIBMSPSS 23.0Análise estatística

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